Finanzielle Unterstützung für dieses Projekt lieferte die grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (2016R1A2B2006354).

1. Vorbereitung von Medien
<ol><li>Bereiten Sie Hefeextrakt mit Ergänzungen (ja), ja ohne Adenin (ja Low Ade), Pombe Glutamate Medium (PMG-12) und PMG ohne Adenin (PMG-Ade) durch Mischen der Komponenten, wie in Tabelle 1beschrieben. Ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade Platten haben alle die gleichen Komponenten, aber die Adenin ist von letzterem ausgelassen.<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden Salz (50 X) Lager: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2SO4 in Wasser destilliertem. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgende Vitamin (1, 000 X) Lager: 1 g/L panthothenat, Nikotinsäure 10 g/L, 10 g/L Inosit, Biotin 10 mg/L in destilliertem Wasser. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgende Mineral (10, 000 X) Lager: 5 g/L Borsäure, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L Zitronensäure in destilliertem Wasser. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Ja flüssiges Medium kann durch Weglassen der Agar gemacht werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoklaven Medium und Abkühlen auf unter 60 ° C unter Rühren mit Stir Bar, mit einer Rate von 200 u/min.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL/L G418 Stammlösung ja + G418 (Geneticin) Platten hinzu das ja Medium.<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden G418 (1, 000 X) Lager: 100 mg/mL G418 in destilliertem Wasser. Filter zu sterilisieren, verwenden einen 0,22 µm Porengröße Filter, 1,5 mL Zentrifuge Röhren und Store aliquoten bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rühren Sie für eine weitere 5-10 min und aliquoten Medien in 90 mm Petrischalen (1 L des mittleren Aliquote, rund 40 Petrischalen. Speichern Sie die Platten bei 4 ° C.</li>
</ol>2. Klonen von rpt4 + und seine 5' / 3' wo
<ol><li>Führen Sie PCR Primer p1 und p2 (Abbildung 1A) mit Kernspaltung Hefe genomischen DNA (gDNA) als die Vorlage in einem Gesamtvolumen von 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym 1 x Reaktion Puffer) und Anwendung der Reaktionszyklen beschrieben in Tabelle 2 zu verstärken 3.315-Basis Paar (bp) Fragment, bestehend aus rpt4 + und seine 5' / 3' wo. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einer Reinigung Kit13 , wie vom Hersteller (Abbildung 1A) gerichtet.</li>
	<li>Die pBlueScript KS(-) Vektor14 und der amplifizierten DNA-Fragment mit rpt4 + mit seinen 5' / 3' wo mit BamH1 und Xho1 in einem Gesamtvolumen von 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer) bei 37 ° C in einem Wasserbad für 16-18 zu verdauen h (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Gel reinigen des verdauten Vektors (1,2 % Agarose-Gel) und DNA durch TAE-basierte Agarose-Gelelektrophorese (100 V, 1 h), DNA-Bänder in den gewünschten Größen besteuert, und Isolierung der DNS mit einem Gel Extraction Kit15einfügen.</li>
	<li>Verbinden Sie den Vektor und DNA-Einlage mit T4 DNA-Ligase durch Durchführung einer 20 µL Ligatur Reaktion mit 50-100 ng der Vektor-DNA, ein ~ 3-fold molaren Überschuss von Einsatz DNA, 400 U T4-DNA-Ligase und 1 x Ligatur Puffer. Inkubieren Sie diese Mischung bei 18 ° C für 16-18 h.</li>
	<li>Verwandeln die aufgespaltenen DNA in 100 µL der E. Coli DH5α durch Anwendung von Hitze-Schock für 70 s bei 42 ° C. Fügen Sie 1 mL LB und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C für die Wiederherstellung. Durchführen Sie Zentrifugation (13.800 x g), verwerfen Sie die überstand, Platte alle transformierten E. Coli Zellen auf LB Ampicillin (LA) Platten und Inkubation bei 37 ° C 16 h.</li>
	<li>Wählen Sie zwischen 4-8 Kolonien mit Zahnstochern und über Nacht bei 37 ° C in 3 mL LA Medium wachsen.</li>
	<li>Isolieren Sie der Plasmide mit einem Plasmid Reinigung Kit16 laut Protokoll des Herstellers verwendet und durchführen analytische Beschränkung Enzym Verdauung mit 5 µL des isolierten Plasmids, 5 U jedes Restriktionsenzym (BamH1 und Xho1) und 1 x Einschränkung Puffer. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 3 h bestätigen das Klonen durch Sequenzierung Kandidat Plasmide.</li>
</ol>3. Einführung der Stille Mutation (Xho1 Beschränkung Site)
<ol><li>Entwerfen Sie ein paar 33-bp-Primer (p3 und p4), die die gewünschte Mutation in der ansonsten komplementäre Sequenz enthalten.</li>
	<li>PCR mit High Fidelity Polymerase17 (Abbildung 1) in einem Gesamtvolumen von 25 µL führen (10 ng von geklonten Plasmid, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer) mit Hilfe der Radsport Parameter in Tabelle 3aufgeführt.</li>
	<li>Die Vorlage Plasmid mit Dpnich in einem Gesamtvolumen von 20 µL (20 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer) bei 37 ° C in Wasser für 1 h Bad zu verdauen.</li>
	<li>Verwandeln, propagieren, isolieren und das Plasmid enthält die Stille Mutation, wie beschrieben in Schritten 2,5-2,7-Sequenz. Hinweis: Die Stille Mutation kann auch über eine Klonmethode, die für das Verbinden von mehreren DNA-Fragmente in eine einzige Reaktion18ermöglicht eingeführt werden.</li>
</ol>(4) Random Mutagenesis rpt4 + durch fehleranfällige PCR
<ol><li>Durchführen Sie fehleranfällige PCR mit dem Plasmid mit der Stille Mutation (Xho1 Website) als die Vorlage, Primer p5 und p6, ein Gesamtvolumen von 50 µL (die Menge der Vorlage in Schritt 4.1.1, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2,5 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer definiert) , und eine speziellen Polymerase, die entworfen ist, um einen hohen Fehler generieren bewerten19 (Abbildung 1). Führen Sie PCR, wie in Tabelle 2beschrieben.<ol>
<li>Verwenden Sie ca. 4-5 µg der Vorlage Plasmid die Mutation Häufigkeit auf 1 bp/kb (Kilobase) steuern. Hinweis: Ein hoher Konzentration (> 500 ng/µL) Plasmid, das mit einem Mini-Prep Kit20gewonnen werden kann, erforderlich ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Gelelektrophorese, um ein PCR-Produkt von 2670 bp (1,2 % Agarose-Gel) zu bestätigen. Gel reinigen das PCR-Produkt, wie in Schritt 2.5 beschrieben.</li>
</ol>5. Vorbereitung der Fusion-PCR-Fragmente (KAN, 3' UTR)
<ol><li>PCR mit pFA6a-KANMX621 als Vorlage, Primer p7 und p8 durchführen, und die Bedingungen aufgeführt, in Tabelle 4 Marker (KAN) Fragment zu erhalten. Gel reinigen das resultierende 1.480-bp Fragment wie in Schritt 2.5 (Abbildung 1E) beschrieben.<ol>
<li>Überprüfen Sie, ob das Stopcodon des Gens für Mutation und der kodierenden Region des angrenzenden gen gezielt werden getrennt von mehr als 500 bp. Der endogene Terminator dürfen nicht verwendet werden, wenn diese Region weniger als 500 ist bp; Vielmehr sollte der ADH -Terminator anstelle der endogenen Terminator verwendet werden. Die Protokoll-Änderungen erforderlich, um die ADH -Terminator zu verwenden sind in Tabelle 5dargestellt. Hinweis: Diese Änderungen gelten nur, wenn der ADH -Terminator, der in der pFA6a-3HA-KANMX6-Plasmid verfügbar ist, wird anstelle der endogenen Terminator verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie PCR mit dem geklonten rpt4 +-mit Vektor als Vorlage und Primer p9 und p10 in einem Gesamtvolumen von 50 µL (20 ng von geklonten Plasmid, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer), mit den Bedingungen, die in Tabelle 6dargestellt. Gel reinigen die erhaltenen 506-bp 3' UTR-Fragment (Abbildung 1E).</li>
</ol>6. Generation des Konstrukts Transformation durch Fusion PCR (Abbildung 1E)
<ol><li>Bereiten Sie die 3 Fragmente (mutagenisierter rpt4 +KAN und der 3' UTR) bei 50 ng/µL.</li>
	<li>Durchführen Sie Fusion, die PCR der drei mit Primer p11 und p12, Fragmente wie in Tabelle 7 beschrieben. (Das Protokoll für die Fusion PCR ist eine Modifikation des ursprünglichen Protokolls22.) Reinigen Sie das große 4.398-bp-PCR-Produkt.<ol>
<li>Verwenden Sie rpt4 +: KAN:3'UTR Fragmente in einem Verhältnis von 1:3:1 für optimale Ergebnisse. Hinweis: Der Gesamtbetrag der Einsatz DNA sollte nicht mehr als 500 ng. Die empfohlene Menge an rpt4 +: KAN:3'UTR ist 50 Ng:150 Ng:50 ng. Die mutagenisierter Region ist etwa 1,6 kb, so ist die minimale Anzahl von Hefe-Kolonien, die alle möglichen Kombinationen von jede Basis wird mutiert, die anderen drei ausmachen würde 1.600 x 3 = 4.800 Kolonien. Da eine Transformation Reaktion in der Regel 400 bis 500 Kolonien ergibt, mindestens 10 Reaktionen Wert der Fusion PCR zu konstruieren ist erforderlich. Dieses Bedürfnis kann erfüllt werden, indem einfach mehr Reaktion (z. B. Anzahl der PCR-Röhrchen) um den Faktor zehn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Veränderung der Spalthefe durch Elektroporation (Abb. 1F)
<ol><li>Hefe, 10 mL ja Mittel-bis Sättigung von mehr als 16 h Inkubation zu impfen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,2 in 200 mL ja Medium und inkubieren Sie bei 30 ° C mit Schütteln für ca. 5-6 h, OD600 = 0,6 - 0,8.</li>
	<li>Konzentration Zellen auf OD600 = 30, verzichten auf vier 50 mL konische Röhrchen und chill für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 1.050 x g für 3 min bei 4 ° c durchführen Legen Sie die Rohre und 10 Elektro-Küvetten auf Eis. Führen Sie die Schritte 7,3-7,8 auf Eis.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand und 15 mL 1,2 M Sorbit. Schütteln Sie die Rohre, um die Zellen aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1050 X g für 3 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7.4 und 7.5. Verwerfen Sie den überstand. Jedes Rohr 500 µL 1,2 M Sorbit hinzu, Aufschwemmen der Zellen, und sammeln Sie alle Zellen in einem 15 ml konische Rohr.</li>
	<li>Hinzufügen von 1,2 M Sorbit bis zu 2,4 mL (OD600 = 10 pro 0,2 mL). Halten Sie das Rohr auf dem Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Sorbit gefederten Zellen (stellen Sie sicher, sie werden vollständig ausgesetzt), eine EP-Röhrchen mit der Fusion PCR zu konstruieren, gut mischen und übertragen Sie die Probe auf eine Elektro-Küvette.</li>
	<li>Electroporate die Zellen mit den folgenden Optionen: Pilze, ShS (2.00kV, 1 Impuls).</li>
	<li>Jedes Elektro-Küvette für ein Gesamtvolumen von 800 µL 600 µL 1,2 M Sorbit hinzu, und breitete sich dann die Zellen auf vier ja-Platten (200 µL/Platte). Zehn Elektro-Küvetten werden ja auf 40 Platten verzichtet.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 24 h.</li>
	<li>Führen Sie Replica Plattierung ja + G418 und inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 3 Tage.</li>
</ol>8. Auswahl von Heterochromatin destabilisieren Mutanten und Fehlalarme werden gesucht
<ol><li>Führen Sie für jede Platte ja + G418 Replik Plattierung ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade (No Ade) Platten. 1-2 Tage bei 30 ° C, inkubieren Sie die Replik Platten bis einige Kolonien auf den ja-Ade-Platten einer roten Färbung (Abbildung 1 zeigen).</li>
	<li>Ja-Ade und PMG-Ade Platten und wählen Sie Zellen, rosa oder weiß auf die ja-Ade-Platte anzeigen und wachsen auch auf der PMG-Ade-Platte, zu vergleichen. Wählen Sie Kolonien ohne Wachstum auf PMG-Ade, nicht, wie sie Fehlalarme (z. B. widerspiegeln sind, dass die KAN-Kassette auf eine nicht-Ziel-Website an anderer Stelle im Genom integriert worden ist).</li>
	<li>Wählen Sie ca. 1 x 105 Zellen von jeder Kolonie und brüten in 10 µL des SPZ-Lösung enthält 2,5 mg/mL Zymolyase 100 T bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten Einsatz 1 µL dieser Lösung als Ausgangspunkt Vorlage für Kolonie PCR (Abbildung 1 H) durchführen.<ol>
<li>Machen Sie SPZ (50 mL) durch Mischen 30 mL 2 M Sorbit, 4,05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 und 15 mL destilliertem Wasser (endgültige pH 7,5). Proben (5 mL) werden mit Zymolyase ergänzt und in 500 µL Aliquots bei-20 ° C bis zum Gebrauch gespeichert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie Gelelektrophorese (1,2 % Agarosegel, 180V, 20 min) zur Visualisierung der Ergebnisse der + Kolonie PCR. Wählen Sie Reaktionen, die PCR Bands die richtige Größe aufweisen und verdauen 5 µL jedes Reaktionsprodukt mit XhoI (4 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer, 37 ° C Wasserbad, 1 h), Fehlalarme (Abbildung 1 H) auf den Bildschirm.</li>
	<li>Führen Sie Gelelektrophorese um den XhoI Übersichten (1,2 % Agarose-Gel, 180 V, 20 min) zu visualisieren. Markieren Sie die Kolonien deren PCR-Produkte werden durch XhoIgeschnitten und Patchen sie ja + G418 Platten (Abbildung 1I).</li>
	<li>GDNA aus der Kernspaltung Hefezellen zu isolieren und Sequenzierung der PCR Produkte23durchführen. Vergleichen Sie die erhaltenen Sequenz mit Wildtyp Sequenz, die Mutationen (Abbildung 1I) zu identifizieren.</li>
	<li>Führen Sie direkt wieder das Auge zu Wildtyp Zellen mit Fusion-Konstrukten von mutierten Zellen23durch PCR verstärkt zu verwandeln ein. Verwenden Sie Schmierblutungen, um den Phänotyp in den neugebildeten mutierten Zellen (Abbildung 1J) zu bestätigen.<ol>
<li>Fusion Umwandlung Konstrukt kann leicht mittels PCR Primer p1 mit p10 verstärkt werden mithilfe der genomischen DNS der Mutanten als Vorlage in einem Gesamtvolumen von 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym 1 x Reaktion Puffer), und die Anwendung der Reaktionszyklen, beschrieben in Tabelle 2 . Umwandlung des Konstrukts kann erfolgen, indem Sie die Schritte 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zufällige Mutagenese über fehleranfällige PCR ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten in einer bestimmten Region. Diese Technik eignet sich besonders für Studien, die versuchen, die Funktion eines Proteins unter bestimmten Umständen zu beurteilen. Zum Beispiel verwendeten wir hierin fehleranfällige PCR, um die Funktion der 19 s-Proteasom Untereinheit, Rpt4, im Heterochromatin Wartung zu beurteilen. Durch Variation die Region gezielt durch die fehleranfällige PCR und Anpassung der Screening-Bedingungen, konnten wir Zellen an die genomische Region von Interesse und Bildschirm für den gewünschten Phänotyp zu mutieren. Vor kurzem wurde eine ähnliche Methode zur Kernspaltung Hefezellen beherbergen Mutationen in der Spindel Pol Körper Komponente25zu isolieren.
Der entscheidende Vorteil der zufällige Mutagenese ist, dass es um unwesentliche und wesentlichen Gene angewendet werden kann. Zufällige Mutagenese der wesentlichen Gene kann führen, verschiedene Mutanten, z. B. mit subtilen und/oder teilweise Funktionsstörungen, die Zellviabilität aufrechterhalten werden können, oder durch Mutation entstehende Variationen, deren Funktionen nur unter einer bestimmten Bedingung betroffen sind. Ein Beispiel für Letzteres ist ein temperaturempfindlicher Mutant. Solche Mutanten möglicherweise isoliert mit 5 mg/L Phloxine B, die sterbende Zellen in roten Flecken und langsam wachsende Zellen vor dem Absterben von Zellen26unterschieden werden kann.
Der entscheidende Schritt dieses Protokolls ist die fehleranfällige PCR-Schritt. Bei diesem Schritt ist es wichtig, die Mutation Frequenz zu kontrollieren, die abhängig von der Anzahl der PCR-Zyklen und der ursprüngliche Betrag der Vorlage sehr unterschiedlich sein kann. Wir empfehlen, dass der Benutzer die Anzahl der PCR-Zyklen zu beheben und variieren Sie die ursprüngliche Menge Vorlage, da wir fanden, dass dies ein bequemer Strategie zur Optimierung sein. Wir stellen fest, dass die fehleranfällige PCR-Technik Jahrzehnten weit verbreitet seit. Wenn der Benutzer wählt, können sie eine Methode zur manuellen Abgleich fehleranfällige PCR27 ohne mit einem handelsüblichen Mutagenese-Kit suchen.
Als eine Verwarnung ist false-positive-Rate dieses Protokolls ziemlich hoch. Daher sollten mutierte Kandidaten einer Reihe von Screenings soll die Fehlalarme aussortieren unterziehen. Wir fanden, dass die Stille Einbeziehung einer Einschränkung-Website in das Zielgen helfen kann Thema Fehlalarme mit dem relativ mühsam Schritt der Sequenzierung zu vermeiden. Dies ist kostengünstig, wie die mutierten Kandidaten in die Hunderte oder sogar darüber hinaus Nummer können.

Nach vorne Genetik ist eine klassische Methode, in der Forscher suchen natürlich vorkommende Mutanten, die einen bestimmten Phänotyp anzeigen und genetische Analysen durchführen. In reverse Genetik Mutationen in einem gen des Interesses eingebracht werden und der Phänotyp wird untersucht. Im letzteren Fall wird zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens häufig verwendet, um einen Pool von Mutanten zu generieren, die anschließend zum gewünschten Phänotypen, wie z. B. die Temperaturempfindlichkeit ausgewählt oder enzymatische Aktivität verändert. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um zufällige Mutagenese, inklusive fehleranfällige PCR1zu erreichen; UV-Bestrahlung-2; chemische Mutagene wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder Salpetrige Säure3; die Verwendung von temporären Mutator Stämme, wie Sie zum Ausdruck zu bringen mutD5 4; und DNA Schlurfen5.
Hier beschreiben wir eine Reverse-Genetik-Strategie, in der wir fehleranfällige PCR um mutierte Pools für ein Target-gen in der Spalthefe erzeugen nutzen. Wie man aus seinem Namen vorstellen kann, erzeugt diese Methode Mutationen durch die Einführung von absichtlich Fehler während der PCR. Im Gegensatz zu anderen Methoden der Mutagenese ermöglicht fehleranfällige PCR dem Benutzer, die Region um mutagenisierter werden zu definieren. Dies macht es besonders geeignet bei den Bemühungen um die Funktion einer Protein/Domäne von Interesse zu untersuchen.
Um dieses zufällige Mutagenese-Verfahren zu demonstrieren, verwenden wir hierin rpt4 +, die die 19 s Proteasom Untereinheit kodiert, als Beispiel. Rpt4 hat gezeigt, dass Proteolyse-unabhängige Funktionen in anderen Organismen als Kernspaltung Hefe6,7,8,9haben, und ein Defekt in der Proteolyse bewirken indirekte Effekte durch die Veränderung von Proteinen Ebenen. Wir daher geschirmt für Mutanten, die Proteolyse-unabhängige Veränderungen, mit dem Ziel der Erforschung der Funktion des Proteasoms auf Heterochromatin ausgelöst.
Fehleranfällige PCR kann in jeder beliebigen Region gen angewendet werden, durch den Standort, an dem die Primer binden-tuning. Durch Mutation entstehende Variationen, die die gewünschte phänotypische Veränderung aufweisen können mit entsprechenden Reportern identifiziert werden. Hier, wir nahmen einen ade6 + Reporter eingefügt in das Zentromer 1 äußere wiederholen (Otr) Region10. Konstitutive Heterochromatin ist in dieser Region11, gebildet, so dass die ade6 + Reporter in der Wildtyp Bedingung zum Schweigen gebracht wird; Dies wird durch rote Kolonien10angezeigt. Eine Mutation, die das konstitutive Heterochromatin an das Zentromer destabilisiert führt auf den Ausdruck ade6 + Reporter, die als weiße Kolonien visualisiert wird.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1. Media</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-10KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">87070-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Adenine sulfate</td>
			<td style="width:155px;">ACR</td>
			<td style="width:119px;">16363-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Uracil&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Potassium phthalate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6758-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Inositol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MnSO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7634-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">ZnSO4&#8226;7H2O&#160;</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">83060-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">FeCl2&#8226;4H2O</td>
			<td style="width:155px;">KANTO</td>
			<td style="width:119px;">CB8943686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">31621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KI</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">80090-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CuSO4&#8226;5H2O</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">09605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">D-myo-inositol</td>
			<td style="width:155px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">102052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Pantothenate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">26003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Nicotinic Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N4126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Agarose</td>
			<td style="width:155px;">Biobasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">G418, geneticin</td>
			<td style="width:155px;">LPS</td>
			<td style="width:119px;">G41805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">2. Enzyme reactions</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">600380</td>
			<td>For site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">200500</td>
			<td>For error-prone PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher</td>
			<td>F-530L</td>
			<td>For fusion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Ex Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Takara</td>
			<td style="width:119px;">RR001b</td>
			<td>For general PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">BamH1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Xho1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Dpn1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Velveteen square, black</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89033-116</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Replica-plating tool</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25395-380</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652100&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652086&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Bioer</td>
			<td style="width:119px;">BYQ6078</td>
			<td>For fusion PCR ramp reaction&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

Zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens wird häufig verwendet, um Mutationen zu identifizieren, die zu den gewünschten Phänotyp führen. Die Methoden, die verwendet werden, um zufällige Mutagenese zu erreichen, fehleranfällige PCR ist eine komfortable und effiziente Strategie für die Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten (i.e., einer mutierten Bibliothek). Fehleranfällige PCR ist die Methode der Wahl, wenn ein Forscher versucht, eine vordefinierten Region, wie der kodierenden Region eines Gens und ohne Auswirkung auf andere genomischen Regionen zu mutieren. Nachdem die mutierte Bibliothek durch fehleranfällige PCR verstärkt wird, muss es in einem geeigneten Plasmid geklont werden. Die Größe der Bibliothek generiert durch fehleranfällige PCR ist von der Leistungsfähigkeit des Klonens Schritt eingeschränkt. Jedoch kann der Klonen Schritt in der Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe, durch den Einsatz einer hocheffizienten einstufige Fusion PCR Konstrukte für die Transformation zu generieren ersetzt werden. Mutanten der gewünschten Phänotypen können dann mit entsprechenden Reporter ausgewählt werden. Hier beschreiben wir diese Strategie im Detail, nehmen wir als Beispiel, ein Reporter am Zentromer Heterochromatin eingefügt.

Die erworbenen Rpt4 Mutanten gemäß die in Abbildung 1 beschriebenen Verfahren können analysiert werden, durch die Beurteilung der Farben der Kolonien. Die Farben der Kolonien sind auf die entsprechenden Teller in abnehmender Anzahl von Zellen in Abbildung 2gesichtet. Die ade6 + Reporter an der Heterochromatin Region eingefügt wird in Wildtyp zum Schweigen gebracht und zeigt rote Kolonien in ja-Ade-Platte. Sobald das Heterochromatin destabilisiert und die ade6 + Reporter wird ausgedrückt, können weiße Kolonien in ja-Ade Platte wie in clr4Δ Mutant beobachtet werden. Die abgeschirmten Rpt4 Mutanten sind wie dargestellt. rpt4-1 Mutant zeigt die schwerste Heterochromatin Destabilisierung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57499/57499fig1.jpg"> Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Protokolls. (A) schematische Darstellung des PCR Produktes erhalten durch die erste Runde der PCR, die mit Primer 1 und 2 durchgeführt wird. (B) Beschränkung auf Klonen des Fragments rpt4 + . (C) Site-verwiesene Mutagenese des geklonten Vektors wird verwendet, um eine Stille Mutation einzuführen, die eine XhoI Einschränkung Website hinzufügt. (D) Random Mutagenesis des rpt4 + Region Codierung erfolgt mittels fehleranfällige PCR. (E) das mutierte rpt4 + Fragment, das KAN Fragment und der 3' UTR Fragment sind Fusion PCR, eine Transformation-Ready-Kassette zu generieren eine Zwangspause einlegen. (F) Kernspaltung Hefezellen werden mit der Fusion PCR Konstrukt, transformiert die endogene rpt4 + Sequenz durch homologe Rekombination ersetzt. (G) KAN ausgewählt Kolonien sind Replik auf Ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade (No Ade) Platten beschichtet, und positiven Kolonien werden ausgewählt. (H) , PCR und nachfolgende XhoI Beschränkung des PCR Produktes werden verwendet, um Fehlalarme zu vermeiden. (I) die Mutation, die bewirkt, den Phänotyp dass ist gekennzeichnet durch das Ausbessern der ausgewählten Kolonien, die Vermehrung von Zellen, Extraktion von genomischer DNA (gDNA) und Sequenzierung der relevante Teil des rpt4 +. (J) ursächliche Mutationen werden bestätigt (und Fehlalarme ausgeschlossen) durch die Einführung von direkt der Mutation zu Wildtyp Zellen. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57499/57499fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57499/57499fig2.jpg"> Abbildung 2 : Heterochromatin de-Unterdrückung durch Mutation entstehende Variationen von Rpt4. Schematische Darstellung des Reporters otr1::ade6 + (oben). 5-Fold serielle Verdünnungen von ausgewählten abgeschirmten Rpt4 Mutanten wurden auf die angegebenen Teller in der Reihenfolge der Erhöhung des Heterochromatin Destabilisierung (unten) entdeckt. Diese Zahl wurde aus dem Artikel geändert "19 s Proteasom direkt an der Regulation von Heterochromatin breitet sich in Spalthefe durch Seo Et Al., 201724beteiligt ist". Die nicht beschnitten Figur finden Sie im Originalartikel. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57499/57499fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Komponente</td>
			<td colspan="2">Plattentyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>JA</td>
			<td>PMG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hefeextrakt</td>
			<td>5 g/L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose</td>
			<td>30 g/L</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adenin</td>
			<td>0,15 g/L</td>
			<td>0,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Histidin</td>
			<td>0,15 g/L</td>
			<td>0,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Leucin</td>
			<td>0,15 g/L</td>
			<td>0,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uracil</td>
			<td>0,15 g/L</td>
			<td>0,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalium-Wasserstoff-pthalate</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td></td>
			<td>2,2 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutaminsäure</td>
			<td></td>
			<td>3,75 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Salze</td>
			<td></td>
			<td>20 ml/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamine</td>
			<td></td>
			<td>1 ml/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mineralien</td>
			<td></td>
			<td>0,1 ml/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
			<td>16 g/L</td>
			<td>16 g/L</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Komponenten von YES und PMG Platten
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="3">30 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>55oC</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>8 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>8oC</td>
			<td>Halten</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Empfohlene PCR-Programm für Site-verwiesene Mutagenese
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="3">19 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>55oC</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>7 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>8oC</td>
			<td>Halten</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Empfohlene PCR-Programm für fehleranfällige PCR
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="3">30 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>55oC</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>8 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>8oC</td>
			<td>Halten</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4. PCR-Programm für den Erhalt der KAN-Fragment zu empfehlen
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Änderung</td>
			<td>An</td>
			<td colspan="2">Fallbeispiel des rpt4 +</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vorlage-Vektor</td>
			<td>pFA6a-3HA-KANMX6</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vektor-verbindliche Reihenfolge der p7</td>
			<td>ATTACGCTGCTCAGTGCTGA</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hängende Abfolge von p7</td>
			<td>Die letzten 50bp Sequenz einschließlich das Stopp-codon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hängende Abfolge von p8</td>
			<td>Die erste 50bp Sequenz direkt nach das Stopp-Codon (komplementäre Sequenz)</td>
			<td colspan="2">AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reihenfolge der p9</td>
			<td>Beginnen Sie direkt nach dem Stopp-codon</td>
			<td colspan="2">tgcacatatatccaaaaagccatgaa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reihenfolge der p10</td>
			<td>Produzieren ~ 500bp Fragment mit p9 (ergänzende Seqeucne)</td>
			<td colspan="2">TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 5. Änderungen erforderlich, wenn der ADH-Terminator anstelle der endogenen Terminator verwendet wird
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>95oC</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="3">30 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>55oC</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>8 min</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>8oC</td>
			<td>Halten</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 6. PCR-Programm für den Erhalt der 3' UTR Fragment empfohlen
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Rampe</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>94oC</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>94oC</td>
			<td>20 s</td>
			<td></td>
			<td rowspan="4">10 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>70oC</td>
			<td>1 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>55oC</td>
			<td>30 s</td>
			<td>0,1 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>68oC</td>
			<td>02:30 min</td>
			<td>0,2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>94oC</td>
			<td>20 s</td>
			<td></td>
			<td rowspan="4">5 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>70oC</td>
			<td>1 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>55oC</td>
			<td>30 s</td>
			<td>0,1 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>68oC</td>
			<td>02:30 min</td>
			<td>0,2 oC/s + 5 s/Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>94oC</td>
			<td>20 s</td>
			<td></td>
			<td rowspan="4">10 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>70oC</td>
			<td>1 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>55oC</td>
			<td>30 s</td>
			<td>0,1 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>68oC</td>
			<td>02:30 min</td>
			<td>0,2 oC/s + 20 s/Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>72oC</td>
			<td>10 min</td>
			<td></td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>8oC</td>
			<td>Halten</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 7. Empfohlene PCR-Programm für die Fusion PCR
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr>
<td>CBL1877</td>
			<td>h +</td>
			<td>ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (GD-Glu) Sph1:ade6</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle S1: In dieser Studie verwendete Stamm
<img src="/files/ftp_upload/57499/57499tbl2.jpg"> Tabelle S2: Liste der in dieser Studie verwendeten Primer

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K Aufrufe.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Serie: Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Forschung

Genetik

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...