HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse zu HAC vom nationalen Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research (finanziert. Rose Hügel und Hal Gaba awards), die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft Auswirkungen vergibt aus dem Jonsson Comprehensive Cancer Center an WEL und HAC. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.

Alle beschriebenen Experimente stimmten die Animal Care Committee an der University of California, Los Angeles.
1. erzeugen Sie Dias von gefrorenen Maus Haut
<ol><li>Mäuse im Einklang mit Institution Politik einschläfern. Hinweis: Führen Sie institutionelle Politik für Schutzkleidung. Alle Protokolle, bei denen Tiere müssen durch die institutionelle Animal Care Committee genehmigt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus Haare mit einem Tier Haarschneider.</li>
	<li>Stellen Sie Einschnitte in der Haut mit einer Schere. Mit Pinzette, heben Sie die Haut von der Maus. Mit Schere, Abschnitt Haut wegschneiden.</li>
	<li>Füllen Sie die Cryomold mit dem Reagenz zusammengesetzte Einfrieren (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Ort Hautpartien in gefüllten Cryomolds mit Nadelzange Pinzette. Haut zu orientieren, so dass Gewebe Scheiben werden einen Querschnitt durch die Haut aus der Epidermis, Lederhaut, Unterhaut und Muskulatur (Abbildung 2) zu generieren. Hinweis: Wenn möglich, montieren Sie experimentell zu und Steuern Sie Mäuse zusammen in der gleichen Cryomold, so dass sie auf derselben Folie geschnitten und zusammen verarbeitet werden können. Achten Sie darauf, keine um Luftblasen zu erstellen.</li>
	<li>Legen Sie Cryomold auf die flache Oberfläche aus einem Block von Trockeneis in einem Eiskübel und Einfrieren zu lassen. Weiterhin die Ausrichtung der Haut zu beobachten. Passen Sie bei Bedarf. Hinweis: Kryogene Handschuhe beim Umgang mit Trockeneis.</li>
	<li>Cryomolds in einem-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung zu übertragen. Proben können in den Gefrierschrank für ca. 3 Monate ohne erheblichen Verlust der Enzymaktivität gepflegt werden. Lassen Sie sich nicht Gefrierschnitte austrocknen.</li>
	<li>Verwenden einen Kryostaten bei-20 ° C, Stück Gewebe Abschnitte 7 bis 10 µm Dicke für die beste Haut Morphologie21erstellen.</li>
</ol>2. Vorbereitung Folien zum Beizen
<ol><li>Den Satz von Folien zu prüfenden zu etablieren. Gehören ein Steuerschieber auf dem NAD einbehalten und schieben Sie ein anderes Steuerelement auf dem Substrat, Laktat, einbehalten. Gehören Sie einer Positivkontrolle Folie aus einem gefrorenen Gewebe vorher untersucht.</li>
	<li>Kurz fix Folien mit Hautpartien mit 4 % Formalin für 5 min entweder durch pipettieren 1 mL 4 % Formalin auf der Folie oder, wenn mehrere Folien Verarbeitung durch Eintauchen in ein Behälter, 4 % Formalin schiebt. Hinweis: Die Fixierung wird sichergestellt, dass die Haut nicht von den Folien während der folgenden Verfahren und bewahren die Haut Morphologie abziehen. Achtung: Formalin ist ein Karzinogen und gefährlich; tragen Sie Handschuhe, lassen Sie es Ihre Haut berühren und führen Sie diesen Schritt in einem chemischen Abzug nicht.</li>
	<li>Waschen Folien mit mindestens 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, pro Folie entweder durch pipettieren oder eintauchen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Färbelösung
<ol><li>Wirbel zusammen Reagenzien für Laktat-Dehydrogenase Aktivität Färbung (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazinderivat Methosulfate (PMS), 600 µM Nitrotetrazolium blaue Chlorid und 30 mM Laktat) in einem entsprechend großen Rohr abhängig von der Menge der Färbung Lösung benötigt. Hinweis: 1 mL ist ausreichend um eine Folie vollständig zu bedecken.</li>
	<li>Bereiten Sie eine zweite Lösung, in der alle Reagenzien außer NAD vorhanden sind. Bereiten Sie eine dritte Lösung, in der alle Reagenzien außer Laktat vorhanden sind.</li>
