Wir möchten danken Caenorhabditis Genetik Zentrum für Stämme, die Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC) und Canada Foundation für Innovation (CFI) für die Finanzierung. Wir möchten danken Dr. Lizhen Chen (Abteilung Zellsysteme und Anatomie, UT Gesundheit San Antonio) dafür, dass die uneingeschränkte Nutzung der ihr Laboreinrichtungen für alle C. Elegans Experimente sowie Dr. Exing Wang (Associate Director, Optical Imaging Facility UT Health San Antonio) Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir möchten auch Dr. Myron Ignatius danken für die Unterstützung und Ermutigung für den Videodreh zu erleichtern.

(1) färben und Image-Darm Lysosomen
<ol><li>Samen Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Platten mit OP50
	<ol>
<li>NGM Platten nach den empfohlenen Protokoll19 vorzubereiten und die geschlossenen Platten für 2 Tage bei Zimmertemperatur trocknen.</li>
		<li>OP50 Bakterien in sterilen Luria Brühe (LB) Brühe zu impfen und wachsen in einem schütteln Inkubator oder Wasserbad bei 37 ° C für 36 h oder bis die OD zwischen 0,2 und 0,4. Vermeiden Sie die Verwendung einer Bakterienkultur mit OD > 1 oder OD < 0,2.</li>
		<li>Sobald NGM Platten trocken sind, geben Sie einen Tropfen (~ 30 µL) von OP50 Inokulum auf der Mitte der Platte, und breitete sich dann des Tropfens in einen Patch, der etwa 2 cm x 2 cm groß ist. Hinweis: Alle verbleibenden OP50 Inokulum kann bei 4 ° C bis zu einem Monat gespeichert werden.</li>
		<li>Invertieren Sie die OP50-Platten zu, sobald das Inokulum (etwa 10 oder 15 min) getrocknet ist, und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 36 h.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 36 h die Platten im Inkubator und Store bei 4 ° C bis zur späteren Verwendung. Hinweis: Die Platten sollte gut für bis zu 1 Monat bei 4 ° c sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Ergänzende cDCFDA, OP50
	<ol>
<li>Ergänzend zu cDCFDA auf OP50 Platten bereiten Sie einen arbeiten bestand von 10 mM cDCFDA in Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Halten Sie die cDCFDA-Lösung geschützt vor Licht und bei-20 ° C für die spätere Verwendung speichern.</li>
		<li>Sanft lege 100 µL 10 mM cDCFDA Lösung auf die Oberfläche von 2 cm x 2 cm OP50 Patch, so dass die gesamte Patch gleichmäßig mit cDCFDA bedeckt ist. Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass der gesamte Patch von OP50 mit cDCFDA bedeckt ist. Falls erforderlich, verwenden Sie bis zu 150 µL des cDCFDA für jede Platte. Es ist auch unerlässlich, dass die cDCFDA Lösung nicht über die Grenzen des OP50 Patch, da jede cDCFDA, die aus dem OP50 Patch fließt nicht in der Nahrung aufgenommen werden und zu geringeren Intensität der Färbung führt.</li>
		<li>Die OP50-Platten in einer dunklen Kiste auf den Tisch legen, bis aller die cDCFDA Lösung ist die bakterielle Patch aufgenommen (in der Regel etwa 25 bis 30 min.).</li>
	</ol></li>
	<li>Färbung der Würmer mit cDCFDA
	<ol>
<li>Sobald die cDCFDA den OP50 Patch vollständig durchdrungen hat, platzieren Sie nicht mehr als 20 Würmer pro Platte zu und inkubieren Sie die Platten bei 20 ° C bei einem Mindestaufenthalt von 14 h invertiert. Hinweis: Es wird empfohlen, die cDCFDA Platten in einem undurchsichtigen Lichteinfall minimieren zu platzieren.</li>
		<li>Zur Steuerung für Aufnahme Unterschiede zwischen Experimenten und cDCFDA Signale zu normalisieren empfohlen () mit 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (Co Fleck Difluoro) Bor (2,5 µL einer frisch zubereiteten 1 mM-Lösung), ein Acidotropic schwach Amin Farbstoff deren Fluoreszenz weitgehend nicht-Variante im sauren pH-Spektrum ist (siehe Tabelle der Materialien für Trivialnamen von Reagenzien). Hinweis: Flecken Sie Würmer für weniger als 14 h keine, da dies möglicherweise unzureichend cDCFDA Färbung Intensität und eine falsche Interpretation des lysosomalen pH-Wertes geben.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Folien für die Mikroskopie
	<ol>
<li>Legen Sie zwei parallele Streifen der Kennzeichnung Band ungefähr 3 Zoll auseinander auf eine glatte, flache Oberfläche wie ein Spiegel (Abbildung 1).</li>
		<li>Beschichten der Oberfläche des Spiegels mit Wasser abweisenden Spray und überschüssige Flüssigkeit abwischen.</li>
		<li>Schmelzen Sie 2 % Agarose (gelöst in destilliertem H2O) in der Mikrowelle bis vollständig verflüssigt, dann Tropfen Sie einen 50 µL Agarose zwischen den beiden Streifen Klebeband und decken Sie schnell den Tropfen mit einem Mikroskop-Objektträger, so dass die Folie senkrecht zu den Streifen des Band. Nachdem die Agarose erstarrt ist, bilden eine kreisförmige Pad unterhalb der Folie umdrehen Sie die Folie und fügen Sie 10 bis 15 µL 5mM Natriumazid (NaN3) auf das Agarose-Pad. Hinweis: NaN3 ist ein Inhibitor der Cytochrom C, die bei in geringen Konzentrationen verwendet, reversibel anesthetizes Würmer, so dass sie nicht während der Aufnahme bewegt.</li>
