Diese Arbeit wurde ermöglicht durch den NIH-Zuschuss: R01GM109028 (S.P.C.)

(1) Nil rot (NR) Färbung der Lipide
<ol><li>Vorbereitung von 5 mg/mL NR Stammlösung<ol>
<li>Fügen Sie 100 mg NR Pulver in einen 500-mL-Flasche hinzu 200 mL 100 % Aceton.</li>
		<li>Decken Sie die Flasche mit Alufolie zu jeder Lichteinfall zu vermeiden.</li>
		<li>Vor dem Gebrauch rühren Sie die Lösung für 2 h im Dunkeln.</li>
		<li>Für langfristigen Gebrauch speichern Sie NR Vorratslösung in einer gut verschlossenen Flasche ohne jede Belichtung. NR-Stammlösung nach Forschungsbedarf zu skalieren. Sicherstellen Sie, dass die gleichen Stammlösung über NR-Färbung Experimente verwendet wird, um einheitliche Färbung und imaging Ergebnisse erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Arbeitslösung NR<ol>
<li>Fügen Sie für jeden 1 mL 40 % Isopropanol (V/V) 6 µL der Stammlösung NR.</li>
		<li>Jede Probe 600 µL Arbeitslösung NR vorbereiten. Hinweis: Stellen Sie frische NR arbeiten Lösung direkt vor der Färbung. NR-Stammlösung Bedürfnissen verwenden Sie eine 15 mL oder 50 mL absolvierte konischem Rohr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Würmern NR Lipid Färbung<ol>
<li>Wachsen Sie Würmer zu früh L4 bei 20 ° C auf Nematoden Wachstumsmedium (NGM) mit späten Log OP50 E. Coliausgesät.</li>
		<li>Waschen Sie die Würmer aus der Platte mit 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung + 0,01 % Triton x-100 (PBST) Lösung und die Wurm-Suspension in einem 1,5 mL Microfuge Rohr.</li>
		<li>Zentrifuge aus Aussetzung entfernen die Würmer bei 560 X g für 1 min. die überstand und wiederholen Sie diesen Schritt bis E. Coli deaktiviert ist.</li>
		<li>Das Wurm-Pellet 100 µL 40 % Isopropanol hinzu und bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.</li>
		<li>Die Würmer bei 560 X g für 1 min Zentrifugieren und Entfernen des Überstands ohne Unterbrechung der Wurm Pellet. Hinweis: Nutzung höhere Volumina der PBST die Würmer von den Tellern zu waschen, wenn mit größeren Platten oder Färbung mehr Würmer pro Platte. Waschen Sie die Würmer in PBST mehr als 15 min vor der Fixierung der Probe nicht. Führen Sie weitere Waschungen, wenn der Überstand der Bakterien nicht deaktiviert ist. Führen Sie die Inkubation in 40 % Isopropanol mit einem Nutator oder Wippe. Immer überwachen Sie die Rohre, um sicherzustellen, dass vollständige Probe Erregung stattfindet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid Färbung mit NR<ol>
<li>Fügen Sie in der Dunkelheit 600 µL Arbeitslösung NR jeder Probe hinzu. Invertieren Sie die Rohre dreimal und mischen Sie die Würmer in NR-Lösung vollständig zu.</li>
		<li>Drehen Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 h.</li>
		<li>Nach der Inkubation die Würmer bei 560 X g für 1 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 600 µL PBST und inkubieren Sie die Proben in der Dunkelheit für 30 min um überschüssige NR Fleck zu entfernen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 560 X g für 1 min und entfernen Sie alle ca. 50 µL überstand. Hinweis: NR Inkubation erfordert keine Unruhe. Absetzen von Würmern ist üblich bei diesem Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellung von Folien für Mikroskop Bildgebung<ol>
<li>Das Wurm-Pellet im restlichen überstand aufzuwirbeln.</li>
		<li>5 µL der Wurm Aussetzung auf einen Objektträger legen Sie und einem Deckgläschen auf sorgfältig einfangen von Luftblasen zu vermeiden.</li>
		<li>Das Deckglas mit Nagellack vor imaging Würmer zu versiegeln.</li>
		<li>Bereiten Sie nur ein Paare Folien zu einem Zeitpunkt. Dadurch wird sichergestellt, dass NR Bildgebung über Proben konstant bleibt. Die Qualität der NR-gefärbten Bilder verringert sich nach 6 h. diskrete Lipid Tröpfchen schwer sind zu beobachten und Hintergrundfluoreszenz erhöht, die stört NR Signalerkennung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildgebung des NR-gefärbten Würmer<ol>
<li>Bild der Würmer bei 5 X Vergrößerung, mehrere Tiere pro Gesichtsfeld zu erfassen.</li>
		<li>Wechseln Sie zu 10-facher Vergrößerung für bessere Quantifizierung der einzelnen Würmer.</li>
		<li>Verwenden Sie FITC/GLP-Kanal Bild NR-gefärbten Würmer und versuchen unterschiedliche Belichtungszeiten zu bestimmen, die optimale Bedingungen für die Quantifizierung.</li>
		<li>Speichern von Dateien im TIF-Format, um Datenverlust durch Kompression zu vermeiden. Hinweis: Typische Belichtungszeiten reichen von 100-1000 Frau, die eine optimale Belichtungszeit, verwenden Sie es für alle Proben um zu bildgebenden Konsistenz zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR Färbung Bild Quantifizierung<ol>
<li>Hochladen Sie Mikrographen auf ImageJ. Verwenden Sie im Pulldown-Menü Plugins die Bio-Formate-Funktion, wenn die Image-Datei nicht erkannt wird.</li>
		<li>Verwenden Sie in der Bild-Pull-Down-Menü unter dem Stapel-Funktion Bilder-Stack, um einem Bildstapel zu erstellen, wenn mehrere Aufnahmen verglichen werden.</li>
		<li>In der gleichen Pull-Down-Menü anpassen von Helligkeit/Kontrast im Bild-Stapel und Änderungen auf alle Bilder zu verbreiten, indem Sie auf Übernehmen geklickt.</li>
		<li>Beschäftigen Sie die Polygon-Auswahl-Werkzeug jeder abgebildeten Wurm abzugrenzen und die Messfunktion unter Analyse Pull-Down-Menü um Fluoreszenzintensität emittierten NR zu quantifizieren.</li>
		<li>Messen Sie für jedes Bild fünf Hintergrund Standorten und berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenz-Intensität.</li>
		<li>Subtrahieren Sie die Hintergrund-Fluoreszenzintensität von jeder abgebildeten Wurm mit Hilfe der Formel N = G - (A x B), wobei N für net Fluoreszenz, G für grobe Fluoreszenz, für insgesamt Wurm Bereich A und B für durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz steht.</li>
		<li>Um der Fluoreszenzintensität nach Wurm Größe zu normalisieren, Teilen des Wurms net Fluoreszenz durch seine Gesamtfläche. Die Ergebnisse werden als Fluoreszenzintensität, in beliebigen Einheiten (AE), pro Pixel dargestellt. Hinweis: Vermeiden Sie die Bilder im JPEG-Format exportieren. Während Kompression Dateien übersichtlicher macht zu speichern, ist die Integrität der Daten durch dieses Format gefährdet. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder modifiziert und identisch analysiert sind. Denken Sie daran, eine Maßstabsleiste um Größe bei verschiedenen Vergrößerungen richtig zu bewerten. Um Unterschiede in der Fluoreszenzintensität mit ImageJ besser zu visualisieren, wechseln Sie Bildtyp aus RGB 8-Bit zu und wählen Sie Feuer aus dem Menü "Bild Lookup Tabellen (LUT)". Dadurch entsteht eine Heatmap Bild in welcher erhöhte Farbe Helligkeit mit erhöhten Fluoreszenzintensität korreliert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Öl rot O Färbung (ORO) von Lipiden
<ol><li>Vorbereitung der ORO-Stammlösung<ol>
<li>In einer 250 mL Flasche 100 mL 100 % Isopropanol 500 mg Pulver ORO hinzufügen und gut verrühren.</li>
		<li>Nachdem vorbereitet, speichern Sie die Lösung, die dicht mit keine Belichtung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Arbeitslösung ORO<ol>
<li>ORO-Stammlösung in Wasser (3:2) zu 60 % Isopropanol zu verdünnen.</li>
		<li>Vor dem Gebrauch filtern Sie die Arbeitslösung ORO durch einen 0,2 µm Celluloseacetat sterile Spritze filter Hinweis: Für beste Lösungsqualität bereiten Sie Arbeitslösung ORO am Vortag vor, und lassen Sie es über Nacht mischen. Jedoch wenn Lösung benötigte gleichentags, verdünnen Sie und mischen Sie ORO Lösung auf einer Wippe für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch. Wickeln Sie vor Schaukeln, konische Rohr in Paraffin Band zum Auslaufen der ORO-Lösung zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Würmern ORO Lipid Färbung<ol>
<li>Wachsen Sie die Würmer bei 20 ° C auf Nematoden Wachstumsmedium (NGM) mit späten Log OP50 E. Coli , gewünschte Lebensstadium ausgesät.</li>
		<li>Die Platte 1 mL PBST-Lösung hinzu und schwenken Sie, bis alle Würmer aus der Platte sind. Kippen Sie die Platte und waschen Sie ihn mit 1 mL der PBST. Übertragen Sie die Wurm-Aussetzung zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch.</li>
		<li>Zentrifuge, die Würmer bei 560 X g für 1 min. den Überstand entfernen ohne Pellets und wiederholen Sie die Reinigung Schritt mit 1 mL PBST dreimal zu stören. Entfernen Sie alle überstand aber 100 µL.</li>
		<li>Das Wurm-Pellet 600 µL 40 % Isopropanol hinzu und bei Raumtemperatur 3 min rock.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Würmer auf 560 x g für 30 s und entfernen alle überstand aber 100 µL ohne Unterbrechung der Wurm Pellet. Hinweis: Verwenden Sie höhere Volumina der PBST Würmer von Tellern zu waschen, wenn Hochdurchsatz-Färbung zu tun. Waschen Sie Würmer in PBST mehr als 15 min vor der Probe Fixierung nicht. Weitere Waschungen zu tun, wenn Überstand der Bakterien nicht deaktiviert ist. Inkubation in 40 % Isopropanol mit einem Nutator oder Wippe durchführen. Immer überwachen Sie Röhren, um sicherzustellen, dass vollständige Probe Erregung stattfindet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid Färbung mit ORO<ol>
<li>Jede Probe 600 µL ORO Arbeitslösung hinzufügen. Invertieren der Röhre dreimal und die Würmer in ORO gut mischen.</li>
		<li>Drehen Sie die Proben bei 30 u/min für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 560 X g für 1 min und beseitigen Sie alle überstand aber 100 µL.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie Proben in 600 µL PBST und drehen Sie der Rohre bei 30 u/min für 30 min um überschüssige ORO Fleck zu entfernen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Proben bei 560 X g für 1 min und beseitigen Sie alle, aber 50 µL überstand.</li>
		<li>Um den Speicherort der Keimbahn und Darmzellen des Tieres besser zu unterscheiden, Fleck Kerne durch Zugabe von 1 µL (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-Indol-6-Carboxamidine) (DAPI) für jeden 1 mL ORO funktionierende Lösung. ORO Färbung für 2 h mit dem Hinzufügen von DAPI vor der Montage der Folien für die Bildgebung durchführen. Intestinale Kerne sind größer und die Gonade zeichnet sich durch die entwickelnden Keimzellen. Hinweis: Nach ORO Färbung, können Würmer halten an den Seiten des Microfuge Rohres und nicht zu einen spürbaren Pellet bilden. In diesem Fall Zentrifugieren Sie die Würmer wieder oder lassen Sie Würmer durch die Schwerkraft für mindestens 10 min zu begleichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Folien auf Wurm imaging<ol>
<li>Aufschwemmen Sie der Würmer im restlichen überstand und mischen Sie die Lösung gut.</li>
		<li>5 µL der Wurm Aussetzung auf einen Objektträger und stellen Sie einem Deckgläschen sorgfältig, um sicherzustellen, dass keine Form Luftblasen.</li>
		<li>Das Deckglas mit Nagellack und Bild Würmer zu versiegeln. Hinweis: Nach Fixierung und Färbung, können Würmer sehr steif und schwer zu pipette sein. Um dies zu umgehen, stellen Sie weite Bohrung Pipetten durch das Abschneiden ihrer Spitzen.</li>
		<li>Speichern Sie die Folien in einem Mikro-Zentrifuge Rack bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, wenn nicht sofort nach dem Färben imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildgebung der ORO-gefärbten Würmer<ol>
<li>Verwenden Sie eine Farbe-fähigen Kamera Bild ORO-gefärbten Würmer.</li>
		<li>Verwenden Sie 5 X Vergrößerung, um mehrere Würmer in einem Blickfeld Bild.</li>
		<li>Wechseln Sie zu 10-facher Vergrößerung für bessere Prüfung der einzelnen Würmer.</li>
		<li>Exportieren Sie Bilder im TIF-Format, um Datenverlust durch Kompression zu vermeiden. Hinweis: Wenn Färbung mit ORO + DAPI, wechseln Sie die Farbe-fähigen Kamera zu einem, die Fluoreszenz erfassen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildanalyse von ORO-gefärbten Würmer<ol>
<li>Laden Sie Micrograph(s) auf ImageJ. Verwenden Sie im Pulldown-Menü Plugins die Bio-Formate-Funktion, wenn die Image-Datei nicht erkannt wird.</li>
		<li>Verwenden Sie in der Bild-Pull-Down-Menü unter dem Stapel-Funktion Bilder-Stack, um einem Bildstapel zu erstellen, wenn mehrere Aufnahmen verglichen werden.</li>
		<li>Passen Sie Helligkeit/Kontrast unter der gleichen Pull-Down-Menü zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Lipid-Tröpfchen.</li>
		<li>Kategorisieren Sie die Bilder nach Lipid-Akkumulation im gesamten Körper des Tieres oder in bestimmten Geweben.</li>
		<li>Zur besseren Beurteilung des Lipid-Lokalisierung und für die Identifizierung von unspezifischen Bildartefakte mit ImageJ wählen Sie die Farbe-Funktion unter dem Pulldown-Menü "Bild" und klicken Sie auf Stapel zu RGB, die Signale der einzelnen RGB-Komponenten zu zeigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Der Anstieg der Adipositas und metabolische Krankheit Preise macht C. Elegans ein geeignetes Modell, die Mechanismen zu studieren, die Fettansammlung in Zellen und Geweben zu regulieren. Aktuelle Hinweise darauf, dass die Änderungen im Blutfettwerte mit zellulärer Prozesse von Insulin Signalisierung8, die Aktivierung der Hormon-Rezeptoren als2Reproduktionsleistung5korreliert sind. Im Vergleich zu markierungsfreie Mikroskopie und Chromatographie Methoden, Nil rot und Öl rot O sind relativ kostengünstig Farbstoffe, neutralere Lipiden im Wurm konsequent zu beflecken und reproduzierbar10,12,13. Die erste ermöglicht die Quantifizierung der gesamten Blutfettwerte, während die zweite die Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den Geweben wie der Unterhaut, Darm und die Keimbahn ermöglicht. Bei Verwendung in Verbindung ermöglichen NR und ORO die Forscher um festzustellen, wie Genotyp und Umweltveränderungen Lipid Ansammlung beeinflussen und wo in der Wurm diese Veränderungen auftreten.
Diese Farbstoffe jedoch bewerten direkt Lipid-Ansammlung in der gleichen nicht-invasive Weise nicht wie Autos Mikroskopie12. Daher, sie sind anfällig für Fehler während der Fixierung und Färbung, beeinträchtigen die Messung Genauigkeit13. Darüber hinaus können versehentlich diese Farbstoffe interagieren mit dem Lipofuszin und Darm Granulat, wodurch Fluoreszenz, die in keinem Zusammenhang mit intrazellulären neutrales Fett speichert10,14. Darüber hinaus kann nicht in den Fällen wo die Blutfettwerte gering erscheinen NR und ORO Färbung unterscheiden, ob das Ergebnis ergibt sich aus Fragen der Durchlässigkeit oder Fettansammlung reduziert. Darüber hinaus erfordert die Empfindlichkeit dieser Flecken zum Vorschein besonderen Maßnahmen während der Lagerung und aktiven Umgang mit dieser Grenze den Abbau und Foto bleichen. Allerdings ist Vorsicht bei der Durchführung und Schlussfolgerungen von Label-based Assays, NR und ORO Färbung sind hervorragende Mittel, vorwärts genetischer Bildschirme Lipid-Stoffwechsel-Wege zu studieren und überprüfen ihre Interaktionen mit anderen physiologischen Funktionen. Daf-2 und Fett-6 Würmer wird empfohlen, der erhöhte und verminderte Lipid Akkumulation bzw. relative Vergleiche. Das Waschen und fixieren Schritte für NR und ORO Färbung ähneln. Daher können beide am selben Tag ausgeführt werden. Allerdings können nur die Folien mit ORO-gefärbten Würmer gespeichert werden, für imaging später da NR Färbung nach 6 h inkonsistent ist. Während des Waschens ist es entscheidend, Triton 100-X nicht nur um die Durchlässigkeit für NR und ORO zu verbessern, sondern auch um den Wurm durch übermäßige Einhaltung Plasticware zu vermeiden sind. Darüber hinaus sollten die Würmer weniger als 30 min gewaschen werden, vor der Färbung um maximale Durchlässigkeit zu jeder Fleck zu gewährleisten. Während NR und ORO Inkubationszeiten auf 1 h und 30 min, bzw. reduziert werden können, wird es vorgeschlagen, in diesem Artikel einheitlicher Färbung und imaging Ergebnisse folgen aufgefordert. Längerer Exposition NR Lösung Licht-und Nichtbeachtung der ORO-Lösung zu filtern, bevor Nutzung Hintergrundfluoreszenz während der Bildgebung zunehmen wird. Durchführung dieser Färbung Protokolle erfordert ca. 3-4 h neben bildgebenden Zeit. Aber Fleck Inkubation höchstens 2 Stunden Pause zwischen den Schritten bietet, es wird dringend empfohlen, dass die Protokolle möglichst viele Fehlerquellen in allen Farbstoff-basierenden Methoden der Lipid-Quantifizierung zu reduzieren mit möglichst wenigen Unterbrechungen durchgeführt werden und Prüfung.

Lipide sind lebensnotwendig. Sie sind integrale Bestandteile von Membranen, fungieren als sekundäre Botenstoffe und signal-Wandler und haben wichtige Funktionen der Energiespeicherung. Wenn Fettstoffwechsel Dysregulated ist, führt dies zu Krankheiten wie Adipositas und Diabetes Typ II, die öffentliche Gesundheit Bedenken9drücken. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine ausgezeichnete Modellorganismus in der Fettstoffwechsel zu studieren, weil es eine relativ kurze Lebensdauer, ein transparenter Körper, eine bekannte Zelle Abstammung und ein vollständig sequenzierte Genom hat. In erster Linie ein Hermaphrodit, C. Elegans erlaubt es den Forschern zu zahlreicher isogenen Tiere in kurzen Zeiträume Mitnahmeservice Hochdurchsatz-vorwärts genetischer Bildschirme, eine breite Palette von metabolischen Gene und Wege4zu studieren. Dieser Ansatz hat ein hohes Maß an Schutz in 273 C. Elegans -Lipid-Stoffwechsel-Genen zwischen Menschen, Mäuse, Ratten und Drosophila ergeben. Darüber hinaus haben mehr als 300 Lipid-Gene in C. Elegans menschlichen Orthologe, die mit Krankheiten, die in keinem Zusammenhang mit metabolischem Syndrom11verbunden sind. Prüfung der Lipid-Lagerung in C. Elegans hat traditionell meist auf Farbstoff-markierten Assays, gestützt, die robuste über Lipid-Ansammlung Auskunft. Seltener ist eine Beschreibung von Lipiden wo lokalisieren und gemessenen Unterschiede in Hülle und Fülle Lipid über Gewebe. Neuere Arbeiten ergaben jedoch, dass Lipid Verteilung genauso wichtig wie Lipid Ansammlung6sein kann.
In letzter Zeit Studien haben begonnen, Integration von Methoden wie hohe Leistung flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und kohärente Anti-stokes Raman-Streuung (Autos) Mikroskopie an Adresse der Mängel der Fleck-basierte Ansätze direkt analysiert den Inhalt der Lipid-Extrakte, spezielle Lipid Brüche und Lipid Ablagerungen, bzw.10,11. Darüber hinaus hat CARS-Mikroskopie ergeben, dass Nils rot nur als Proxy für Fettansammlung Verwendung als Fixativ Farbstoff, für den Einsatz als ein wichtige Fleck zum Ziel-Färbung des Auto-fluoreszierende Organellen10 führtdienen kann. Jedoch die erforderliche technische Know-how und Kosten im Zusammenhang mit diese Chromatographie und Mikroskopieverfahren nutzen ihre unhaltbar für viele Fragestellungen. In diesem Artikel besprechen wir eine bequeme und sichere Methode zum fixieren und neutral Lipid-Ablagerungen in C. Elegans mit Nil rot färben und Öl rot O um Lipid Fülle in ganze Tiere und in bestimmten Geweben zu unterscheiden.
Nil-rot, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, ist ein Benzophenoxazone Farbstoff, der leicht löst sich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, aber meist in Wasser unlöslich. Es ist eine ausgezeichnete Lysochrome Farbstoff verwendet, neutralere Lipiden wie Triglyceride zu beflecken oder Cholesterin Ester da freuen Sie sich auf eine starke Farbe solubilisiert gut in Lipiden, hat vernachlässigbare Interaktion mit umgebenden Gewebe und ist weniger löslich im Lösungsmittel als in Lipide. Es verfügt über eine Anregung und Emission Maxima von 450-500 und 520 nm, bzw.1. Bei Nil rot gefärbten C. Elegans für grüne Fluoreszenz angezeigt wird, können diskrete Lipid Körper beobachtet in den Darm und anderen Geweben entweder in Clustern oder gleichmäßig verteilt, je nach Genotyp oder experimentelle Behandlung des Tieres 7.
Öl rot O ist ein Lysochrome, fettlösliche Färbemittel verwendet, Triglyceride und Lipoproteine zu beflecken. Es ist eine Azo-Farbstoff genannt, weil seine chemische Struktur zwei azo Gruppen an drei aromatischen Ringen befestigt enthält. Es ist schwer zu ionisieren, das macht es sehr löslich in Lipiden. Seine Fleck Farbe ist rot und seine maximale Lichtabsorption 518 nm 3. C. Elegans gebeizt mit Öl rot O zeigen rote Lipid-Tröpfchen, die sich gegen das Tier durchsichtigen Körper, die qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den verschiedenen Geweben6erleichtert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

Caenorhabditis Elegans ist eine außergewöhnliche Modellorganismus in der Lipidstoffwechsel und Energie-Homöostase zu studieren. Viele seiner Lipid-Gene sind beim Menschen konserviert und metabolisches Syndrom oder anderen Krankheiten zugeordnet werden. Prüfung der Lipid-Akkumulation in diesem Organismus kann durch Fixativ Farbstoffe oder markierungsfreie Methoden durchgeführt werden. Fixativ Flecken wie Nil rot und rot O Öl sind preiswerte, zuverlässige Methoden zur Messung quantitativ Blutfettwerte und qualitativ Lipid-Verteilung über Gewebe, bzw. zu beobachten. Darüber hinaus erlauben diese Flecken für Hochdurchsatz-Screening von verschiedenen Lipid-Stoffwechsel-Gene und Wege. Darüber hinaus ihre hydrophoben Natur erleichtert Lipid Löslichkeit, Interaktion mit der umgebenden Gewebe reduziert und Dissoziation in das Lösungsmittel verhindert. Obwohl diese Methoden effektiv bei der allgemeinen Fettgehalt zu prüfen sind, bieten sie keine detaillierte Informationen über die chemische Zusammensetzung und Vielfalt der Lipid-Ablagerungen. Für diese Zwecke markierungsfreie Methoden wie GC-MS und CARS-Mikroskopie besser geeignet, deren Kosten trotz.

SKN-1 ist ein bZip, zellschützenden Transkriptionsfaktor, der teilt Homologie mit Säugetieren NRF2 und hat gezeigt, dass Fettsäureoxidation vermitteln. Abhängig von der Glukosekonzentration in ihrer Ernährung zeigen Würmer mit einer konstitutiv aktivierten Skn-1 Allel verschiedene Blutfettwerte bei Nil rot7klebt. Abbildung 1A -C zeigt aktivierten Skn-1 -Tiere, die Bedingungen, die zur Erhöhung der Blutfettwerte führen ausgesetzt. NR Fluoreszenz mit einem FITC/GLP-Kanal erfasst ist prominent entlang der Darm ist jedoch in den Kopf, Schweif und Darmlumen dimmer. Blutfettwerte zu erhöhen, sind diskrete NR-gefärbten Partikel schwieriger zu erkennen, die erfordern geringerer Belichtungszeiten. Obwohl diese Methode für Lipid Akkumulation Fluoreszenzintensität als quantitative Proxy verwendet, es ist nicht ausreichend unterscheiden, unspezifische Färbung der zellulären Strukturen, die nicht Fett speichert und ist anfällig für Störungen durch intestinale Auto signal Fluoreszenz. Daher müssen alternative Label und nicht-Label Methoden werden parallel verwendet, um neutrale Lipide in den tierischen10eindeutig zu quantifizieren.
Altersabhängigen somatischen Abbau von Fett (Asdf), ist, dass ein Phänotyp, der Auftritt im Alter von Worms, wobei Tiere anzeigen, Körperzelle Lipide, verringert, während Keimzelle Lipide unverändert6bleiben. Öl rot O Färbung ist keine Methode, die zuverlässig quantifiziert Blutfettwerte, sondern eignet sich hervorragend für die Visualisierung von Lipid-Lokalisierung und ist nützlich für die Bestimmung von Fett Abbau Phänotypen wie Asdf im Wurm. Während es leicht, die Würmer nach dem Vorhandensein oder Fehlen von Asdf zu kategorisieren, es möglicherweise schwierig, Tiere mit mittlerer Fettabbau (Abbildung 2A) zu identifizieren. Im Vergleich zu nicht-Asdf Tieren, die leuchtend roten Färbung im ganzen Körper mit einigen transparenten Bereiche (Abb. 2 b) zeigen, weisen Asdf Würmer bemerkbar Fett Abbau in Darmzellen (Abbildung 2). Tiere in den Prozess der Entwicklung von Asdf (Abb. 2D) oft zeigen durchscheinende Flecken, wo die meisten Fettabbau schließlich auftritt. Darüber hinaus können Asdf Würmer noch verfügen über helle rote Färbung in den Kopf und Schweif, da der Phänotyp durch komplette somatische Fettabbau, sondern durch umfangreiche Fett Abbau im Vergleich zu nicht-Alter (Asdf) Tiere nicht definiert ist. Die Verwendung von Öl rot O Färbung, ermöglicht somit qualitative Bestimmung der Lipid-Lokalisierung und Identifizierung von Phänotypen, die Fettdepots im Wurm wesentlich verändert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57352/57352fig1.jpg"> Abbildung 1: Färbung von Lipiden von Nil-rot Nil rote Färbung des aktiviert Skn-1 Mutanten unter Bedingungen, die erhöhte Lipid Akkumulation (A-C) zu entlocken. Der Gewinn der Funktion Skn-1 -Stamm (lax188) birgt eine E237K Aminosäure-Substitution, der SKN-1 konstitutiv aktiv macht. L4-Stadium Würmer waren 0, 15 und 30 J/m2 UV-Licht, gefolgt von einer 12-h-Erholungszeit auf ungesetzte NGM Platten vor NR-Färbung und Bildgebung ausgesetzt. Die gezeigten Bilder sind repräsentativ für den Phänotyp. Lipid-Quantifizierung erfolgte, wie bereits in Abschnitt 1.7. Feuer ist eine ImageJ Look-up Table (LUT) verwendet, um ein Wärmebild erstellen, Fluoreszenz Intensität Unterschiede zwischen den Bildern angezeigt. Merge zeigt FITC/GLP und DIC Bildern kombiniert. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität für jedes Bild erscheint am unteren Rand der Bild-Montage. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57352/57352fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57352/57352fig2.jpg"> Abbildung 2: Färbung der Lipide durch Öl rot O. Öl rot O Färbung des Skn-1 Mutanten (lax188) zeigen das Vorhandensein oder Fehlen des Phänotyps Asdf (A-D) aktiviert. A & D zeigen Tiere mit mittleren Asdf Phänotypen. B & C zeigen entgegengesetzte ORO-Färbung. B nicht-Asdf ist, zeigt C erhebliche somatische Fett Abbau mit gleichzeitige Erhöhung in Keimbahn Fettansammlung, die Asdf Phänotyp definiert. Die Würmer waren voller Flecken mit ORO gefolgt von imaging-144 Hafter L1 synchronisiert Tiere wurden auf NGM Medien ausgesät mit OP50 Bakterien gelegt. Die gezeigten Bilder sind repräsentativ für Tiere mit oder ohne die Asdf Phänotyp. Inset Karikaturen sind von Lynn, Et Al. geändert. 6 und repräsentieren die (B) oder Abwesenheit (C) der somatischen Fett-Abbau. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57352/57352fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Nil rote Färbung der festen Caenorhabditis Elegans ist eine Methode zur quantitativen Messung der neutral Lipid Ablagerungen, während Öl rote Färbung O qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den Geweben ermöglicht.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.0K Aufrufe.  University of Southern California. Nil rote Färbung der festen Caenorhabditis Elegans ist eine Methode zur quantitativen Messung der neutral Lipid Ablagerungen, während Öl rote Färbung O qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den Geweben ermöglicht.

Serie: Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Forschung

Biologie

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The carotid bodies (CB), a key organ of peripheral hypoxic sensitivity, express the long functional isoform of leptin receptor (LepRb) but the role of leptin signaling in control of breathing has not been fully elucidated. We examined the hypoxic ventilatory response (HVR) (1) in C57BL/6J mice before and after leptin infusion at baseline and after CB denervation; (2) in LepRb-deficient obese db/db mice at baseline and after LepRb overexpression in CBs. In C57BL/6J mice, leptin increased HVR and effects of leptin on HVR were abolished by CB denervation. In db/db mice, LepRb expression in CB augmented the HVR. Therefore, we conclude that leptin acts in CB to augment responses to hypoxia.

Our study focuses on the effects of leptin signaling in carotid body (CB) on the hypoxic ventilatory response (HVR). We performed &#39;loss of function&#39; experiments measuring the effect of leptin on HVR after CB denervation and &#39;gain of function&#39; experiments measuring HVR after overexpression of the leptin receptor in CB.

Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Leptin-Signalisierung in den Carotis-Körpern und ihrer Auswirkungen auf die Kontrolle der Atmung

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...