</ol>(4) inkubieren Sie Folien in Färbelösung
<ol><li>Sanft die Färbelösung pipettieren oder Control-Lösungen auf die vorbereiteten Folien, die im Abschnitt in seiner Gesamtheit (1 mL ist ausreichend für eine Folie). Wenn mehrere Folien zusammen verarbeitet werden, Tauchen alle Folien in der Färbelösung gleichzeitig (stellen Sie sicher, der Container hat genug Lösung Abschnitt Gewebe vollständig bedecken).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folien in eine feuchte Umgebung bei 37 ° C im Dunkeln. Wenn Färbelösung oben auf der Folie ist, legen Sie die Folie in eine feuchte Umgebung, um Verdunstung zu verhindern.</li>
</ol>5. Monitor Folien
<ol><li>Die Umwandlung von der Färbelösung von klar bis blau durch Sichtkontrolle zu überwachen. Wenn die Proben das gewünschte Maß an Bläue erreicht haben, stoppen Sie die Reaktion durch das Entfernen der Färbelösung. Hinweis: Für die Haut ist 10 Minuten ausreichend. Die Zeit hängt von der Orgel und die enzymatische Aktivität.</li>
	<li>Spülen Sie Folien mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung durch pipettieren (1 mL ist ausreichend für jede Folie) oder Tauchen. Hinweis: Alle Beispiele, die mit einander verglichen werden in Färbelösung für die gleiche Menge an Zeit einzuhalten.</li>
</ol>6. gegenfärbung und montieren
<ol><li>Pipettieren eine gegenfärbung auf den Objektträger, wenn die Folien ein angemessenes Maß an Bläue erreicht haben. Hinweis: Counterstains, die die Kerne rot oder Grün verwandeln bieten guten Kontrast mit dem Blau durch die Formazan Fällungsmittel erstellt.</li>
	<li>Mit wässrigen und nichtwässrigen Montage mittlerer22montieren. Ein bis drei Tropfen (40-50 µL) Eindeckmedium reicht je nach Größe des Deckglases.</li>
</ol>7. Bild Folien und quantifizieren
<ol><li>Bildfolien unter einem Lichtmikroskop. Nehmen Sie Fotos von experimentellen und Kontrollproben und alle negativen Kontrollen an 10 X, 20 X und 40 X Vergrößerung.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Intensität der Bläue in verschiedenen Regionen mit Bildanalyse-Software.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, zur Überwachung der Tätigkeit des Laktat-Dehydrogenase oder andere metabolische Enzyme, die NADH oder NADPH, in verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes oder verschiedene Teile eines Gewebes im Laufe der Zeit zu generieren. Laktat-Dehydrogenase ist ein wichtiges Enzym für das Verständnis der Biologie der Stammzellen und Tumoren, und die Fähigkeit, Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in einzelnen Zellen überwachen wird voraussichtlich wichtige Einblicke in die Funktion dieses Enzyms.
Ein wichtiger Vorteil dieses Protokolls im Vergleich mit anderen Methoden ist, dass die Fähigkeit, Monitor enzymatische Aktivität, anstatt nur Protein Fülle, kann dazu führen, dass mehr aussagekräftige Informationen über nicht nur wo Laktat-Dehydrogenase Enzyme sind vorhanden, aber wo sind sie tatsächlich funktionsfähig. Der hier beschriebene Ansatz kann mit Immunohistochemistry kombiniert werden, so dass das Niveau eines ausgewählten Proteins, zum Beispiel eine Zelle Abstammung Marker, in der gleichen Gewebeproben als Laktat-Dehydrogenase-Aktivität bestimmt wird. Im Vergleich mit MRT-basierte Ansätze für die Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hat das Protokoll zur Verfügung gestellt den Vorteil, dass es höhere räumliche Auflösung liefern und helfen, um die entsprechenden Zellen innerhalb eines Gewebes zu bestimmen, die hohen enzymatischen Aktivität haben können . Im Vergleich zu Ansätze zur Zuordnung Stoffwechsel basierend auf Fluorogenic Substrate ist Erkennung Signal mit dem beschriebenen Protokoll nicht durch Autofluoreszenz1beschränkt. Miller und Co-Autoren durchgeführt eine ähnliche Analyse der Zeitabhängigkeit und Substrat Abhängigkeit von fünf verschiedenen Enzymen durch Umstellung auf Formazan7Überwachung. Die Reaktionen wurden entdeckt, stöchiometrische Prinzipien der Enzym-Kinetik zu folgen. Miller und Co-Autoren unterschieden mitochondrialen Enzyme nicht mitochondrialen Enzyme durch Co Lokalisierung mit mitochondrialen Färbung7. Sie verwendet als Erkennung Reagens gefolgt von konfokalen Mikroskopie für subzelluläre Lokalisation Co Analyse75-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium Chlorid (CTC).
Die beschriebene Methode hat auch Nachteile. Während MRT-basierte Ansätze in lebenden Organismen verwendet werden können, erfordert die beschriebene Ansatz gefrorenen oder frischen Gewebe. Gefrorene Gewebe eignen sich nur für ein paar Monate, da die Aktivität der Enzyme zersetzen im Laufe der Zeit wenn auch eingefroren. Da das Substrat im Überschuss bereitgestellt wird, bietet der Ansatz weiter, Informationen auf "Aktivität Potenzial" vorausgesetzt, dass Substrat vorhanden ist. Wenn die Ebenen des Substrates begrenzt sind, kann der Aktivitätsverteilung mit dieser Assay beobachtet aus der Menge an Aktivität abweichen, die physiologisch auftritt. Darüber hinaus gibt es verschiedene Isoformen des gleichen Enzyms, die die gleichen enzymatische Aktivität ausführen, ist die hier vorgestellte Methode nicht in der Lage, zwischen ihnen zu unterscheiden. Beispielsweise kann nicht die vorgestellte Methode unterscheiden, die Aktivität der LDHA im Vergleich zu LDHB. Ein Ansatz zur Adresse dieses Problem wäre um gentechnisch engineered Mäuse, in denen ein einziges Enzym-Isoform genetisch inaktiviert ist.
Wir haben experimentiert mit PMS, photochemisch stabilen Elektron Träger, der Elektronentransfer zwischen NADH und tetrazoliumsalz vermittelt Farbstoffe23. Während einige Wissenschaftler berichtet haben, dass das PMS Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität hemmt und PMS nicht hilfreich5gefunden, fanden wir das PMS zu wertvoll für die Enzym-Lokalisierung und in unserem Protokoll aufzunehmen. Einige andere Autoren berichteten mit Polyvinylalkohol, um Diffusion von Glukose-6-phosphat Dehydrogenase Enzym1zu begrenzen. In unseren Experimenten wir fanden nicht die Polyvinylalkohol, hilfsbereit zu sein und beseitigt.
Ein paar Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Färbung. Ein wichtiges Thema ist sicherzustellen, dass die Gewebeproben in der Cyromolds richtig platziert sind. Hautpartien sollten festgelegt werden, flach, so dass Scheiben über die Haut geschnitten. Darüber hinaus Wenn mehrere Abschnitte sind, vorbereitet zu sein, ist es ideal, wenn sie innerhalb der gleichen Cryomold eingebettet sind, so dass sie zusammen auf derselben Folie geschnitten werden können. Dies wird helfen, um Variation aufgrund der Dicke der Folie zu beseitigen, die mit der Kryostat geschnitten ist. Es ist auch wichtig, damit das Gewebe enzymatische Aktivität bewahrt.
Die beste Zeit, um die Reaktion zu beenden sollte empirisch ermittelt werden. Es ist notwendig, die Folien während der Inkubationszeit überwachen und bestimmen Sie die geeignete Zeit hinzufügen gegenfärbung und montieren Sie die Folien anhand der Intensität von den blauen Fleck. Wenn Sie die Proben zu leicht gefärbt sind, wird es nicht möglich festzustellen, wo die Tätigkeit ist. Wenn die Proben overstained sind, kann der Formazan Niederschlag verteilt, macht es schwierig, bestimmte Bereiche zu ermitteln, die ursprünglich hohe Aktivität waren.
Wir erwarten, dass dieses Protokoll Wissenschaftler mit einer breiten Palette von Fragen über die Rolle des Stoffwechsels nützlich sein werden. Anwendungen umfassen Co Färbung für metabolische Aktivität und Zelle Abstammung Marker oder Proliferationsmarker, bewertet die Beiträge verschiedener Enzyme mit genetischen Modellen, Bewertung subzelluläre Lokalisation der Enzymaktivität, Überwachung enzymatische Aktivität in erkranktes Gewebe oder während der Entwicklung.

Die Standorte in den Geweben, in denen Enzyme hohe oder Niedrige Aktivität haben, zu verstehen ist wichtig für Verständnis Entwicklung und Physiologie. Abschrift oder Protein Ebenen dienen oft als Surrogate für enzymatische Aktivität. Während solche Studien informativ sein können, bieten sie keine Informationen, die entscheidend für die Bestimmung einer Enzym-Aktivität, wie Post-translationalen Modifikationen, die Anwesenheit von Protein-komplexe oder das Enzym subzelluläre Lokalisation sein können. Wenn die enzymatische Aktivität direkt gemessen wird, wird es oft in homogenisierte Protein Lysates überwacht, die nicht mehr Informationen über einzelne Zellen innerhalb der Mischung oder die räumliche Verteilung der Zellen mit hoher oder niedriger Aktivität innerhalb eines Gewebes enthalten.
Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatischen Aktivität innerhalb einer Gewebeprobe. Die Methodik basiert auf früheren Studien, die zeigen, dass tetrazoliumsalz Salze verwendet werden können, um die Aktivität der Dehydrogenases, Reduktasen und oxidasen in tiefgefrorenem Gewebe1zu lokalisieren. Mit diesen Methoden wird ein wasserunlösliches Formazan gebildet, wenn eine Tetrazolium Salz2,3Protonen übertragen werden. Glukose-6-phosphat Dehydrogenase NADPH und ein Proton generiert und mit tetrazoliumsalz Aktivität erkannt wurde. Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase ist in Flunder Hepatozyten4, im alveolären Typ-2-Zellen der Lunge5 und Nephrone der Niere5überwacht worden. Tetrazoliumsalz Salze wurden auch zur Transketolase-Aktivität in tiefgefrorenem Gewebe6zu überwachen. Ein ähnlicher Ansatz wurde kürzlich verwendet, um die Aktivität von mehreren Dehydrogenases im gleichen Gewebe auf angrenzenden Folien7überwachen.
Wir beschreiben hier eine Methode um tetrazoliumsalz Salze verwenden, um die räumliche Verteilung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität (Abbildung 1) zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase wandelt Pyruvat durch Glykolyse, Laktat und die umgekehrte Reaktion erzeugt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist daher eine wichtige Determinante der Pyruvat Eingang in der Tricarboxylic Säure Zyklus gegen seine Sekretion wie Laktat. Laktat-Spiegel im Blut werden oft zur diagnose einer Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs8,9,10, denn es signalisieren kann, dass Krankheit oder Verletzung Zellen beschädigte hat und das Enzym freigegeben wurde.
Es gibt vier Laktat-Dehydrogenase Gene: LDHA, LDHB, LDHC und LDHD11. LDHA und LDHB werden gedacht, um aus der Duplizierung von einer frühen LDHA Gen12entstanden sind. LDH ist als ein Tetramer aktiv und LDHA und LDHB bilden Homotetramers und Heterotetramers mit einander. LDHA wird berichtet, haben höheren Affinität für Pyruvat, während LDHB haben höheren Affinität für Laktat und bevorzugt Laktat in Pyruvat13konvertieren berichtet wird. Der Projektträger LDHA enthält verbindliche Aufstellungsorte für die HIF1α, cMYC FOXM1 Transkription Faktoren11. Darüber hinaus kann wie viele andere glykolytischen Enzyme14,15, LDH durch Post-translationalen Modifikationen verändert werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 phosphorylieren kann LDHA Y10, das Tetramer Bildung fördert, oder Y83, die NADH Substrat Bindung16fördert. LDHA kann auch schimmelpilzschäden17. Aus diesen Gründen erfordert ein umfassendes Verständnis der LDH-Aktivität nicht nur LDH-Protein-Ebene, sondern auch die Enzym-Aktivität sowie Überwachung.
Neben der Methode, die wir hier präsentieren, wurden andere Ansätze zur Laktat-Dehydrogenase-Aktivität zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität kann spektralphotometrisch lysate homogenisierte Protein überwacht werden. Die Erzeugung von NADH wie Laktat in Pyruvat umgewandelt gemessen werden basierend auf Absorption bei 340 nm, während das Verschwinden von NADH überwacht werden kann, wie Pyruvat in Laktat18umgewandelt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist auch mit Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) überwacht worden. 13 C-Pyruvat kann verabreicht werden, und die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat kann überwacht werden, als das Verhältnis von [1 -13C] Laktat / [1 -13C] Pyruvat. Erhöhte Verhältnisse von [1 -13C] Laktat / [1 -13C] Pyruvat in Krebs Gewebe19eingehalten worden. Während MRT-basierte Ansätze über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in Normal und Krankheit Gewebe informieren können, haben die Methoden nicht die Auflösung benötigt, um die Aktivität in bestimmten Zellen zu bestimmen. Die Methodik, die hier zur Verfügung gestellten kann Informationen über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Bereichen Gewebe und sogar in einzelnen Zellen.
Verwendung von in Situ Aktivität Assays, fanden wir, dass die Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den Haarfollikel Stammzellen der Maus Haut20ist. Wir nutzten auch die Methode zu überwachen die Aktivitäten der Laktat-Dehydrogenase in kultivierten Stammzellen und fand, dass die Aktivität in den Stammzellen über die Feeder-Schicht liegt. Schließlich überwacht die Tätigkeit der Laktat-Dehydrogenase in frischen Maus Aorta und Färbung in glatten Muskelzellen beobachtet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in gefrorenen Maus Haut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Mapping enzymatische Aktivität in Raum und Zeit ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Zelle Verhalten im normalgewebe und Krankheit. In Situ Stoffwechselaktivität Tests liefern Informationen über die räumliche Verteilung der metabolischen Aktivität innerhalb eines Gewebes. Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Aktivität des Enzyms Lactat Dehydrogenase direkt in Gewebeproben. Laktat-Dehydrogenase ist eine wichtige Determinante für ob konsumierten Glukose in Energie durch aerobe oder anaerobe Glykolyse umgewandelt wird. Eine Lösung mit Laktat und NAD ist ein gefrorenes Gewebe Abschnitt zur Verfügung gestellt. Zellen mit hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität konvertiert die bereitgestellten Laktat in Pyruvat, während gleichzeitig konvertieren, vorausgesetzt, Nicotinamid-adenin-Dinucleotide (NAD), NADH und ein Proton, die erkannt werden können auf die Reduzierung der Basis Nitrotetrazolium blau, Formazan, die als ein blauer Niederschlag visualisiert wird. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in der Maus Haut. Die Anwendung dieses Protokolls, fanden wir, dass Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den ruhenden Haarfollikel Stammzellen in der Haut ist. Umsetzung des Protokolls zu embryonalen Stammzellen gezüchteten Maus zeigte höhere Färbung in kultivierten Stammzellen als Maus embryonalen Fibroblasten. Analyse der frisch isolierte Maus Aorta ergab Färbung in glatten Muskelzellen senkrecht zu der Aorta. Die Methodik zur Verfügung gestellt lässt sich räumlich zugeordnet werden die Aktivität von Enzymen, die ein Proton im gefrorenen oder frischen Gewebe erzeugen.

Wir haben bereits Ergebnisse für in Situ Aktivität Assays in Maus Haut20berichtet. Wie in Abbildung 3dargestellt, haben wir beobachtet, dass hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Haarfollikel Stammzellen an der Basis des Haarfollikels, wenn die Verfahren oben beschrieben befolgt wurden. Diese Ergebnisse wurden durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortierung der Haut für Stammzellen Haarfollikel und bestätigt hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in der Stammzell-Fach mit Aktivität Assays auf sortierten Zellen bestätigt.
Basierend auf unseren Erkenntnissen, dass die Haarfollikel Stammzellen hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität haben, erweitern wir unsere Studien kultivierten embryonaler Stammzellen. Maus embryonale Fibroblasten dient als Zubringer Schicht wurden alleine oder im Beisein von embryonalen Stammzellen analysiert. Kultivierte Zellen zu analysieren, wurde das Medium angesaugt, und die Zellen wurden kurz fixiert und inkubiert mit Laktat-Dehydrogenase Färbelösung wie oben beschrieben. Wir beobachteten hohen Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den embryonalen Stammzellen im Vergleich zu der Maus embryonalen Fibroblasten (Abbildung 4).
Wir haben auch die Färbung Protokoll an frisch isolierte Gewebe angewendet. Maus Hauptschlagadern wurden seziert und offen geschnitten. Die Schiffe wurden geöffnet und immobilisiert damit innen Lumen der Hauptschlagadern zugänglich war. Proben wurden inkubiert, mit Hank es ausgewogen Salzlösung mit 0,5 % Triton-X für 10 min, dann mit dem Laktat-Dehydrogenase Färbelösung für 10 min. Laktat-Dehydrogenase Färbelösung an das frische Gewebe angewendet wurde. Nach der Inkubation wurden Bilder gesammelt, zeigt Färbung in der glatten Muskelzellen (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig1.jpg"> Abbildung 1 : Chemische Aktivität von Laktat-Dehydrogenase und seine Entdeckung. Laktat-Dehydrogenase konvertiert Lactat + NAD in Pyruvat + NADH + H+. Das Proton, das generiert wird verringert Nitroblue tetrazoliumsalz zu Formazan, die einen blauen Niederschlag bilden wird. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig2.jpg"> Abbildung 2 : Schaltplan der Orientierung Maus Haut in Cryomolds. Maus Haut sollte innerhalb von Cryomolds ausgerichtet werden, so dass jede Schnittfläche einen Querschnitt der gesamten Haut aus Oberhaut, Lederhaut, Unterhaut und Muskulatur enthalten wird. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig3.jpg"> Abbildung 3 : Laktat-Dehydrogenase Färbung der Maus Haut zeigt hohen Aktivität im Haarfollikel Stammzellen. Maus Haut war in Cryomolds eingefroren und inkubiert mit Laktat-Dehydrogenase Färbelösung Laktat enthalten. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität war prominent in Stammzellen Haarfollikel. (A, B) Zwei Bilder von Laktat-Dehydrogenase-Aktivität-Assay Maus Haut. (C, D) Zwei Bilder der Kontrolle Färbung mit Substrat Laktat einbehalten. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig4.jpg"> Abbildung 4 : Hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in kultivierten Maus embryonale Stammzellen. Kultivierte Maus embryonale Stammzellen auf eine bestrahlte Maus embryonalen Fibroblasten Feeder Schicht angebaut wurden für Laktat-Dehydrogenase-Aktivität analysiert. Hoher Aktivität wurde in den Stammzellen im Vergleich zu den Fibroblasten beobachtet. Maus embryonale Fibroblasten zeigten ähnliche Färbung mit und ohne Bestrahlung. Bilder wurden mit einem 20 X Objektiv. Maßstabsleiste = 50 µm. (A, B, D, E) Maus embryonalen Fibroblasten und Stammzellen. (C, F) Maus embryonalen Fibroblasten allein. (A-C) Bilder wurden nach 7 Minuten Inkubation mit Färbelösung. (D-F) Bilder wurden nach 20 Minuten Inkubation mit Färbelösung. <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig5.jpg"> Abbildung 5 : Hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den glatten Muskelzellen, die rund um die Maus Aorta. Hauptschlagadern waren von euthanasierten Mäusen isoliert. Schiffe wurden für 2 Minuten in 2 % Paraformaldehyd und 3 x 10 Minuten in 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung gewaschen. Schiffe wurden mit Hank es ausgeglichene Salzlösung mit 0,5 % Triton-X und Phosphat gepufferte Kochsalzlösung gewaschen 3 x 5 Minuten inkubiert. Laktat-Dehydrogenase Färbelösung wurde hinzugefügt und Proben wurden für 10 min bei 37° C inkubiert und 3 x 5 min mit 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung gewaschen. Proben wurden dann für 1 Stunde in 2 % Paraformaldehyd fixiert, 3 x 5 min mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung gewaschen und abgebildet. (A) Laktat-Dehydrogenase Lösung mit Laktat. (B) Laktat-Dehydrogenase Lösung ohne Laktat als Negativkontrolle. Für jeden Bereich gibt es ein niedrigeres Vergrößerung Bild auf der linken Seite und ein bestimmten Bereich wird mit höherer Vergrößerung auf der rechten Seite angezeigt. (A, B) Komplette Laktat-Dehydrogenase Lösung mit Laktat wurde zum Färben verwendet. B ist ein vergrößertes Bild des angegebenen Bereichs im Bild A. (C, D) Laktat-Dehydrogenase Lösung ohne Laktat für Färbung als Negativkontrolle verwendet wurde. D ist ein vergrößertes Bild des angegebenen Bereichs in C. A und C wurden mit 20 X Ziele (Maßstabsleiste = 50 µm) und B und D wurden mit einem 40 X Objektiv (Maßstabsleiste = 20 µm). <a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe

Wir beschreiben ein Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatische Aktivität von Enzymen, die generieren Nicotinatmide Adenin Dinucleotide Phosphat (NAD(P)H) + H + direkt in Gewebeproben.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Aufrufe.  UCLA. Wir beschreiben ein Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatische Aktivität von Enzymen, die generieren Nicotinatmide Adenin Dinucleotide Phosphat (NAD(P)H) + H + direkt in Gewebeproben.

Serie: Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Forschung

Biochemie

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

SUMO-Binding Entities (SUBEs) als Werkzeuge zur Anreicherung, Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung des SUMO-Proteoms bei Leberkrebs

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is going to move beyond the laboratory and become a widespread and standard just in time manufacturing technology, we must understand the performance limits of these systems. Toward this question, we developed a robust protocol to quantify 40 compounds involved in glycolysis, the pentose phosphate pathway, the tricarboxylic acid cycle, energy metabolism and cofactor regeneration in CFPS reactions. The method uses internal standards tagged with 13C-aniline, while compounds in the sample are derivatized with 12C-aniline. The internal standards and sample were mixed and analyzed by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS). The co-elution of compounds eliminated ion suppression, allowing the accurate quantification of metabolite concentrations over 2-3 orders of magnitude where the average correlation coefficient was 0.988. Five of the forty compounds were untagged with aniline, however, they were still detected in the CFPS sample and quantified with a standard curve method. The chromatographic run takes approximately 10 min to complete. Taken together, we developed a fast, robust method to separate and accurately quantify 40 compounds involved in CFPS in a single LC/MS run. The method is a comprehensive and accurate approach to characterize cell-free metabolism, so that ultimately, we can understand and improve the yield, productivity and energy efficiency of cell-free systems.

Here, we present a robust protocol to quantify 40 compounds involved in central carbon and energy metabolism in cell-free protein synthesis reactions. The cell-free synthesis mixture is derivatized with aniline for effective separation using reversed-phase liquid chromatography and then quantified by mass spectrometry using isotopically labelled internal standards.

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

Schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion von Ratten-Pankreasgewebe

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...