		<li>Wählen Sie Würmer aus dem OP50-Teller mit cDCFDA ergänzt, und übertragen Sie sie auf einen sauberen Teller der NGM ohne jede OP50. Können Sie die Würmer, sich für einige Sekunden, um die meisten der OP50 erlauben zu bewegen von der Oberfläche der Würmer entfernt werden, und übertragen Sie dann die Würmer auf die Agarose-Pad mit 5 mM Natriumazid.</li>
		<li>Sofort die Agarose-Pad mit einem Deckglas abdecken. Achten Sie darauf, legen Sie das Deckglas vorsichtig ohne zu viel Druck, da diese Würmer platzen führen kann. Hinweis: OP50 Bakterien cDCFDA ¤ nzt fluoreszieren, wenn durch Mikroskopie visualisiert, daher ist es wichtig, die Würmer so gut wie möglich zu reinigen, bevor man sie auf die Agarose-Pad mit Natriumazid. Wenn mehr als 6 Sorten von C. Elegans (einschließlich N2, Wildtyp-Kontrolle) vorbereiten, ist es ratsam, zur Vorbereitung der Proben in Chargen von 6, um sicherzustellen, dass die Würmer auf dem Agarose-Pad nicht austrocknen. In einigen Stämmen beginnt die Vulva zu Bruch nach längere Zeit aufgrund des Drucks durch das Deckglas, so ist es wichtig, entsprechend zu planen.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfokale Mikroskopie Hinweis: Einige Mikroskope haben eine eingebaute Funktion, die automatisch erhöht die Fluoreszenzintensität Ausgleich für Variable Ebenen der Fluoreszenz. Diese Mikroskope funktionieren möglicherweise nicht gut für imaging-Würmer gebeizt mit cDCFDA, da sie von Natur aus der Fluoreszenzintensität von Proben zu erhöhen.<ol>
<li>Führen Bildgebung auf einem standard confocal Mikroskop mit Erregung/Emission Wellenlängen eingestellt auf 488/530 nm für cDCFDA. Nehmen Sie einziges Flugzeug Bilder (nicht Z-Stapel) der Darm Lysosomen und verwenden Sie nur Lysosomen, die im Fokus (maximale Signalstärke) zur Quantifizierung der Intensität sind. Hinweis: Vielleicht wegen der Unterschiede in der Verfügbarkeit von Farbstoff, Lysosomen die Darmzellen direkt posterior, den Pharynx pflegen cDCFDA Färbung Intensität unabhängig von Genotyp oder Alter, daher sollte darauf geachtet werden, imaging Lysosomen in diesen Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Bild der Folie, die 2 Tage alten Wildtyp, die N2 zuerst Würmer enthalten. Passen Sie dabei die konfokale bildgebenden Parameter wie Laserleistung, Lochkamera und Blende, um sicherzustellen, dass die cDCFDA Färbung Intensität nicht übersättigt ist. Hinweis: Sobald diese Einstellungen festgelegt sind, ändern sie für die gesamte Dauer der Bildgebung für diesen Tag.</li>
		<li>1024 x 1024 Pixel Aufnahmen von einer Ebene des Darmes (3 bis 4 Bilder pro Wurm) mit einem 60 X vergrößerungslinse. Hinweis: Das cDCFDA Emissionsspektrum Worms erbringt eine einzelne markante Gipfel bei 520 nm zeitgleich mit seiner gemeldeten Fluoreszenz Spektrum20, bietet eine spezifisches Signal-Anzeige, die sich vom Darm Autofluoreszenz (Abbildung 3) unterscheidet.</li>
		<li>Exportieren Sie konfokale Rohbild (.lsm Dateien) als TIFF-Dateien für jeden Kanal.</li>
		<li>Als nächstes öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie , öffnen Sie die Bilddatei quantifiziert werden. Nachdem das Bild geladen wurde, verwenden Sie die ovale Form-Auswahl-Werkzeug in ImageJ, um einer Region of Interest (ROI) auszuwählen.</li>
		<li>Klicken Sie danach auf analysieren | Maßnahme , Fluoreszenzintensität für diese Rendite zu quantifizieren. Wählen Sie 4 – 5 verschiedene in-Fokus Lysosomen pro Bild und Berechnung der durchschnittlichen relativen Fluoreszenzintensität der jeweiligen Region of Interest (ROI).</li>
		<li>Für jedes Bild Messen der Fluoreszenzintensität Hintergrund in einer Region des Darms zwischen Lysosomen. Subtrahieren Sie die Hintergrundwerte Fluoreszenz Intensität von den lysosomalen Fluoreszenz-Intensität-Werten.</li>
		<li>Sammeln Sie insgesamt rund 30 bis 50 einzelne normalisierte Werte für cDCFDA Intensität (6 bis 10 Tiere) für jede Belastung getestet. Verwenden Sie diese Werte, um eine Box und Whisker Plot, die Verwendung von geeigneten statistischen Software zu zeichnen. Hinweis: Färbung kann abhängig von Faktoren wie Temperatur, Inkubationszeit und die allgemeine Gesundheit/Alter der Tiere unterschiedlich so dass Fluoreszenz Intensität Vergleiche nur Proben Prozess im gleichen Färbung Experiment relevant sind. Es ist daher wichtig, Kontrollen in jeder Färbung Experiment zu verarbeiten. Statistische Unterschiede berechnen (t-Tests) Verwendung von geeigneten statistischen Software.</li>
		<li>Bild alle Stämme aus dem gleichen Experiment (gebeizt am selben Tag) nacheinander, kümmert sich nicht um die bildgebenden Parameter ändern.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Eine Vielzahl von zellulären und molekularen Ereignissen trägt zum Altern, von Lebensgeschichte Merkmale und genetische Faktoren beeinflusst. Unsere aktuelle Studie22 legt nahe, dass die reproduktive Zyklus eine wichtige Rolle spielt bei der Kontrolle der Fitness von Soma durch die Regulierung der lysosomalen pH Dynamik. Wir zeigten, dass dieser lysosomalen vermittelte Proteolyse gefördert wird, während Tiere aktiv reproduzieren durch Hochregulation von V-ATPase Transkription, sorgt wiederum für sauren Lysosomen. Nach Ende der Wiedergabe, V-ATPase Ausdruck Tropfen, Lysosomen alkalinize und proteinaggregaten in diesen Zellen ansammeln.
Störungen, die lysosomalen Übersäuerung beeinträchtigt haben gezeigt, dass durch veränderte V-ATPase Aktivität verursacht werden, und sinkende V-ATPase Funktion im Gehirn auch wurde vorgeschlagen, verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten23zugrunde liegen. Unsere Ergebnisse weiter stützen die Hypothese, die beeinträchtigt V-ATPase Funktion unter den Ursachen der zellulären Seneszenz und Alterung24ist.
Eine zytologische Markenzeichen des alternden Zellen ist die progressive Bildung von aggregierten und fehlgefaltete Proteine im alten Zellen1,25,26,27,28,29. Wie in post-reproductive C. ElegansZellen ähnlich wie Protein, die Aggregate in der lysosomalen Lumen des späten gefunden werden Passage Säugetieren kultiviert27,29. Da Lysosomen terminal Endpunkt der selbstverdauende Weg sind, ist es plausibel, dass der ständige Zustrom von beschädigte Proteine und Organellen in alkalinized Lysosomen ergibt sich der funktionelle Zusammenbruch dieser Lysosomen führt dann zu anderen nachgeschalteten Ereignisse, die letztlich zur zellulären Seneszenz beitragen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um eine einfache und reproduzierbare Beurteilung der relativen Säure im Darm Lysosomen Leben generieren C. Elegans. Da ein engen pH-Bereich (4,5 – 5) in diese Organellen für richtige Proteolyse erforderlich ist, haben subtile steigt der pH dramatische Folgen für Mobilfunk- und Gewebe Homöostase17. Die Fluoreszenz Eigenschaften und niedrigen Pka des cDCFDA ermöglicht dieser Farbstoff, Änderungen in Säure in diesem physiologisch relevanten pH Fenster18zu erfassen. Die Konzentration der cDCFDA zum Beizen Lysosomen empfohlen wurde optimiert, um das beste mögliche Auslesen der Veränderung des lysosomalen pH-Wertes auf Basis unserer bildgebenden Parameter und imaging-System zur Verfügung zu stellen. Allerdings variieren die Ergebnisse der cDCFDA Färbung für verschiedene Benutzer basierend auf ihrer bildgebenden Einstellungen, so dass lysosomale pH-Wert-Änderungen in der cDCFDA Färbung Muster nicht korrekt wiedergegeben werden könnte. In diesem Fall die beste Vorgehensweise wäre, verwenden unterschiedliche Konzentrationen von cDCFDA (10 bis 100 mM) zur Bestimmung der optimalen Konzentration für imaging-Variationen in Wildtyp N2 Würmer an Tag 2 und Tag 8 Post L4. Die ideale cDCFDA-Konzentration ist ein Flecken Lysosomen jung (2. Tag Post L4) Würmer effizient ohne übersättigt wird jedoch zeigt auch eine verminderte Färbung Intensität für alt (8. Tag Post L4) Würmer.
Eine Einschränkung der cDCFDA Färbung Technik ist die lange Inkubationszeit. Wenn Würmer zu einem bestimmten Zeitpunkt ausgebrütet werden, können die Ergebnisse erst nach ca. 24 h visualisiert werden. Es wäre effizienter, einen Stamm von C. Elegans , die eine Echtzeit-Auslesen des lysosomalen pH-Wertes bietet vermutlich mit einer pH-Sensitive Fluorophor markiert eine lysosomale Membran-Protein zu entwickeln.
Zwar gibt es ein paar verschiedene Techniken für die Beurteilung der pH-Wert im Darm von C. Elegans, die meisten dieser Techniken den pH-Wert des Darmes zu bewerten, als eine ganze30, oder erfordern Injektion in die Körperhöhle, was zeitaufwändig und umständlich31. cDCFDA kann leicht für groß angelegte genetische Bildschirme mit Fütterung RNAi-Bibliotheken für C. Elegans Mutanten dieser Show verändert lysosomale pH oder Physiologie suchen angewendet werden. Die einzige kritische Aspekte dieser Methode sind die Konzentration der cDCFDA verwendet und wird Sie sicher, dass ein junger (2. Tag Post L4) N2 Steuerung Belastung als Maßstab für die konfokale Bildgebung während jeder Sitzung zu konfigurieren.
Um den Beitrag des lysosomalen pH-Wertes Alterung besser verstehen zu können, werden muss die regulatorischen Mechanismen hinter den dynamischen Veränderungen in lysosomalen Säure in Reaktion auf verschiedene zelluläre und ökologischen Eingaben sezieren. cDCFDA Färbung kann als eine Strategie zur Forschung in C. Eleganszu verlängern.

Das Erscheinungsbild von proteinaggregaten ist weithin anerkannt, zu einem Markenzeichen des Alterns in eukaryotischen Zellen1,2,3, und die Bildung von denen angenommen wird, unter den Fahrern Prinzip der zellulären Seneszenz4 , 5 , 6 , 7. es gibt zunehmend Beweise wie Alter Zellen, PROTEINKATABOLISMUS, führt zu einem Anstieg der Proteinaggregation vorliegt. Der Zusammenbruch der Proteolyse in alternden Zellen beinhaltet eine Beeinträchtigung der Autophagie8 sowie Proteasom-vermittelten Protein Degradation9. Schließlich wird irreversibel Protein Oxidation in alten Zellen erhöht Protein Katabolismus10weiter zu beeinträchtigen.
Autophagie wurde ursprünglich gedacht, um ein nicht-selektiven Verfahren zur Masse Abbau von beschädigten Proteinen, aber neuere Studien haben gezeigt, dass Autophagie ist sehr selektiv zu den Katabolismus von Protein-Aggregate und dysfunktionalen Organellen, die nicht Abbau über andere Protein-Clearance Mechanismen11zugänglich. Während des Prozesses der Autophagie sind beschädigt und aggregierte Proteine in einer Doppel-Membran Vesikel genannt die Autophagosome abgesondert. Dieser Autophagosome verschmilzt dann mit der sauren Organellen genannt Lysosomen, die führt zu einer Verschlechterung der Autophagosome Ladung12. Lysosomen repräsentieren den Endpunkt des selbstverdauende Weges und verschiedene zelluläre Prozesse wie Membran Reparatur, transcriptional Control und Nährstoff sensing beteiligt; Hervorhebung ihrer zentralen Rolle in zelluläre Homöostase (überarbeitet in Nr. 13). Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen einer altersabhängige Rückgang der lysosomalen Funktion und verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen13gezeigt. Konsequent, kann Wiederherstellung der lysosomalen Funktion in älteren Zellen alterungsbedingte Phänotypen14,15verzögern. Studien der Komposition des Intralumen Milieus deuten darauf hin, dass der Zusammenbruch der lysosomalen Funktion in älteren Zellen nicht durch einen Rückgang der Produktion von lysosomale Proteasen16. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass Verlust der Intralysosomal Säure, eine entscheidende Voraussetzung für seine enzymatische Aktivität, den Rückgang der Lysosomen-vermittelten Proteolyse17zugrunde liegen kann. Um diese Hypothese zu erkunden zu können, ist es entscheidend für die Entwicklung von Reagenzien und Protokolle, dynamische Veränderung des lysosomalen pH-Wertes in lebenden Zellen in eine reproduzierbare und konsistente Weise zu erforschen.
Der Darm von C. Elegans ist das große metabolische Gewebe in Worms und es ist eine kritische Regulator des systemischen Homöostase und Lebensdauer. Haben wir Tests zur Beurteilung von Veränderungen in der Säure des Lumens der intestinalen Lysosomen von Worms um festzustellen, wie Lysosomen-vermittelten Proteolyse trägt zur Alterung. Wenn pH-Sensitive Fluorophore zuvor in C. Elegans verwendet wurden, um intestinale Lysosomen zu markieren, wurde es noch keinem bemühen, eine erfolgreiche Protokoll zu etablieren, die kleine Erhöhungen in lysosomalen pH-Wert in Vivo18. erkennen kann Hier bieten wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Verlust der lysosomalen Säure in die Darmzellen von C. Elegans zu erkennen, über eine einfache und bequeme Fütterung Protokoll, die einen pH-Sensitive Fluorophor (cDCFDA) enthält in OP50 Nahrung.

<table><tbody><tr><td>OP50 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-dichlorofluorescein diacetate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Commonly known as cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#039;H-2,2&#039;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Commonly known as Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Broth powder</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol powder</td><td>Sigma</td><td>C3045&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mirror or other smooth flat surface</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) ist ein Modell, das häufig verwendet wird, um Langlebigkeit und Entwicklungsstörungen Wege zu studieren. Solche Studien werden erleichtert durch die Transparenz des Tieres, die Fähigkeit, weiterleiten und umkehren, genetische Tests, die relative Leichtigkeit der Generierung von eindringmittel markierte Proteine und die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die entweder in den frühen mikroinjiziert werden können Embryo oder integriert in seine Nahrung (E. Coli -Stamm OP50) zellulare Organellen (z.B. 9-Diethylamino-5 H-Benzo (a) Phenoxazine-5-1 und (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) Methylidene]-2 H-Pyrrol-5-Yl-KappaN} - N - beschriften [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von einem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, der Darm Lysosomen Flecken bietet eine visuelle Auslesen der dynamischen, physiologische Veränderungen in lysosomalen Säure im Leben Würmer. Dieses Protokoll misst nicht lysosomale pH-Wert, sondern vielmehr soll eine zuverlässige Methode zur Beurteilung relevanten physiologischen Variationen in lysosomalen Säure. cDCFDA ist eine Zelle-permeationsfähigen Substanz, die in den fluoreszierenden Fluorophor 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) nach Hydrolyse von intrazellulären Esterasen umgewandelt wird. Protonierung in Lysosomen fallen cDCF in diese Organellen, wo es sich ansammelt. Aufgrund seiner niedrigen pKa von 4,8 wurde dieser Farbstoff als pH-Sensor in der Hefe verwendet. Hier beschreiben wir die Verwendung von cDCFDA als Nahrungsergänzungsmittel zu beurteilen, den Säuregehalt des intestinalen Lysosomen in C. Elegans. Diese Technik ermöglicht die Erkennung von alkalisierenden Lysosomen mit lebenden Tieren, und hat ein breites Anwendungsspektrum experimentelle Studien über das Altern, Autophagie und lysosomale Biogenese einschließlich.

cDCFDA Flecken Lysosomen in einem pH-abhängigen Weise, und seine niedrige pKa und bereit Aufnahme in Lysosomen macht es eine ideale pH-Sensor-21. cDCFDA Färbung Intensität ist umgekehrt proportional zur lysosomalen pH-Wert (d. h. Färbung Intensität erhöht als pH-Wert sinkt)18,22. cDCFDA Signale sind durchweg schwach in Lysosomen von Tieren behandelt mit 20 mM von Chloroquin, ein Inhibitor der lysosomalen Versauerung und Würmer von V-ATPase, die Protein-Komplex auf der Membran der Lysosomen, die erforderlich für Proton Import22 ist leer . Dies sind wichtige Steuerelemente zu verwenden, wenn die relativen Pegel der cDCFDA Färbung in andere genetische Hintergründe oder Behandlungen zu bewerten.
Wir finden auch keine offenkundigen Wirkungen der Exposition der cDCFDA auf die Fitness oder Fruchtbarkeit des behandelten Würmer (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir einen endogenen Verlust von Säure in Lysosomen post-reproductive Wildtyp Würmer identifiziert. Wie in Abbildung 3 dargestellt, das cDCFDA-Fluoreszenz-Signal ist robust in den Lysosomen von jungen (2-Tages Post L4) C. Elegans, bedeutet gesäuerte Lysosomen zu reproduzieren. Die Färbung Intensität reduziert auf Alkalisierung der Lysosomen, wie in alten (8-Tage Post L4) Würmer ebenso wie in Worms wo der Proton-Zustrom in diese Organellen reduziert wird (über Knockdown von Vha Gene Kodierung V-ATPase Untereinheiten) beobachtet. Mit dieser Methode erkannt wir eine physiologische Verlust von lysosomalen Säure im Darm von post-reproductive Tieren (Diagramm in Abbildung 2Fluoreszenzbilder in Abbildung 3). Die reduzierte cDCFDA signal im Darm von Tag 8 (Post-L4) Würmer auf alkalinized Lysosomen und eine mögliche Wertminderung in Protein-Clearance hingewiesen. Dies ist in der Tat der Fall, da diese Tiere deutlich proteinaggregaten in Lysosomen bei diesem Leben Bühne22sammeln. Um eine Rolle von Lumen Entsäuerung in diesem Prozess zu validieren, Co gebeizt wir jung, Reproduktion von Tieren, die hatte durch RNAi von zwei Kernkomponenten von V-ATPase Pumpe Maschinen (VHA-2 und VHA-8) erschöpft worden und sollte daher nicht ordnungsgemäß importiert Protonen in Lysosomen. Wie erwartet zeigte Vha-2 und Vha-8 RNAi-Tiere, sogar in der reproduktiven Phase reduzierten cDCFDA Fluoreszenz Signale vergleichbar mit denen von post-reproductive Wildtyp Würmer und im Einklang mit alkalinized Lysosomen (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig1.jpg"> Abbildung 1: Erstellung von Folien für die Mikroskopie. Eine einfache Schritt für Schritt Schaltplan zeigt die Schritte befolgt werden, für die Zubereitung von Folien für die Mikroskopie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig2.jpg"> Abbildung 2: Verwendung von pH-sensitiven Farbstoffen Säure im Darm Lysosomen von C. Eleganszu untersuchen. Diagramm zeigt die Muster der intestinalen cDCFDA Fluoreszenzintensität reproduzieren (Tag 2) und Post-reproduktiven (Tag 8) Würmer. Die oberen Diagramme zeigen ganze Würmer. Die Kästchen in der unteren repräsentieren gezoomt, projiziert Diagramme der Mitteldarm Region, im Darmlumen in der Mitte. Lysosomen sind als Vesikel unterschiedlicher Größe im Zytoplasma der Darmzellen dargestellt. Diese schematischen Darstellungen mit Abbildung 3 Bilder zu vergleichen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig3.jpg"> Abbildung 3: cDCFDA Färbung Bilder. Repräsentative Bilder von Tag 2 und Tag 8 (post L4) C. Elegans Darm Lysosomen (N2 Wildtyp) gefärbt mit cDCFDA sowie Darm Lysosomen Vha-2 und Vha-8 RNAi-Würmer mit cDCFDA (Positivkontrolle) befleckt. VHA-2 und Vha-8 kodieren Untereinheiten der vacuolar ATPase (vATPase), die Protonenpumpe Futter die lysosomale Membran, die Versauerung der lysosomalen Lumen zu verantworten hat.

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Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Eine schrittweise Anleitung zum Verlust der lysosomalen Säure im Darm von C. Elegans mit der pH-Sensitive vital Farbstoff 6 - Carboxy - 2', 7'-dichlorofluoresceins Diacetat (cDCFDA) Sonde

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K Aufrufe.  University of Saskatchewan. Eine schrittweise Anleitung zum Verlust der lysosomalen Säure im Darm von C. Elegans mit der pH-Sensitive vital Farbstoff 6 - Carboxy - 2', 7'-dichlorofluoresceins Diacetat (cDCFDA) Sonde

Serie: Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Forschung

Biochemie

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Entwicklungsbiologie

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologie

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Medizin

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Neurowissenschaften

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung des Metabolismus und des Alterungsmusters bei Caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences teaching through the staining of the cells or their molecular content. Lugol dye (iodine-potassium iodide solution) has been widely used in biochemistry to stain glycogen stores. In this context, it is possible to observe differences between fed and starved animals, besides the effects of different conditions, such as different diets and oxygen levels. Erioglaucine is a blue dye that indicates the loss of the intestinal barrier. When the intestinal barrier is intact, the blue dye stains inside the lumen; however, when this integrity is disrupted, the dye leaks into the body cavity. Using a stereomicroscope or a microscope, teachers can demonstrate physiological and biochemical alterations, or they can instigate students to ask a scientific question and hypothesize and test their hypothesis using these assays. The present protocol describes two staining techniques in C. elegans that can be easily carried out by students.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erforschung von Stoffwechsel- und Alterungsprozessen in C. elegans mit kostengünstigen, hochwirksamen Assays

Teaching biological sciences can be made more stimulating for students through the use of experimentation. This manuscript presents two different yet complementary protocols that can be utilized in the classroom to encourage students to formulate and test hypotheses related to high-calorie diets, starvation, and aging.

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

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Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans