Name: assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Caenorhabditis genetik Merkezi suşları, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Vakfı için yenilik (finansmanı için CFI) teşekkür etmek istiyorum. Dr. Lizhen tüm C. elegans deneyler için onun laboratuar İmkanları sınırsız kullanımına izin veren için Chen (hücre sistemleri bölümü ve anatomi, UT sağlık San Antonio) yanı sıra Dr Exing Wang (müdür, optik görüntüleme tesis teşekkür etmek istiyorum UT sağlık San Antonio) confocal mikroskobu konusunda yardım almak için. Biz de doktor Myron Ignatius destek ve video çekimi kolaylaştırmak için cesaret verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum.

1. leke ve bağırsak organellerin görüntü
<ol><li>Tohum nematodunun büyüme medya (NGM) ile OP50 tabaklar
	<ol>
<li>NGM tabak başı olarak önerilen protokolü19 hazırlamak ve oda sıcaklığında 2 gün kuru kapalı plakalara sağlar.</li>
		<li>OP50 bakteri steril Luria suyu (LB) suyu aşılamak ve titreyen bir inkübatöre veya su banyoda 37 ° c 36 h ya OD 0,2 0,4 aramda kadar büyür. Bir bakteri kültürü ile OD kullanmaktan kaçının > 1 veya OD < 0,2.</li>
		<li>NGM tabak kuru olduğunda, OP50 inoculum Merkezi plaka üzerine bir damla (~ 30 µL) yerde ve daha sonra yaklaşık 2 cm x 2 cm boyutunda bir yama içine damla yayılırlar. Not: Herhangi bir kalan OP50 inoculum 4 ° C'de için bir ay kadar saklanır.</li>
		<li>İnoculum (yaklaşık 10-15 dk) kuruduktan sonra OP50 plakaları ters çevir ve plakaları için 36 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>36 h sonra plakaları kuluçka ve mağaza 4 ° C'de daha sonra kullanmak kadar kaldırın. Not: Tabakları 4 ° C'de 1 ay için iyi olmalıdır</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA OP50 için ilave
	<ol>
<li>CDCFDA OP50 plakalar üzerine ek 10 mM cDCFDA Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir çalışma hazır hazır olun. Işık ve daha sonra kullanmak için-20 ° C'de mağaza korunuyorsunuz cDCFDA çözüm tutmak.</li>
		<li>Öyle ki tüm yama düzgün cDCFDA ile kaplıdır yavaşça 100 µL 10 mM cDCFDA çözüm 2 cm x 2 cm OP50 yama yüzeyine yerleştirin. Not: OP50 tüm yama cDCFDA ile kaplıdır çok önemlidir. Gerekirse, cDCFDA 150 µL her plaka için kullanın. OP50 yama dışarı akar herhangi bir cDCFDA yemek dahil değil ve azaltılmış boyama şiddeti neden olur bu yana cDCFDA çözüm OP50 yama, sınırların ötesinde kapsamaz zorunludur.</li>
		<li>Tüm cDCFDA çözüm absorbe kadar bakteriyel yama tezgah üstüne koyu bir kutu içinde OP50 tabak koyun (genellikle yaklaşık 25-30 dakika).</li>
	</ol></li>
	<li>Solucan cDCFDA kullanarak boyama
	<ol>
<li>Bir kez cDCFDA tamamen OP50 yama nüfuz, plaka başına 20'den fazla solucanlar yerleştirin ve en az 14 h 20 ° C'de ters plakaları kuluçkaya. Not: Bu cDCFDA plakaları yakmak için pozlandırmayı en aza indirmek için opak bir kutuya koyun önerilir.</li>
		<li>Deneyler arasındaki farklar alımı için kontrol etmek ve cDCFDA sinyalleri, normalize etmek (önerilen) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) () ile ortak leke difluoro) Bor (bir taze yapılmış 1 mM çözüm 2.5 µL), kimin Floresans asidik pH spektrum üzerinde büyük ölçüde değişken olmayan olduğunu bir acidotropic zayıf Amin boya ( Malzemeler tablo bkz: reaktifler ortak adları için). Not: Bu yetersiz cDCFDA boyama yoğunluğunu sağlamak ve yanlış yorumun lizozomal pH vermek beri solucanlar az 14 h için leke değil.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytlar mikroskopi için hazırlanıyor
	<ol>
<li>Teyp yaklaşık 3 inç apart pürüzsüz düz bir yüzeye, bir ayna (şekil 1) gibi etiketleme iki paralel şeritler yerleştirin.</li>
		<li>Su geçirmez sprey ile ayna yüzeyine ceket ve fazla sıvı temizle.</li>
		<li>(Çözünmüş distile H2O) % 2 özel bir mikrodalga tamamen sıvılaşmış kadar erime sonra teyp iki şeritler arasında özel bir 50 µL damla koyun ve öyle ki slayt dikey şeritler için hızlı bir şekilde mikroskop kaydıraklı, açılan kapak kaset. Özel katılaşmış sonra oluşturan dairesel bir yastık altında slayt, slayt ters çevirin ve 5 mM sodyum azid (NaN3) özel yastık üzerine 10-15 µL ekleyebilirsiniz. Not: NaN3 sitokrom C inhibitörü olduğunu o zaman düşük konsantrasyonlarda kullanılır, böylece onlar görüntüleme sırasında hareket etmez geri dönülebilir olarak solucan anesthetizes.</li>
		<li>Solucan cDCFDA ile desteklenmiş OP50 plaka almak ve herhangi bir OP50 olmadan temiz bir NGM plakasına aktarmak. Solucanlar solucan yüzeyinden kaldırılacak OP50 çoğunu izin vermek bir kaç saniyeliğine taşımak izin ve sonra 5 mM sodyum azid içeren özel yastık solucanlar aktarın.</li>
		<li>Hemen özel yastık bir kapak notu ile kapak. Bu solucan patlama neden olabilir bu yana çok fazla baskı uygulamadan kapak notu yavaşça yerleştirdiğinizden emin olun. Not: cDCFDA ile desteklenmiş OP50 bakteri mikroskobu tarafından görüntülenir zaman bulabilsem, bu nedenle solucanların en iyi temizlemek mümkün olduğunca sodyum azid içeren özel yastık bunları yerleştirmeden önce önemlidir. 6'dan fazla (N2, vahşi türü denetimi de dahil olmak üzere) C. elegans suşları prepping, böylece solucanlar özel yastık üzerinde kurumasına olduğunu sağlamak için 6, toplu halde örneklerinde hazırlamak için tavsiye edilir. Bazı suşları vulva kapak notu baskısı nedeniyle uzun bir süre sonra buna göre planlamak önemlidir bu yüzden rüptürü başlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Confocal mikroskobu Not: Bazı mikroskoplar otomatik olarak artırır floresan yoğunluğu Floresans çeşitli düzeyleri için telafi etmek için yerleşik bir özelliği var. Böyle mikroskoplar de doğal olarak örnekleri floresan yoğunluğu artacak bu yana cDCFDA ile lekeli solucanlar görüntüleme için çalışmayabilir.<ol>
<li>488/530 için ayarla uyarma/emisyon dalga boylarında kullanarak standart confocal mikroskop düşsel gerçekleştirmek nm cDCFDA için. Uçak bağırsak organellerin (değil Z-yığınlar) görüntülerini alın ve odak (maksimal sinyal yoğunluğu) yoğunluk miktar için çoğu organellerin kullanın. Not: Belki de boya kullanılabilirlik farklılıkları nedeniyle, bağırsak hücreleri için farinks doğrudan arka organellerin yoğunluğu ne olursa olsun genotip veya yaş boyama cDCFDA korumak, dolayısıyla bu hücrelerde organellerin Imaging önlemek için özen gösterilmelidir.</li>
		<li>2 gün eski vahşi N2 ilk solucanlar türünü içeren slayt görüntü. Bunu yaparken de, lazer gücü, iğne deliği ve diyafram yoğunluğu boyama cDCFDA değil doygun olduğunu emin olmak için gibi confocal görüntüleme parametreleri ayarlayın. Not: Bu ayarlar ayarladığınızda, onları o gün için görüntüleme tüm süresince değiştirmeyin.</li>
		<li>Bağırsak (solucanı başına 3-4 görüntü) tek bir uçağın 1024 x 1024 piksel çekim bir 60 X büyütme objektif kullanarak. Not: Solucan cDCFDA emisyon spektrumunda 520 nm rastlayan bağırsak autofluorescence (şekil 3) ayrı bir belirli sinyal okuma sağlayan onun bildirilen Floresans spektrum20ile tek bir önemli en yüksek verim.</li>
		<li>RAW confocal resim (.lsm dosyaları) her kanal için .tiff dosyası olarak dışa aktarın.</li>
		<li>Daha sonra ImageJ açın ve dosyasını tıklatın | Açık sayısal için görüntü dosyası açmak için. Görüntü yükler sonra oval şekil seçim aracını ImageJ içinde faiz (ROI) bir bölge seçmek için kullanın.</li>
		<li>Bundan sonra tıklayın analiz | Ölçü floresan yoğunluğu için ki ROI ölçmek için. 4 – 5 farklı, odakta organellerin resim başına seçin ve faiz (ROI) her bölgede ortalama göreli floresan yoğunluğu hesaplayın.</li>
		<li>Her görüntü için arka plan floresan yoğunluğu arasında organellerin bağırsak bölgesinde ölçmek. Arka plan Floresans yoğunluk değerleri lizozomal Floresans yoğunluk değerleri üzerinden çıkarma.</li>
		<li>Toplamda, yaklaşık 30-50 normalleştirilmiş değerlerini cDCFDA yoğunluğu (6-10 hayvanlar) test edilen her zorlanma için ayrı ayrı toplamak. Bu değerler herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak bir kutu ve bıyık arsa çizmek için kullanın. Not: floresan yoğunluğu karşılaştırmalar yalnızca aynı boyama deneme sürecinde örnekleri içinde anlamlıdır öyle ki boyama önemli ölçüde sıcaklık, kuluçka süresi ve genel sağlık/yaş hayvan gibi faktörlere bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle boyama her denemede denetimleri işlemek önemlidir. İstatistiksel farklar hesaplama (t-testleri) herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak.</li>
		<li>Görüntü tüm (aynı gün lekeli) aynı deneme görüntüleme parametrelerden birini değiştirmek için dikkat çekici sırayla suşları.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants.">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li><li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+the+avoidance+of+neurodegeneration.">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li><li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration.">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li><li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+the+importance+of+maintaining+&amp;#34;clean&amp;#34;+cells.">Autophagy and aging: the importance of maintaining &amp;#34;clean&amp;#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li><li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson's+disease.">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li><li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+neurodegeneration:+a+critical+role+for+molecular+chaperones?.">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?.</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+chaperone-mediated+autophagy.">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li><li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process.">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li><li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging.">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+function+and+dysfunction:+mechanism+and+disease.">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function.">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li><li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease.">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age?.">How do intracellular proteolytic systems change with age?.</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+lysosomes+get+old.">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li><li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=btn1,+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3,+regulates+vacuole+homeostasis.">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants.">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li><li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast.">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li><li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li><li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li><li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence.">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li><li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging:+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis.">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li><li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8++T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells.">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li><li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice.">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li><li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+basis+of+lipofuscin,+ceroid,+and+age+pigment-like+fluorophores.">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li><li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function.">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Hücresel ve moleküler olayları çeşitli katkıda bulunmak için yaşlanma, yaşam öyküsü özellikleri ve genetik faktörlerden etkilenir. Bizim son çalışma22 üreme döngüsü lizozomal pH dynamics düzenlenmesi aracılığıyla soma fitness denetlenmesinde önemli bir rol oynar öneriyor. Biz hayvanlar aktif olarak sırayla asidik organellerin sağlar v-ATPaz transkripsiyon upregulation tarafından yeniden iken o lizozomal aracılı proteolizis yükseltilir gösterdi. Üreme, v-ATPaz ifade damla, sonu üzerine organellerin alkalinize ve protein toplamları bu hücrelerinde birikir.
Lizozomal asitleştirme zarar bozuklukları değişmiş v-ATPaz aktivitesi tarafından neden olduğu gösterilmiştir ve v-ATPaz işlevi beyinde azalan Ayrıca çeşitli nörodejeneratif hastalıklar23altında yatan için önerilmiştir. Sonuçlarımız daha da hipotezini Engelli v-ATPaz işlevi hücresel yaşlanma ve yaşlanma24nedenleri arasında destekler.
Bir saytolojik yaşlanma hücreleri misfolded ve toplanan proteinler ilerici oluşumu eski hücreler1,25,26,27,28,29özelliğidir. Post-Reproductive C. elegansolduğu gibi benzer protein toplamları geçit memeli kültürlü lizozomal Lümen içinde geç bulunan27,29hücreleri. Organellerin autophagic yolu terminal bitiş noktası olduğundan, hasarlı proteinler ve organelleri alkalinized organellerin içine sürekli akını sonra diğerine yol açar bu organellerin fonksiyonel çöküşü sonuçlanan akla yatkın Sonuçta hücresel yaşlanma için katkıda aşağı akım olaylar.
Burada açıklanan protokol göreli Asitlik basit ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi canlı bağırsak organellerin üretmek için tasarlanmış C. elegans. Dar pH aralığı (4,5-5) bu organelleri uygun proteolizis için gereklidir çünkü pH ince artışlar cep ve doku homeostazı17için dramatik sonuçları var. Floresans özellikleri ve cDCFDA düşük pka sağlar bu fizyolojik ilgili pH pencere18asitliği değişiklikleri yakalamak bu boya. Organellerin boyama için önerilen cDCFDA konsantrasyonu lizozomal pH bizim görüntü parametreleri ve görüntüleme sistemi bağlı olarak değişiklikler en iyi olası okuma sağlamak için optimize edilmiştir. Öyle olsa bile, cDCFDA boyama sonuçlarını cDCFDA boyama desen lizozomal pH değişiklikleri doğru yansıtılmamış öyle ki onların görüntüleme kurulumu temel alınarak farklı son kullanıcılar için farklı olabilir. Bu olursa, elbette eylem en iyi en cDCFDA (10-100 mM) konsantrasyonları farklı varyasyonları görüntüleme için optimum konsantrasyonu belirlemek için kullanmak üzere olurdu vahşi türü N2 solucanlar 2 gün ve günde 8 mesaj L4. İdeal cDCFDA konsantrasyon organellerin genç (2. gün sonrası L4) Worms verimli bir şekilde doygun olmadan lekeleri ama aynı zamanda eski (günde 8 mesaj L4) solucanlar için azalan bir boyama yoğunluk gösterir biridir.
Bir cDCFDA boyama tekniği sınırlamaları onun uzun bir kuluçka zamanı geldi. Solucanlar bir belirli zamanda noktada inkübe zaman, bu sonuçlar yalnızca ~ 24 h sonra görüntülenmeyecektir. Muhtemelen bir pH duyarlı fluorophore lizozomal membran protein öğesini kullanarak lizozomal pH, gerçek zamanlı bir okuma sağlayan C. elegans bir tür geliştirmek için daha verimli olacaktır.
Orada iken birkaç farklı teknikler C. elegans, bağırsak pH değerlendirmek için bu tekniklerin çoğu bağırsak pH bir bütün30, değerlendirmek ya da zaman alan vücut boşluğu içine enjeksiyon gerektirir ve hantal31. cDCFDA büyük ölçüde genetik ekranlar bu değiştirilmiş Haritayı lizozomal pH veya Fizyoloji C. elegans mutantlar için aramak için beslenme RNAi kitaplıklarını kullanma için kolayca uygulanabilir. CDCFDA kullanılan ve bir genç (2. gün sonrası L4) eklediğinizden emin konsantrasyon bu yöntemin yalnızca önemli yönleridir N2 denetim zorlanma confocal görüntüleme her oturumu sırasında yapılandırma için bir kriter olarak.
Yaşlanma için lizozomal pH katkısını daha iyi anlamak için farklı hücresel ve çevresel girişlerine yanıt lizozomal Asitlik düzenleyici mekanizmaları arkasında dinamik değişiklikleri incelemek önemli olacaktır. cDCFDA boyama C. elegansaraştırmada genişletmek için bir strateji olarak kullanılabilir.

Protein toplamları görünümünü yaygın bir hallmark ökaryotik hücreler1,2,3ve hangi hücresel yaşlanma4 ilke sürücüleri arasında düşünülmektedir oluşumu yaşlanma olmak kabul , 5 , 6 , 7. yaş hücreleri gibi protein katabolizma protein toplama artışa önde gelen Engelli olduğunu büyüyen kanıtıdır. Hücrelerin yaşlanma içinde proteolizis çöküşü autophagy8 yanı sıra proteasome-aracılı protein yıkımı9bir bozulma içerir. Son olarak, geri dönüşü olmayan protein oksidasyon daha fazla protein katabolizma10bozulması eski hücrelerde artar.
Autophagy başlangıçta için toplu bozulma bozuk proteinlerin non-selektif bir süreç olduğu düşünülüyordu ama son yıllarda yapılan çalışmalarda bu autophagy çok seçici protein toplamları ve işlevsel olmayan organelleri olmayan katabolizma belirttiler mükellef bozulması diğer protein izni mekanizmaları11ile için. Autophagy işlemi sırasında zarar görmüş ve toplanan proteinleri autophagosome denilen bir çift-membran vezikül münzevi. Bu autophagosome sonra da autophagosome kargo12düşmesine neden organellerin, denilen asidik organelleri ile Sigortalar. Organellerin autophagic yolun son nokta temsil ve membran tamir, transkripsiyon kontrolü ve besin algılama gibi farklı hücresel süreçler iştirak; hücresel homeostasis (ref. 13 gözden) içindeki merkezi rolü vurgulayarak. Çeşitli çalışmalarda lizozomal işlevi bir yaş bağımlı azalma ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar13arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sürekli olarak, büyük hücrelerdeki lizozomal işlevi geri yükleme fenotipleri yaşlanma ile ilgili14,15başlangıçlı gecikme. İntralumen ortamın kompozisyonu çalışmalarının lizozomal büyük hücre işlevinde çöküşü lizozomal proteaz16üretim azalma nedeniyle değil öneririz. Alternatif olarak, intralysosomal asit, enzimatik faaliyet, kritik bir gereklilik kaybı lysosome-aracılı proteolizis17düşüş altında yatan önerilmiştir. Bu hipotez keşfetmek için güçlü olmak, reaktifler ve dinamik değişiklikleri canlı hücrelerdeki lizozomal pH yinelenebilir ve tutarlı bir şekilde soruşturma için protokolleri geliştirmek esastır.
C. elegans bağırsak solucanları önemli metabolik doku ve sistemik homeostazı ve ömrü kritik bir regülatör. Biz deneyleri değişikliklerini değerlendirip geliştirdik solucan nasıl lysosome-aracılı proteolizis belirlemek için bağırsak organellerin Lümen asitliği yaşlanmaya katkıda bulunur. PH-duyarlı fluorophores daha önce C. elegans içinde bağırsak organellerin işaretlemek için kullanılmıştır rağmen henüz küçük artışlar lizozomal pH vivo18'. algılayabilir başarılı bir iletişim kuralı kurmak çabası olmadı Burada, OP50 maması pH duyarlı fluorophore (cDCFDA) içeren basit ve uygun beslenme protokolü kullanarak lizozomal asit kaybı C. elegans bağırsak hücreleri algılamak için kullanılan bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>OP50 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-dichlorofluorescein diacetate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Commonly known as cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#039;H-2,2&#039;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Commonly known as Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Broth powder</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol powder</td><td>Sigma</td><td>C3045&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mirror or other smooth flat surface</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans (C. elegans) uzun ömür ve gelişim yolları çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmalar hayvan, ileriye ve geriye doğru genetik deneyleri, üreten fluorescently etiketli protein göreli kolaylığı ve ya erken microinjected floresan boyalar kullanımı yeteneği şeffaflık tarafından kolaylaştırdı embriyo veya hücre organelleri (örneğin phenoxazine-5-1 9-diethylamino-5 H-benzo (a) ve (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - etiketlemek için onun gıda (E. coli zorlanma OP50) içine dahil [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Burada, bağırsak organellerin, lekeleri floresan bir pH duyarlı boya kullanımı canlı solucanlar lizozomal asitliği dinamik, fizyolojik değişikliklerin görsel bir okuma sağlayan mevcut. Bu iletişim kuralı lizozomal pH ölçmek değil, ama oldukça fizyolojik alakalı varyasyonları lizozomal asitliği değerlendirirken, güvenilir bir yöntem kurmayı amaçlıyor. cDCFDA floresan fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) hidroliz üzerine tarafından hücre içi esterazlar dönüştürülür hücre permeant bir bileşiktir. Organellerin içinde Protonation cDCF içinde nerede biriken bu organelleri yakalar. 4.8 düşük onun pKa nedeniyle, bu boya Maya bir pH sensör olarak kullanılmıştır. Burada bağırsak organellerin asitliği değerlendirmek için bir gıda takviyesi olarak cDCFDA kullanımı açıklamak C. elegans. Bu teknik canlı hayvanlar, alkalinizing organellerin tespiti için izin verir ve deneysel uygulamalar yaşlanma, autophagy ve lizozomal Biyogenez çalışmalar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazesine sahiptir.

cDCFDA bir pH bağımlı şekilde organellerin lekeleri ve onun düşük pKa ve hazır Alım organellerin içine bir ideal pH sensör21yapar. cDCFDA yoğunluğu boyama lizozomal pH (Yani boyama yoğunluğu arttıkça pH azalır)18,22' ye ters orantılıdır. cDCFDA sinyalleri sürekli zayıf organellerin hayvanların klorokin, lizozomal asitleştirme bir inhibitörü 20 mM ile tedavi ve v-ATPaz, protein kompleksi için proton ithalat22 gereklidir organellerin membran üzerinde tükenmiş solucanlar . Bunlar diğer genetik arka planlar veya tedavi boyama cDCFDA göreli düzeylerini değerlendirirken kullanılacak önemli denetimlerdir.
Ayrıca açık hiçbir etkisi üzerinde fitness cDCFDA maruz kalma veya doğurganlık tedavi Worms (veri gösterilmez) bulun. Bu iletişim kuralını kullanan, post-reproductive vahşi türü Worms organellerin asitliği endojen bir kaybı tespit edilmiştir. 3 resimde görüldüğü gibi cDCFDA floresan sinyal genç (2 gün sonrası L4) organellerin içinde sağlam C. elegansacidified organellerin belirten, yeniden oluşturma. Boyama yoğunluğu oldukça eski (8 günlük yazı L4) solucanlar de olduğu gibi nerede proton akını içine bu organelleri azalır solucanlar (via nakavt vha genlerin v-ATPaz alt birimleri kodlama) içinde gözlemlediği gibi organellerin, alkalinization azaltır. Bu yöntemi kullanarak, lizozomal Asitlik fizyolojik bir kaybı post-reproductive hayvanlar ( Şekil 2, şekil 3Albümdeki Floresans diyagramında) bağırsak tespit ettik. İndirimli cDCFDA gün 8 (post-L4) bağırsaklarında alkalinized organellerin ve protein yetkisi içinde olası bir bozulma solucanlar işaret sinyali. Bu hayvanlar protein toplamları organellerin bu hayat sahne22içinde önemli ölçüde biriktikçe durum, bu aslında. Lumen de-asitleştirme bu süreçte rol doğrulamak için biz iki çekirdek bileşenleri v-ATPaz pompası makinaları (VHA-2 ve VHA-8), RNAi tarafından tüketilmiş ve bu nedenle düzgün proton içine almamalısınız hayvan üreten genç, ortak lekeli organellerin. Beklendiği gibi bu post-reproductive vahşi türü Worms karşılaştırılabilir ve alkalinized organellerin (şekil 3) ile tutarlı RNAi hayvanlar, vha-2 ve vha-8 üreme aşamasında bile, azaltılmış cDCFDA floresan sinyallerini gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig1.jpg"> Şekil 1: slaytlar mikroskopi için hazırlanıyor. Mikroskopi için slayt hazırlamak için takip edilmesi gereken adımları gösteren bir basit adım adım şematik.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig2.jpg"> Resim 2: C. elegansbağırsak organellerin asitliği soruşturma için pH duyarlı boya kullanımı. Bağırsak cDCFDA floresan yoğunluğu şekillerinin (2 gün) üreten ve sonrası üreme (günde 8) solucan gösteren diyagram. Solucanları bütün. en iyi diyagramları gösterir Alt temsil kutularına Yakınlaştırılmış, midgut bölgesinin merkezinde intestinal Lümen diyagramları öngörülen. Organellerin veziküller büyüklüklerde bağırsak hücreleri sitoplazmada olarak tasvir edilir. Bu şematik diyagramları şekil 3 görüntüleri ile karşılaştırın.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig3.jpg"> Şekil 3: Resim Boyama cDCFDA. Temsili Resim 2 gün ve günde 8 (L4 sonrası) gösterilen cDCFDA ile lekeli C. elegans bağırsak organellerin (N2 vahşi türü) yanı sıra vha-2 ve vha-8 RNAi Worms bağırsak organellerin cDCFDA (pozitif kontrol) ile lekeli. vha-2 ve vha-8 katmaninin ATPaz (vATPase), lizozomal Lümen asitleştirme için sorumludur lizozomal membran astar proton pompa altbirimden kodlamak.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım kılavuz

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K Görüntüleme.  University of Saskatchewan. Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım kılavuz

Video: Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Biyokimya

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Gelişim Biyolojisi

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Nörobilim

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Biyoloji

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Tıp

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarının El Diseksiyonu

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler