Diese Forschung wurde von der National Science Foundation Award Anzahl 1237969, "Entwirren der Heterozygotie, allelische Zusammensetzung und Copy Number Variation der Kartoffel" finanziert und USDA spezielle Grant 2014-34141-22266 (University of Maine), RV

Hinweis: Es ist wichtig, entsprechende Kontrollen umfassen in der Regel in Form von Blattgewebe der gleichen Diploidie als experimentellen Proben. Und zwar deshalb, weil die 2C-Höhepunkt der Knolle Proben klein und schwer zu erkennen sein kann.
1. Vorbereitungen
Hinweis: Die hier aufgeführten Lösungen können vor der Zeit vorbereitet und bei 4 ° C gelagert, sondern denen, die in den nachfolgenden Schritten vorgestellt müssen frisch zubereitet werden am Tag der Nutzung.
<ol><li>Einem entsprechenden Volumen der Plasmolyse Inkubation Lösung (PIS) zu machen (15 mL/Probe): 0,55 M Mannit, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-Puffer pH 7,5 (mit HCl eingestellt).</li>
	<li>Einem entsprechenden Volumen der Plasmolyse Wash Lösung (PWS) zu machen (15 mL/Probe) identisch mit PIS mit Ausnahme der Zusatz von 0,71 M Mannit.</li>
	<li>250 mL von modifizierten Galbraith Flow Cytometry Puffer11 (FCB) zu machen: 13,6 mM Natriumcitrat (Trinatrium), 8 mM MOPS, 18 mM MgCl2, 0,4 % V/V Triton x-100. Rühren Sie für mindestens 30 min, die Triton x-100 zu verteilen.</li>
	<li>Filter zu sterilisieren PIS und PWS Lösungen mit 0,22 µm asymmetrische Polyethersulfone (Affen) Filter. Verwenden Sie Vakuumfiltration angetriebene Einheiten.</li>
	<li>
106 µm-Netz-Filter für lysierten Protoplasten vorzubereiten. Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, die direkt ins Röhrchen, verschachtelt werden können, jedoch Methode, Suspensionen durch einen 106 µm-Filter benutzt werden kann. Hinweis: Diese müssen nicht steril sein.<ol>
<li>Wenn Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL, schneiden Sie 1 cm vor der Spitze jeder Microcentrifuge Schlauch ab. Mit einer Heizplatte oder andere Wärme Quelle Wärme ein 1 cm2 Stück 106 µm Stahl Masche auf ein Stück Alufolie. Drücken Sie das abgeschnittene Ende des Rohres in das Netz, bis sie verschmolzen haben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie Kartoffeln zu untersuchenden, alle Böden und Schmutz zu entfernen. Hinweis: Knolle Größe und Alter für die Ziele des Experiments soll aber offenbar nicht auf die Qualität der Ergebnisse. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich auf Knollen angewandt im Kühlhaus (4 ° C, 95 % RH) bis zu 8 Monaten gewesen. Zwar Knollen mit defekten (z.B. Knolle Ende Rot, hohle Herz Braun nekrotischen Bereiche) reagiert werden können, sollten sie, wenn möglich vermieden werden.</li>
</ol>2. Tag 1: Plasmolyze Knolle Gewebe
Hinweis: Kontrolle Blattproben können hier aufgenommen werden, um Protoplasten zu produzieren oder im Schritt 5.2 Wenn rohe Zubereitungen bevorzugt werden. Dies muss mit sterilen Werkzeugen in eine aseptische Umgebung wie einem Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
<ol><li>Oberfläche zu sterilisieren Kartoffelknollen über eintauchen in 75 % Ethanol mindestens 5 min lang.</li>
	<li>Entfernen Sie Knollen aus Ethanol und an der Luft trocknen. Dies dauert in der Regel ca. 5 min, länger, wenn die Knolle größer als 100 g ist.</li>
	<li>Vorbereiten und Label steril 50 mL konische Röhrchen für jede Probe und aliquoten 15 mL des Filters sterilisiert PIS in jedem.</li>
	<li>
Probieren Sie etwa 1 cm3 das gewünschte Gewebe von sterilisierten Knollen mit sterilisierten Skalpell oder Kork Borer. Hinweis: Je nach Gewebe entnommen werden kann man entweder eine sterilisierte Korken Borer oder Messer/Skalpell verwenden. Zum Beispiel wenn das Mark gewünscht wird Kork Borer kann verwendet werden, um einen Kern aus der apikalen zum distalen Ende der Knolle nehmen und der zentrale Teil des Kerns abgetastet werden kann. Aufgrund der asymmetrischen internen Morphologie der Kartoffelknollen, es kann jedoch genauer, Probe Parenchym oder Kortex durch Halbierung der Knolle und das gewünschte Gewebe besteuert. Siehe Abbildung 1 für eine Darstellung der internen Knolle Morphologie.<ol>
<li>Grob hacken Sie Gewebe mit einem sterilen Skalpell in ca. 3 mm3 Stück und Transfer Gewebe, konische Rohr mit PIS. Über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Dies ist, um die Fläche zu maximieren, um die PIS und später der Enzymlösung können vollständig durchdringen das Gewebe, was zu vollständiger Verdauung.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> Abbildung 1: interne Morphologie eine Kartoffelknolle. Die Trennung zwischen Mark (P) und Perimedullary Parenchym (PM) ist mit schwarzen Linien dargestellt. Gefäßbündelring, trennt Parenchym aus dem Kortex (C) wird mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Die Ausläufer Ende (S) und die Knolle Augen (E) sind auch gekennzeichnet. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
3. Tag 2: Kartoffel Protoplasten generieren
Hinweis: Dies muss mit sterilen Werkzeugen in eine aseptische Umgebung wie einem Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
<ol><li>Vorbereiten und Filtern (0,45 µm Affen Filter) eine entsprechende Menge des Enzyms Lösung (ES) (10 mL/Probe): 0,71 M Mannit, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 % Onozuka R-10 Cellulase, 0,8 % Macerozyme r-10, 1 % Hemicululase, 10 mM-MES-Puffer, pH 5.8. Stellen Sie sicher, dass entsprechende Filter in diesem Schritt verwendet werden; Filter mit Porengröße kleiner als 0,45 µm sind anfällig für Verstopfung während eine low-Protein Bindung Membran, wie Affen, Verlust des Enzyms während der Filtration minimiert.</li>
	<li>Aspirieren von PIS von Proben in konischen Rohren mit einer sterilen serologische Pipette.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL ES jede Probe und umkehren 2 – 3 Mal.</li>
	<li>Inkubieren Sie Proben über Nacht bei 29 ° C mit 180 u/min horizontale schütteln. Inkubieren Sie Proben für mindestens 16 h.</li>
</ol>4. Tag 3: Ernte Protoplasten und waschen Protoplasten
Hinweis: Aseptische Bedingungen sind zu diesem Zeitpunkt nicht mehr nötig.
<ol><li>Shaker entnehmen Sie Proben und es ermöglichen Sie ihnen, für ca. 10 min zu begleichen.</li>
	<li>
Aspirieren Sie aus so viel ES Lösung wie möglich.
	<ol>
<li>So viel ES Lösung wie möglich mit einer serologischen Pipette, kümmert sich um zu vermeiden, entfernen das verdaute Gewebe entfernen.</li>
		<li>Mit einer Mikropipette entfernen vermeiden jede restliche ES Lösung wieder das verdaute Gewebe. Dies geschieht am einfachsten durch die Röhre schräg halten, so dass ES Lösung in Richtung der Deckel fließt, während die verdaute Gewebe an der Unterseite bleibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jede Probe 15 mL PWS hinzu und invertieren sanft 2 – 3 Mal. Lassen Sie Protoplasten für 10 min vereinbaren.</li>
	<li>Entfernen Sie PWS mit einer serologischen Pipette. Verwenden einer Mikropipette um jede restliche Flüssigkeit zu entfernen. Hinweis: Dieser Schritt ist absolut entscheidend für die Integrität der Probe Kerne während Durchflusszytometrie zu gewährleisten. Bei der Fehlersuche, dieser Schritt erwies sich die wahrscheinlichste Ursache des Fehlers in einer Probe.</li>
</ol>5. Tag 3: Durchflusszytometrie Proben vorbereiten.
Hinweis: Die Proben sollten auf dem Eis von hier gehalten werden auf sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Bereiten Sie Propidium Jodid (0,4 mg Propidium Jodid/mL FCB) und RNase-Lösungen (0,8 mg RNase A / mL FCB) durch Auflösen in FCB. Achtung: Propidium Jodid ist hochgiftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut oder Augen. Tragen Sie geeignete PSA.</li>
	<li>
Fügen Sie 1,5 mL Eis kalt FCB zu jeder Probe. Kurz schütteln oder Vortex jede Probe zu brechen aggregiert Gewebe. Es ist wichtig, die Klumpen der Knolle Gewebe brechen, so dass das FCB kann vollständig die Zellen durchdringen und lassen Sie die Kerne. Verschiedene Proben erfordern mehr oder weniger Unruhe je nach Gewebe und Genotyp. Hinweis: Das FCB lyses der Protoplasten Freigabe der Kerne. Daher Proben die Notwendigkeit des Haltens auf Eis zum Abbau zu verhindern.<ol>
<li>Wenn Flow Cytometry Kontrollproben nicht Bestandteil der Protoplasten Generation Schritt waren kann sie hier enthalten. Wenn ein Steuerelement hinzugefügt werden soll, fein hacken ein kleines Blatt (~ 3 cm2) in 1,5 mL Eis kalt FCB mit einer Rasierklinge. Kontrollproben sollten die gleichen Diploidie als die experimentellen Proben, vorzugsweise die gleichen Genotyp. In-vitro- Pflänzchen sind in der Regel sauberer Gipfel als Gewächshaus oder Freiland Pflanzen geben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ein Siebfilter 106 µm durchlaufen Sie 1 mL der Suspension FCB/Gewebe. Verwenden Sie einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit der Spitze abgeschnitten und Metallgewebe geschmolzen nach unten wie in Schritt 1.5.1 beschrieben. Microcentrifuge Schlauch kann direkt in ein 2 mL Microcentrifuge Schlauch verschachtelt sein und die Probe direkt durchlaufen. Wenn Sie eine andere Methode der Filtration zu verwenden, kann das Filtrat gesammelt in eine eiskalte Petri-Platte und überspielt eine 2 mL-Tube. Hinweis: Manchmal können die restlichen Aggregate und Zelltrümmer den Siebfilter verstopfen. In diesem Fall tippen Sie einfach die zwei verschachtelte Mikrozentrifugenröhrchen ein paar Mal, die Trümmer zu verdrängen.</li>
	<li>Jede Probe 250 µL RNase-Lösung hinzufügen. Umkehren Sie und inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Hinweis: Dieser Schritt soll RNA aus Proben, was zu weniger Lärm während der Durchflusszytometrie zu entfernen. Da die Kerne nur von kurzer Dauer sind, können jedoch Forscher beschließen, verringern die Inkubationszeit oder auf Eis durchführen, wenn sie schwere Beeinträchtigung ihrer Proben erleben.</li>
	<li>Jede Probe 125 µL Propidium Jodid Lösung hinzufügen. Umkehren Sie und inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Hinweis: Proben sollte verwendet werden, für die Durchflusszytometrie so bald wie möglich, wie Abbau innerhalb von 2 h, sogar auf Eis hervorgeht.</li>
</ol>6. Tag 3: Durchflusszytometrie Kartoffel Knolle Kerne
Hinweis: Flow Cytometer-Betrieb und Software variiert je nach Gerät und Hersteller. Ausführliche Beschreibung der jeweiligen Operation das Durchflusszytometer erhalten Sie im Benutzerhandbuch des Geräts.
<ol><li>Erstellen Sie zwei Punkt plottet mit logarithmischen Skala von forward Scatter vs. Side Scatter und Propidium Jodid (PI) Vs Seite streuen. Außerdem erstellen Sie ein Histogramm mit PI auf der x-Achse. Logarithmischen Skala ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Ereignisse im Maßstab sind, da Kerne Fluoreszenz erheblich abweichen können.</li>
	<li>
Laden Sie einen bekannten Steuerelement Probenröhrchen und stellen Sie die Spannung so ein, dass alle Ereignisse im Maßstab sind. Wir verwenden in-vitro-Blattgewebe aus einer Probe-Genotyp. Wenn Proben von verschiedenen Ploidies ausgeführt werden sollen, sollten eine Kontrollprobe für jede einbezogen werden.
	<ol>
<li>Notieren Sie sich den Kanal 2C Peak in der Kontrollprobe. Die 2C-Gipfel der experimentellen Proben sollten am selben Ort fallen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden Sie eine experimentelle (Knolle) Probe zu und wieder zu gewährleisten Sie, dass alle Ereignisse im Maßstab. Wenn Anpassungen erforderlich, wiederholen Sie sind Gipfeln Schritt 6.2, den Kanal 2 c zu identifizieren.</li>
	<li>Tor, manuell die Protoplasten Kerne mit der Seite Vs PI Streudiagramm.</li>
	<li>Legen Sie das PI-Histogramm, um nur die gated Protoplasten Kerne Region zeigen.</li>
	<li>Sammeln Sie die gewünschte Anzahl der Ereignisse von jeder Probe. Häufig verwenden die Forscher 10.000 geschlossene Veranstaltungen für Durchflusszytometrie; aber wir 2.000 Veranstaltungen für Knolle Protoplasten Proben verwenden, um Platz für weitere Proben und Muster mit niedrigen Konzentrationen.</li>
	<li>Berechnen Sie jede Probe EI aus den PI-Histogrammen anhand der folgenden Formel: EI =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> 4C der Prozentsatz der Kerne ist die 4 C (entspricht einer Runde Endoreduplikation), ist 8 C der Prozentsatz die 8C, und so weiter. Siehe Abbildung 4 Beispiele für Histogramme und C-Werte der Gipfel.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das Protokoll enthaltenen sieht, dass Forscher mit einem Mittel zur Beurteilung Endoreduplikation innerhalb von Kartoffelknollen, deren modifizierte Mobilfunk Inhalte und erhöhte Zellengröße scheinbar anderen Flow Cytometry Präparaten entgegen. Das Protokoll stützt sich auf Protoplasten Generation als ein Mittel zur Reduzierung von Lärm und Schmutz, wobei nuklearen Integrität. Zuvor, Forscher haben ähnliche Vorbereitungen für besonders widerspenstigen Flow Cytometry Proben beschrieben sowie Knolle Protoplasten zur Untersuchung einer Vielzahl von Themen wie Pathogenese19,20genutzt. Nach unserem Kenntnisstand haben keine jedoch die Verwendung von solchen Knolle Protoplasten mit Durchflusszytometrie zum Zweck des Studiums Endoreduplikation kombiniert. Darüber hinaus fanden wir die Verwendung von Protoplasten zuverlässiger als typische grobe Vorbereitungen sowie die Technik in den beiden nur andere Studien zur Beurteilung der Knolle Endoreduplikation6,7genutzt werden. Hier besprechen wir die Mängel des Protokolls, potenzielle Fallstricke in seiner Ausführung und Probe Vorbereitung und Ergebnisse von einem typischen Experiment, das sie beschäftigt.
Trotz der Dienstprogramm und Wiederholbarkeit des Protokolls Knolle Flow Cytometry hat es ein paar Schwächen, die diskutiert werden sollte. Um zu beginnen, ist das Protokoll zeitintensiv, zwei Übernachtungen Inkubationen erfordern. Darüber hinaus erfordert das Protokoll einige teuren Reagenzien, insbesondere die Cellulasen und Macerozyme. Darüber hinaus sind die Vorbereitungen sehr zeitkritische, erniedrigende innerhalb weniger Stunden, die wodurch Durchsatz innerhalb eines einzigen Tages eingeschränkt werden kann, vor allem, wenn viele Veranstaltungen gewünscht werden. Zu guter Letzt ist das Protokoll, während zuverlässig, empfindlich auf Fehler im Rahmen der Probenvorbereitung, die alle scheinen die Kerne und niedriger Qualitätsergebnisse zu Schäden führen. Beispielsweise kann mikrobieller Kontamination während der Plasmolyse und Protoplasten Generation Schritte (1 – 3,4) durch unsachgemäße aseptische Technik auftreten. Probe Verunreinigungen, während den Erfolg einer Probe nicht immer auszuschließen scheint, Qualität der erhaltenen Histogramme, wieder wahrscheinlich wegen Schäden an den Kernen drastisch zu verringern.
Wie bereits erwähnt sind die größten Nachteile des Protokolls Kosten, Zeit und Empfindlichkeit zu Fehlern. Forscher sollten Maßnahmen ergreifen, um diese zu mildern. Da Kosten Forscher, die beabsichtigen, die Anwendung des Protokolls zu viele Proben können prüfen, ändern die Enzymkonzentrationen und/oder die Dauer der Verdauung Schritt als verschiedene Gewebe und Genotypen variieren in Reaktionsfähigkeit. Dies beinhaltet die Möglichkeit der Filterung und recycling der ES die bisher aber nicht nachgewiesen wurde hier21eingesetzt. Für die Zeit, in unserer Beobachtung ist es möglich, mit der ersten Inkubation (Plasmolyse Schritt) zu verzichten und noch extrahieren Protoplasten; jedoch werden ihre Integrität und Fülle leiden, das wirkt sich negativ auf Ergebnisse. Um die Verschlechterung der Proben zu verringern sollten Forscher, dass einige Flow Cytometry Ansätze die Verwendung von Fixiermittel (z.B. Formaldehyd beinhalten), Probe Integrität22zu bewahren. Dies ist möglicherweise ein nützliches Mittel sowohl Verschlechterung zu verhindern und eine Probe Speicher anstatt Protoplasten Eintreibungskosten und Flow Cytometry Auftritt am selben Tag wie präsentiert erlauben. Ein weiteres Mittel zur Verhinderung der Abrieb der Kerne möglicherweise einen Nuklease-Hemmer ES und/oder FBC gehören; während 2-Mercaptoethanol keine spürbaren Veränderungen während der Entwicklung erfolgen, haben andere Inhibitoren hierin nicht getestet.
In unserer Beobachtung ist der kritischste Schritt Schritt 4.4, die Entfernung von allen Plasmolyse Waschlösung vor der Zugabe des Puffers Flow Cytometry (FCB). Wenn auch ein kleines Volumen (< 10 µL) bleibt, die Proben sind viel eher abgebaut werden, die auf eine schlechte oder sogar fehlerhafte Stichprobe führen können. Dies ist wahrscheinlich auf Verunreinigungen innerhalb der Enzymlösung (z.B. Nukleasen, Proteasen)23,24 , die schnell die Kerne während der Inkubationszeit und Zeit zwischen Probe läuft, auch bei geringen Konzentrationen beeinträchtigen. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Dauer der Inkubation PI und RNase Schritte. Wie im Protokoll erwähnt, bleiben die Proben nicht stabil für mehr als ein paar Stunden nach Zugabe der FCB so Forscher entscheiden können, die diese Schritte, um Platz für weitere Proben oder langwierige Durchflusszytometrie kürzen läuft aus niedrigen Kerne Konzentrationen. Dies erfordert auch den Forscher zu prüfen, einen Kompromiss zwischen der Anzahl der Ereignisse pro Probe und Gesamtzahl der Proben ausgeführt werden oder die Verwendung von Fixiermittel wie bereits erwähnt in Betracht ziehen.
Unterschiede zwischen Gewebe und Genotypen
Um Ergebnisse Vertreter des Protokolls zu bieten haben wir zwei einfache Experimente bestätigen bereits berichtet Variation von Gewebe und untersuchen den Einfluss der Diploidie und Genotyp entwickelt. Die Ergebnisse des Experiments Gewebe zeigen, dass das Protokoll reproduzierbare Ergebnisse liefert, wie Mark Gewebe wieder gefunden wurde, um die höchste EI zu haben. Etwas überraschend Parenchym Gewebe, das nicht zuvor bewertet hatte einen EI-Wert vergleichbar mit kortikalen Gewebe und deutlich niedriger als Mark. Dies war unerwartet, wie Parenchymzellen zumindest am Ende der Laufzeit in der Regel größer als entweder Mark oder kortikale Zellen sind. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Knollen (90-130 g) zu unreif für die Parenchymzellen, die am Ende der Laufzeit voll ausgebaut und erreicht ihre maximale C-Werte25haben die Mehrheit der Knolle Volumen umfassen. Dies könnte auch erklären, warum die Dihaploid (VT_SUP_19) und die doppelte Dihaploid (VT_SUP_19 4 X) zeigte deutlich mehr EI als CV Superior Knollen; Während jeder Genotyp Knollen etwa gleichgroßen entnommen wurden, ist die maximale Größe der Knollen von VT_SUP_19 oder der isogenen tetraploiden viel kleiner als der der Stammvater. So kann es sein, dass sie größere EI einfach angezeigt weil sie größer im Vergleich zu ihrer Maximalgröße erreichbar waren. Alternativ kann der Unterschied eine Folge der genetischen Ergänzung sein erhielt VT_SUP_19 von seiner tetraploiden Stammvater. Eine andere Möglichkeit ist, dass die genomische Reduktion, die Gewinnung von der Dihaploid aus der tetraploiden aufgetreten entlarvt schädlichen Allele was anlagenweite Stress, das auch gezeigt worden kann, hat um zu erhöhten EI26beitragen. Allerdings zeigt dies, dass die sorgfältige Prüfung Forscher beschäftigen müssen, bei der Auswahl der Knollen und Gewebe für den Vergleich von EI-Werte, vor allem zwischen Genotypen verwendet werden.
Zukünftige Anwendungen
Das Protokoll in diesem Artikel beschriebenen bietet Forschern ein wichtiges Instrument für Verständnis Endoreduplikation in Kartoffel. Es kann für Studien in der genetischen und ökologischen Komponenten der Endoreduplikation, den zeitlichen Verlauf der Entwicklung über Knolle Gewebe und Bewertung der natürlichen Variation erlauben. Letztlich kann Endoreduplikation ein viel versprechendes Ziel zur Verbesserung der Kartoffel, ein Unternehmen machen, erfordern eine zuverlässige Mittel zur Bewertung.

Endoreduplikation ist der Prozess, durch den eine Zelle verzichtet auf die typischen Zellzyklus und stattdessen einen alternativen Verlauf der Entwicklung bestehend aus wiederholten Runden der DNA-Replikation ohne Zellteilung erfährt. Die daraus resultierenden Zelle DNA erhöht haben Inhalte und nukleare Größe, die vermutlich eine Rolle bei der zellulären Verordnung, Expansion und Spezialisierung. In der Regel ist eine Runde Endoreduplikation (genannt einen Endocycle) und der entsprechende Anstieg der DNA-Gehalt größer Zellvolumen zugeordnet sind, eine Beobachtung, die die "karyoplasmic Theorie", die DNA-Gehalt erhöht ausgefällt, ordnungsgemäß erforderlich eine größere, vielleicht mehr komplex, Zelle1zu regulieren. Dieses Phänomen ist häufig in höheren Pflanzen, die in einer Reihe von Geweben, einschließlich derjenigen mit Struktur-/defensives (Trichomen)2,3, beobachtet nutritive (Mais Endosperm)4,5, und Spüle/Lagerung ( Tomaten Perikarp; Kartoffelknolle)6,7,8 Funktionen. In Obst wurde vermutet, dass diese Endoreduplikation spielt eine Rolle in die rasche Expansion der Samenschale zu erleichtern, wie die negative Beziehung zwischen Endoreduplikation und Obst Entwicklungs-Periode9belegt. Zum Beispiel Zellen mit DNA Inhalt bis zu 512C (512 Mal die haploiden Genom) in der Tomate Perikarp8eingehalten worden. Im übrigen Chevalier Et Al. (2014) gezeigt, dass Veränderungen in der Expression von Genen Zellzyklus zu einem Anstieg der Endoreduplikation Ebenen innerhalb der Samenschale wodurch dann größere Früchte10führen können. Veränderung der Gene, die Förderung der Endoreduplikation bietet somit, ein potenzielles Ziel für die Verbesserung der Biomasse oder Ertrag durch Pflanzenzucht oder Genmanipulation. Eine solche Verbesserung ist jedoch abhängig von der besseren Verständnis der Ursachen und folgen der Endoreduplikation.
Endoreduplikation ist in den meisten Fällen über Durchflusszytometrie gemessen wobei Kerne, veröffentlicht in grobe Gewebe Vorbereitungen11, mit einem DNA-Bindung Fluorophor, z. B. Propidium Jodid12 (PI) inkubiert werden. Die gefilterten Proben werden dann durch den Laser ein Durchflusszytometer übergeben, wo Emission Wellenlängen spezifisch für das Fluorophor beobachtet werden können. Die Intensität der Fluoreszenz in jedem Ereignis (z.B. Zellkern) korreliert direkt mit der DNA-Gehalt des Teilchens. So kann durch den Vergleich zu einem bekannten Standard, der relativen und absoluten DNA-Gehalt der Zellen in einer Probe berechnet werden. Endoreduplikation Indizes (EI) werden bestimmt durch die Gründung der durchschnittlichen Anzahl der Endocycles pro Zelle innerhalb einer Probe durch die Beobachtung der zellulären DNA-Gehalt (C-Wert) wo befindet sich 1 C der DNA-Gehalt einer haploiden Zelle (Formel in Schritt 6,7 des Protokolls). Zum Beispiel ist der Basis DNA-Gehalt der somatischen Zellen in einem diploiden Organismus 2 C. Wenn eine Probe einige Zellen mit 4 C hat, entsprechend einer Runde Endoreduplikation oder größer ein EI in der Nähe von 0 müsste; Allerdings sind fast alle Zellen 4 C wäre die EI etwa 1. Als mehrfache Umläufe der Endoreduplikation in höheren Pflanzen Beobachtungswerte EI häufig können jedoch viel größer sein. Bei der Berechnung der Endoreduplikation Indizes kann relativ einfach, es erfordert, dass die relativen Häufigkeiten der Kerne werden C-Werte zuverlässig festgestellt werden, die unter bestimmten Arten und Geweben (einschließlich Kartoffelknollen) ausgeschlossen ist. Es ist wahrscheinlich, dass Unterschiede in zelluläre Anatomie, Chemie oder Zellwand Zusammensetzung13 verursachen diese Proben werden widerspenstigen zu den typischen Vorbereitungen mit einer Rasierklinge, die Kerne direkt in entsprechende Puffer freizugeben, die häufig verwendet werden ein Modell für Endoreduplikation Studien mit Geweben wie Tomate Perikarp8.
In der Kartoffel bleibt die Prüfung der Endoreduplikation innerhalb der Knolle beschränkt sich auf nur ein paar Studien, vielleicht zum Teil auf einen Mangel an ein zuverlässiges Protokoll, wie die oben genannten rohen Vorbereitungen inkonsistente Ergebnissen führen. Während solche Ansätze auch für Blätter die Knolle Proben erleben Sie schwere Abbau und eine Fülle von Lärm in Form von Schutt arbeiten, Differenzierung der Gipfel bestehend aus Kernen mit unterschiedlichen C-Werte fast unmöglich machen. Dies ist möglicherweise aufgrund von Unterschieden in zelluläre Zusammensetzung und eine Fülle von Zelltrümmer in Knolle Zellen (zB. Stärke speichern Amyloplasten). Um diese Hürde zu überwinden, haben wir vor kurzem ein zuverlässiger Protokoll für den Erwerb der unterscheidbaren Gipfel Durchflusszytometrie der Kartoffelknollen entwickelt. Die Frequenz der Zellen innerhalb jeder Gipfel kann dann verwendet werden, für die Berechnung der genauen Endoreduplikation gestaffelt nach verschiedenen Genotypen oder verschiedene Gewebe, aus die eine Knolle besteht. Das Protokoll, das eine modifizierte Protoplasten Extraktion Methode14,15 Antezedens beschäftigt beschriebenen Flow Cytometry11, zeigte erhebliche Unterschiede innerhalb der Kartoffel Verwandten, Sorten und Gewebe16 . Hier stellen wir das Protokoll im Detail durch die Auswertung EI im Kontext der Diploidie, Gewebe und Knolle Größe.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10k</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.22&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>564-0020</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.45&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>172590250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423922500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17263-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borers with punch</td>
			<td>American Scientific</td>
			<td>2093-02</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-31</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-920B</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>106um stainless steel mesh or other seive of same pore size</td>
			<td>New Jersey Wire Mesh Co.</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

Endoreduplikation, die Replikation von einer Zelle Kerngenom ohne anschließende Zytokinese ergibt Zellen mit erhöhten DNA-Gehalt und ist verbunden mit Spezialisierung, Entwicklung und Steigerung in zellulären Größe. In Pflanzen scheint Endoreduplikation das Wachstum und die Expansion von bestimmten Geweben und Organen zu erleichtern. Unter ihnen ist die Knolle der Kartoffel (Solanum Tuberosum), die erhebliche zellulären Erweiterung bei der Erfüllung ihrer Funktion der Kohlenhydratspeicher erfährt. So kann Endoreduplikation spielen eine wichtige Rolle in wie Knollen in der Lage sind, diese Fülle von Kohlenstoff aufnehmen. Jedoch schließt die Zelltrümmer aus Rohöl nuklearen Isolationsmethoden Knollen, Methoden, die mit Blättern, effektiv genutzt werden können die Schätzung der Knolle Endoreduplikation Index (EI). Dieser Artikel stellt eine Technik für die Beurteilung der Knolle Endoreduplikation durch die Isolation von Protoplasten während zeigen repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen Genotypen und Knolle Gewebe unterteilte. Die wesentlichen Einschränkungen des Protokolls sind die Zeit und Reagenz für die Probenvorbereitung sowie relativ kurze Lebensdauer von Proben nach lyse der Protoplasten erforderlich. Während das Protokoll für technische Variation empfindlich ist, stellt eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden der nuklearen losgelöst von diesen großen spezialisierten Zellen dar. Möglichkeiten für Verbesserungen des Protokolls wie recycling-Enzym, die Verwendung von Fixiermittel und andere Veränderungen werden vorgeschlagen.

Produktion von Protoplasten
Die Erzeugung von Protoplasten ist für wiederholbare Flow Cytometry Ergebnis von Kartoffelknollen, erforderlich die allgemeine Morphologie der in Abbildung 1angezeigt wird. Forscher können um sicherzustellen, dass hochwertige Protoplasten vor der Zugabe von FCP, produziert worden sind, vor allem die Problembehandlung erforderlich ist. Der Großteil der Protoplasten soll kugelförmig mit minimalen Vorsprünge (Abbildung 2) und kann sehr unterschiedlich in Größe, die vielleicht reflektierende Unterschiede im EI ist.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> Abbildung 2: repräsentative Blatt und Knolle Protoplasten erworbene Schritt 4.4 des Protokolls. Isolierte Protoplasten sein sphärische und symmetrisch mit Plasmamembran intakt. Beachten Sie den Größenunterschied zwischen Blatt (A-C) und Knolle (D, E) Protoplasten sowie die Größenunterschiede innerhalb eines Gewebes, das verschiedene Ebenen der Endoreduplikation hinweisen können. Blatt-Protoplasten enthalten Chloroplasten Amyloplasten innerhalb der Knolle Protoplasten sichtbar sind. Skalieren von Balken = 1.000 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Flow Cytometry Ergebnisauswertung
Der Erfolg oder Misserfolg eines Experiments kann von der Breite des Peaks und ihrer Trennung im Flow Cytometry Histogramme gemessen werden. Da Mess Endoreduplikation Berechnung relative Häufigkeit der Kerne in jede Spitze erfordert, ist bloße Anwesenheit oder Abwesenheit von Gipfeln unzureichend, wenn es zu viel Lärm gibt, sinnvolle Grenzen zwischen ihnen zu ziehen. Abbildung 3 zeigt die Variation in den Ergebnissen, die Forscher in den Flow Cytometry Streudiagrammen und Histogramme antreffen können. Mögliche Ursachen für fehlgeschlagene Proben werden in der Diskussion vorgestellt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> Abbildung 3: repräsentative Ergebnisse aus Durchflusszytometrie Protoplasten Kerne der intakt und Mark Proben degradiert. Intakte Kerne (A) zeigen die saubere Trennung zwischen Gipfeln, relative Häufigkeit von Zellen in jeder mit der entsprechenden Software, während Gipfeln in degradierten Proben (B) verschobene, Breite und überlappende Basen zeigen zu quantifizieren. In der Scatterplots intakt (C) und degradierten (D) Proben deuten Blackboxes nuklearen Ereignis gating für Histogramme und die Häufung von Ereignissen in der Breite der Histogramm-Gipfel reflektiert wird. Ereignisse vor den Toren geben Schutt, stark degradierten Zellkerne oder andere Aggregate. PI-H entspricht der Intensität der Fluoreszenz, die in beliebigen Einheiten gemessen wird. Methoden zur Problembehandlung zum Beispiel Abbau zu verhindern werden innerhalb des Textes besprochen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Endoreduplikation Unterschiede zwischen Gewebe
Zuvor berichteten wir, dass die Knolle Mark Gewebe deutlich höheres Maß an Endoreduplikation als Kortex Gewebe16hat. Um zu bestätigen und erweitern auf diese schauten wir Endoreduplikation Ebenen von drei verschiedenen Geweben in CV Superior: Mark, Perimedullary Parenchym und Kortex, in dreifacher Ausfertigung mit 2.000 nichtöffentliche Veranstaltungen pro Probe repliziert. Unsere Ergebnisse bestätigen unsere frühere Beobachtung, dass Mark Gewebe wesentlich größere EI als kortikalen Gewebe mit 1,79 und 1.12 Endocycles pro Zelle, bzw. hat (p = 0,018; Studenten t-Test). Etwas überraschend das Parenchym Gewebe ein Profil ähnlich wie Cortex gezeigt und war auch signifikant verschieden von Mark Gewebe (bedeuten = 1,14; p = 0,013; Studenten t-Test). Diese Ergebnisse sind in Abbildung 4zusammengefasst.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> Abbildung 4: Endoreduplikation in drei Geweben des CV Superior. Die Histogramme der Knolle Kortex (B), Blatt (A), Parenchym (C) und Mark (D) Gewebe werden zusammen mit dem EI-Wert berechnet aus diesen Histogramme angezeigt. Relative Häufigkeit von Kernen bestehend aus jeder Gipfel unterscheiden erkennbar, vor allem zwischen Blatt und Knolle Gewebe. C-Werte für jeden Peak werden ebenfalls angezeigt. PI-H entspricht der Intensität der Fluoreszenz, die in beliebigen Einheiten gemessen wird. Meine Vergleiche von EI der Knolle Gewebe sind angezeigt, in E, wo Sternchen signifikanten Unterschied gibt (p < 0,05) und Fehlerbalken zeigen Standardabweichung. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Einfluss der Knolle Größe und Diploidie
Wir berichteten bereits, dass für einen bestimmten Genotyp Knollen von unterschiedlicher Größe, aber ähnliche Reife keinen entsprechenden Unterschied in EI16angezeigt. Wir wollten dieses Ergebnis bestätigen ebenso wie beurteilen Sie die Beziehung zwischen Diploidie und Endoreduplikation. Für dieses Experiment verwendet wir drei Wiederholungen von Parenchym Gewebe aus drei verschiedenen Genotypen: CV Superior (4 X), VT_SUP_19 (2 X) ein Dihaploid ist 4 X ist eine doppelte Dihaploid CV Superior durch Kribbeln Bestäubung17und VT_SUP_19 entnommen 18 isogenen, VT_SUP_19. Wir enthalten eine Reihe von Wiederholungen für groß (90-130 g) und kleine (< 35 g) Knollen für CV Superior während Knollen für die anderen beiden Genotypen 90 – 130 g wurden. Die Knollen waren alle geerntet aus Gewächshaus Pflanzen angebaut, bei voller Reife, d.h. die Spitzen der Pflanzen war gealtert. Wir beobachteten einen signifikanten Unterschied zwischen VT_SUP_19 und ihre Vorläuferzellen Superior (p = 0,04); Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen VT_SUP_19 und VT_SUP_19 4 X (p = 0,69). Dies bedeutet, dass es zwar eine wahrscheinliche genetische Komponente Endoreduplikation, als durch die genomische Reduktion entlarvt es nicht von Diploidie, zumindest in diesem Hintergrund diktiert wird. Zu guter Letzt beobachteten wir wieder einmal keine signifikanten Unterschiede zwischen großen und kleinen CV Superior Knollen wie in Abbildung 5gezeigt.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> Abbildung 5: Endoreduplikation in zwei Größen der Knollen CV Superior diploiden (VT_Sup_19) und tetraploide (VT_Sup_19 4 X) Derivate. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert für kleine (< 35 g) und groß (90-130 g) CV Superior Knollen sowie groß (90-130 g) Knollen von Dihaploid VT_SUP_19 und der isogenen verdoppelt Dihaploid VT_SUP_19 4 X. Signifikante Unterschiede (p < 0,05) werden durch den verbindenden Brief-Bericht angezeigt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Messung der Endoreduplikation durch Durchflusszytometrie von isolierten Knolle Protoplasten

Das hier beschriebene Protokoll ist eine Methode zur Messung der Endoreduplikation innerhalb Knollen der Kartoffel (Solanum Tuberosum). Freuen Sie sich auf Plasmolyse und Protoplasten Extraktion Schritte um die Lärm und Schmutz in nachgeschalteten durchflusszytometrischen Analyse verringern.

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

measuring-endoreduplication-flow-cytometry-isolated-tuber

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Aufrufe.  Virginia Tech. Das hier beschriebene Protokoll ist eine Methode zur Messung der Endoreduplikation innerhalb Knollen der Kartoffel (Solanum Tuberosum). Freuen Sie sich auf Plasmolyse und Protoplasten Extraktion Schritte um die Lärm und Schmutz in nachgeschalteten durchflusszytometrischen Analyse verringern.

Serie: Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Forschung

Biologie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...