Name: in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

Die Autoren möchten Glenn Sanger-Hodgson, Medien-Spezialist an der FSU College of Medicine für seine Arbeit in video-Produktion, Bearbeitung und Voice-over zu danken.
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01GM100474 und R01GM072611) unterstützt.

Die Methoden hier beschrieben und in Abschnitt 2 von der Florida State University institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und folgt die Vorgaben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren,8 Auflage . Alle Tiere, die in diesem in diesem Protokoll verwendeten sind Haus in einem speziellen Labor Tier bis zur Verwendung. Keine in-Vivo -Experimente wurde durchgeführt vor opfern. Tierzahlen beruhten auf experimentelle Notwendigkeit durchschnittliche Zelle und Myelin Sammlungen als Leitfaden verwenden, um die Nutzung zu minimieren.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Generation von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) (Abschnitt 1), die Vorbereitung von Eindringmittel beschrifteten Gehirn abgeleitet Myelin Schutt (Abschnitt 2), das allgemeine Verfahren für die Analyse von Myelin Schutt Phagozytose (Abschnitt 3), und das allgemeine Verfahren für die Analyse der Myelin Schutt Lipid Akkumulation (Abschnitt 4). Reagenz-Vorbereitung, Zelle Ernte und Manipulation, Myelin-Sammlung und Kennzeichnung und Testleistung sollte in einem laminaren Luftstrom Biosafety Kabinett abgeschlossen sein.
1. Generation der primären Knochenmark stammenden Makrophagen
<ol>
	<li>Erstellung von kompletten Makrophagen Kulturmedium (CMCM) Hinweis: Makrophagen-Generation aus dem Knochenmark erfordert den Einsatz von Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF). Dieses Präparat nutzt L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien als Quelle für M-CSF.<ol>
		<li>Generieren Sie L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien durch Kultivierung Zellen in 145 mm Schalen mit 50 mL des hohen Glukose (4500 mg/L L-Glukose) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 7 Tage mit 5 % neue geboren Kälberserum (NCS) und Penicillin/Streptomycin ergänzt.</li>
		<li>Sammeln Sie Medien aus Kulturen in 50 mL konische Zentrifuge Röhren und Zentrifuge für 30 Minuten bei 3500 X g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtern Sie Überstände durch einen 0,2 µm Spritze Filter in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL. Konditionierte Medien können bis zu 6 Monaten bei-80 ° C aufbewahrt werden.</li>
		<li>Um hohe Glukose DMEM, fügen Sie 5 % Vol/Vol NCS, 15 % Vol/Vol L929 murine Fibroblasten bedingt DMEM und 1 % Penicillin/Streptomycin. Medien können 2-3 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Auf 37 ° C vor dem Gebrauch warm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von primären Knochenmark-Zellen und Makrophagen Induktion 
	Hinweis: Mit diesem Protokoll eine Maus erzeugt etwa 20 Millionen Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs).<ol>
		<li>Einschläfern Sie die gewünschte Anzahl von 8-10 Wochen alte Mäusen mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien durch zervikale Dislokation gefolgt.</li>
		<li>Desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol (Vol/Vol): H2O, das Fell zu sättigen.</li>
		<li>Schneiden Sie eine kleine Öffnung in den Bauch und ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut um das darunter liegende Gewebe sichtbar zu machen. Achten Sie darauf, keine Punktion der Bauchhöhle.</li>
		<li>Entfernen Sie beide Hinterbeine an der Hüfte beginnend und endend am Knöchel. Ort der gesammelten Gewebe in eine 100 mm Petrischale mit 5-10 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin. 
		Hinweis: Beim Verarbeiten mehrerer Tiere achten, Gerichte auf Eis, Gewebe Abbau zu begrenzen zu halten.</li>
		<li>Entfernen Sie Muskel- und Bindegewebe aus dem Knochen mit einem Skalpell. Nur das Femur und Tibia dienen zur Zellentnahme, die Fibula verworfen werden kann.</li>
		<li>Aussetzen des Knochenmark-Hohlraums der gesammelten Knochen durch einen kleinen Ausschnitt von jedem Ende mit einem Skalpell zu trimmen.</li>
		<li>Mit einer 25g Nadel, spülen Sie das Knochenmark Hohlräume mit CMCM in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Die Knochen werden weiß angezeigt, sobald sie ausreichend geleert wurden.</li>
		<li>Nach Abschluss der Sammlung agitieren Sie Aspiraten mit einer Nadel 18g für 30-90 s erzeugt eine einzelne Zellsuspension. 
		Hinweis: Ein optionale Erythrozyten (RBC) Lyse Schritt kann zu diesem Zeitpunkt ausgeführt werden. Es wurde vor kurzem vermutet, dass die intrazelluläre Eisengehalt der Auswirkungen von Myelin Schutt auf Makrophagen Polarisation16beeinflussen kann. Informationen über die Einbeziehung von RBC Zerstörung Schritt finden Sie unter Trouplin Et Al. 17.</li>
		<li>Filtern Sie die Aussetzung durch eine 70 µm sterile Zelle Sieb in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL.</li>
		<li>Samen Zellen gleichmäßig in 145 mm Zelle Kultur Speisen mit 15-20 mL CMCM gesammelt. Verwenden Sie ca. drei Kultur Gerichte per Mausklick geopfert. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2Kulturen.</li>
		<li>Nach 72 Stunden Platten einmal mit sterilen PBS waschen, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie dann 15-20mL frische CMCM. Weitere 4 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Kulturen. Nach 7 Tagen der gesamten Kultur werden die blutbildenden Knochenmarkzellen zunächst isoliert Reifen BMDMs (Abbildung 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generation von Eindringmittel beschrifteten Brain-Derived Myelin Schutt
Hinweis: Alle Reagenzien können bis zu 1 Monat bei 4 ° C aufbewahrt werden.
<ol>
	<li>Vorbereitung von Myelin Schutt Sammlung Reagenzien
	<ol>
		<li>Tris· vorbereiten CL-Pufferlösung.<ol>
			<li>800mL hinzufügen destilliertem entionisiertem H2O (DdiH2O), 20 mL 1 M Tris· CL, pH 7,45 (20 mM Endkonzentration) und 20 mL 100 mm Na2EDTA (2 mM Endkonzentration).</li>
			<li>Stellen Sie ein pH-Wert um 7.45 Uhr. Stellen Sie die Lautstärke auf 1000 mL mit DdiH2O. Filter-Lösung durch einen 0,2 µm Filtrationseinheit.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M Saccharoselösung.<ol>
			<li>Auf 100 mL Tris· CL Puffer-Lösung, fügen Sie 68,46 g Saccharose. Lautstärke auf 200 mL mit Tris· CL-Pufferlösung. Filtern Sie die Lösung durch eine Filteranlage von 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie 200 mL von 0,32 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).</li>
		<li>Bereiten Sie 150 mL 0,83 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von Brain-derived Rohöl Myelin Schutt 
	Hinweis: Die hier beschriebene Methode der Sammlung ist für die Isolierung von Rohöl Myelin Schutt.<ol>
		<li>Einschläfern Sie 10-12 Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
		<li>Sezieren Sie die Gehirne zu und legen Sie sie in eine 100 mm Schale mit 10 mL von 0,32 M Saccharoselösung.</li></ol></li></ol>Halten Sie die Schüssel auf dem Eis.
		<li>Mit sterile chirurgische Schere schneiden die Gehirne in Stücke ca. 5 mm3 in der Größe.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL und ca. 30 mL 0,32 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Homogenisieren Sie mit einer sterilen Handheld rotary Homogenisator, bis eine glatte Lösung erreicht ist.</li>
		<li>Verdünnen Sie die homogenisierte Gehirne zu einem Endvolumen von 90 mL mit 0,32 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Hinzugeben Sie auf sechs 38,5 mL dünnwandigen Polypropylen Ultrazentrifugen Rohre 20 mL 0,83 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Fügen Sie sanft die homogenisierte Gehirn-Lösung an die Spitze der 0,83 M Saccharoselösung, kümmert sich nicht um die beiden Schichten zu mischen.</li>
		<li>Jedes Rohr mit den 0,32 M Saccharoselösung auszugleichen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Setzen Sie Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre minimale Werte um Myelin Schutt zu reduzieren.</li>
		<li>Sammeln Sie die Myelin-Trümmer von der Schnittstelle der beiden Saccharose dichten. 
		Hinweis: Schutt erscheint als ein weißes Band in Richtung der Mitte des Rohres.</li>
		<li>Kombinieren Sie die grobe Myelin Trümmer in eine konische Zentrifugenröhrchen 50 mL und stellen Sie die Lautstärke auf ca. 35 mL mit Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Die grobe Myelin Trümmer mit einem sterilen Handheld rotary Homogenisator für 30-60 s zu homogenisieren.</li>
		<li>Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 6 saubere Ultrazentrifugen Rohre und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen</li>
		<li>Als feste weiße Pellets jetzt sichtbar sein werden, verwerfen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie, die Pellets in 10-15 mL Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 2 sauber Ultrazentrifugen Röhren und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Zentrifuge vorgekühlt wieder bei 100.000 x g 45 min bei 4 ° C mit einer geeigneten Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der Pellets in 5-6 mL sterile PBS und teilen Sie den Schwebezustand zwischen einer angemessenen Zahl von vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 22.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und bestimmen Sie das Gewicht der Myelin-Schutt-Pellets.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie, die Pellets in PBS, eine Endkonzentration von 100 mg/mL. 
		Hinweis: zehn bis zwölf Gehirne ist genug, um 10-15 mL 100 mg/mL Myelin Schutt zu produzieren. Myelin Trümmer kann Speicher bei-80 ° C für 6 Monate sein.</li>
	
	
	<li>Myelin Schutt fluoreszierende Kennzeichnung
	<ol>
		<li>Bereiten Sie die 50 µM Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Lösung unmittelbar vor der Anwendung.<ol>
			<li>Verwendung von sterilen PBS verdünnen Sie eine 5 mM-Stammlösung von CFSE-mit 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine Endkonzentration von Arbeiten von 50 µM vorbereitet.</li>
			<li>Filtern Sie Lösung durch einen 0,2 µm Spritze Filter.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tauen Sie die gewünschte Menge von 100 mg/mL Myelin Schutt und erneut mit einer sterilen 29 g Nadel auszusetzen. 
		Hinweis: Einfrieren den Myelin-Schutt wird dazu führen, dass aus der Lösung erfordern Wiederfreisetzung vor Gebrauch fallen.</li>
		<li>Übertragen Sie Myelin Schutt auf eine vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Aufzuwirbeln Sie die Myelin-Trümmer in 200 µL der CFSE-Lösung pro 100 µL Myelin Schutt pelleted.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT) vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Das Pellet in 600-800 µL Waschpuffer Aufschwemmen (0,2 µm-Filter sterilisiert 100 mM Glycin mit PBS-Puffer).</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.8-2.3.9 zweimal mehr.</li>
		<li>Bestimmen Sie nach der letzten Wäsche, das Gewicht des Pellet-Myelin Schutt und wieder auszusetzen Sie bis 100 mg/mL mit sterilen PBS. Bemerkung: Beschriftete Myelin Schutt kann Shop bei-80 ° C für bis zu 6 Monaten.</li>
	</ol>
	</li>

(3) Myelin Schutt Phagozytose Assay
Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von Phagozytose Eindringmittel beschrifteten Myelin Schutt. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Behandlung Platten
	<ol>
		<li>Für jede Platte 145 mm Reifen BMDMs in eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 5-6 mL 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS) (pH 7,4) sammeln. 
		Hinweis: Verwenden Sie Trypsin nicht, da es den Aktivierungsstatus der Zellen18verändern kann.</li>
		<li>Jedes Rohr gesammelt Zellen ein gleiches Volumen des vorgewärmten CMCM hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 180 X g für 8 min bei 20 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie Zellen in CMCM und Count.</li>
		<li>Fügen Sie in jede Vertiefung einer 24-Well-Zelle-Kultur-Platte 1 x 105 Zellen in 1 mL der CMCM hinzu.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin Schutt Behandlung und Analyse
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL CFSE Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration) beschriftet.</li>
		<li>1-3 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verschlungen Myelin Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie Platte 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung, Immunofluoreszenz zu reduzieren.</li>
		<li>Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. 
		Hinweis: Die Anregung und Emission Wellenlängen des CFSE-sind 494 nm und 521 nm, beziehungsweise.</li>
		<li>Teilen Sie die Anzahl der CFSE-positive Zellen durch die Anzahl der Nukleonen relative Myelin Schutt Aufnahme zu bestimmen.</li>
		<li>Pflegen Sie vor der Bildgebung Platten für bis zu 7 Tage bei 4 ° C, vor Licht geschützt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(4) Quantifizierung der intrazellulären Lipide über Öl Färbung rot-O
Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von intrazellulären Myelin-Schutt-derived Lipide.Die Verwendung von CFSE beschriftet Myelin Schutt empfiehlt sich nicht für fluoreszierende Quantifizierung von ORO Färbung durch spektrale Überlappung. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Färbung Lösungen
	<ol>
		<li>0,5 % Öl rot-O (ORO) Färbelösung vorzubereiten.<ol>
			<li>Fügen Sie langsam 100 mL 100 % Propylenglykol (1,2-Propandiol) bis 0,5 g Oro (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) unter Rühren.</li>
			<li>Erhitzen Sie die Lösung bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis alle große Partikel aufgelöst haben. 
			Hinweis: nicht erhitzen über 100 ° C.</li>
			<li>Lösung durch ein Stück Filterpapier während noch warm in einen neuen Container zu filtern.</li>
			<li>Lassen Sie zu, dass Lösung kühlen über Nacht bei RT-Lösung für bis zu 1 Jahr bei RT aufbewahrt werden können</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85 % Propylenglykol Lösung ansetzen.<ol>
			<li>15 mL DdiH2O. rühren, bis gemischt fügen Sie 85 mL 100 % Propylenglykol hinzu. Lösung kann bis zu 1 Jahr bei RT gelagert werden</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Behandlung Platten
	<ol>
		<li>Bereiten Sie eine 24-Well-Platte nach der in Abschnitt 3 beschriebenen Methode.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin Schutt Behandlung
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration).</li>
		<li>1-3 h bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verdaut Myelin Ablagerungen zu entfernen. Hinweis: An dieser Stelle Platten können entweder sofortige Fixierung unterziehen oder frische CMCM kann hinzugefügt werden, und Zellen nach Inkubation für zusätzliche Zeitpunkte zurück.</li>
		<li>400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 2 Mal mit sterilen PBS dann Handlungsschritte zu beflecken.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO Färbung und Analyse
	<ol>
		<li>Waschen Sie feste Platte mit DdiH2O. 3 Mal</li>
		<li>400 µL 100 % Propylenglykol in jede Vertiefung hinzufügen und 5 min bei RT inkubieren 
		Hinweis: Dies reduziert die Übertragung von DdiH2O.</li>
		<li>Aspirieren Sie das Propylenglykol und jedes gut fügen Sie 400 µL ORO-Lösung hinzu.</li>
		<li>8 min bei 60 ° c inkubieren</li>
		<li>Aspirieren Sie die ORO-Lösung. Dann fügen Sie 400 µL von 85 % Propylenglykol in jede Vertiefung und 5 Minumintes bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen der Platte 3 Mal mit DdiH2O.</li>
		<li>Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung.</li>
		<li>Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. ORO kann mit einem standard Texas Red oder DsRed Filtersatz abgebildet werden.</li>
		<li>Quantifizieren Sie relative Lipid Aufbewahrung durch Bestimmung der ORO positiven Bereichs in jedem Bildfeld und dividiert sie durch die Anzahl der Nukleonen.</li>
		<li>Pflegen Sie Platten für 7 Tage bei 4 ° C vor Licht geschützt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Die hier beschriebenen Verfahren nutzen frisch isolierte Rohöl CNS Myelin Schutt und primäre Knochenmark stammenden Makrophagen. Um tierische Ausgaben zu reduzieren, empfehlen wir, die beiden Gehirne und Knochenmarkzellen von jeder Maus zum Zeitpunkt des Opfers geerntet werden. Zwei Forscher gemeinsam können beide Materialien gleichzeitig zubereiten. Alternativ können Gehirne bei-80 ° C in PBS mit Antibiotika vor dem Myelin Schutt Isolierung ergänzt gespeichert werden. Es ist gewesen, dass unsere Erfahrung, die Gehirne unter diesen Bedingungen bis zu 1 Monat ohne nennenswerten Verlust von Myelin Schutt Generation Potenzial aufrechterhalten werden kann.
CFSE wird verwendet, um Myelin Ablagerungen aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit und fluoreszierendem Intensität zu beschriften. Der Farbstoff bleibt abgeschreckt, bis zelluläre Esterasen die Acetat-Gruppe auf der Molekül-14Spalten. Der Estergruppe befreiten Succinimidyl kann dann mit primäre Amide reagieren was in kovalente Bindung an zelluläre Proteine14. Während CFSE mit grün fluoreszierenden Standardkanäle erregbar ist, gibt es verschiedene Derivate mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften im Handel erhältlich. Somit ist es möglich, eine ähnliche Phagozytose-Assay mit mehreren Leuchtstofffärbungen zu entwerfen. Anzumerken ist, dass da der Farbstoff leicht Plasmamembranen kreuzt, es Label Apoptotic Zellen in einer ähnlichen Weise als Myelin Schutt19verwendet werden kann. Darüber hinaus während unsere Methode auf standard Bildanalyse mit Benutzer-Optimierung basiert, Quantifizierung erfolgt mittels Durchflusszytometrie oder ein hoher Durchsatz-Platte imaging-System.
Öl rot O (auch bekannt als Lösungsmittel rot 27 oder Sudanrot 5 b) ist eine fettlösliche Farbstoff, der weitgehend neutralere Lipiden in histologischen Proben Fleck verwendet worden ist. Seine tiefrote Pigmentierung ermöglicht die Visualisierung von intrazellulären Lipiden über Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie5,20. Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht Einkanal Bildgebung und robuste Quantifizierung von ORO gebeizt Lipid-Tröpfchen. Während die Färbung Methode einfach und hoch reproduzierbare, muss während der Probenvorbereitung zu achten. Es ist wichtig, dass Alkohol oder Säure-basierte Fixiermittel nicht verwendet werden, als sie intrazelluläre Lipide, was zu einem deutlichen Rückgang der Intensität Färbung auflösen können. Darüber hinaus kann nicht wie bei einer quantitativen Bildanalyse, die Bedeutung von standardisierten Bild Aufnahmeeinstellungen und ausreichend unvoreingenommene Probenahme zu unterschätzen. Die Färbung Steuerelemente wird empfohlen, für jede Probe Auto-Fluoreszenz zu berücksichtigen. Diese Färbung Kontrollen sollten gleich behandelt werden, aber links ungefärbt mit ORO zur Messung der Hintergrund Auto-Fluoreszenz. Trotzdem erfordert unsere Bild-Analyse-Methode weniger Optimierung als andere Lipid Quantifizierung Techniken, wie die ORO Extraktion Methode21, die Standardkurve Vorbereitung erfordert, anfälliger für experimentelle Variabilität ist und erfordert Zerstörung der Probe. Die Verwendung von Bild-basierte Analyse hat mehrere Vorteile gegenüber traditionellen ORO Extraktionsmethoden, dass es nicht-destruktiv und ist kompatibel mit Immunostaining21,22 .
Schließlich während die beschriebenen Verfahren relativ geradlinig sind, ist es wichtig, dass richtige aseptische Technik verwendet werden, da Makrophagen mehrere Rezeptoren zum Ausdruck bringen, die erkennen, dass Erreger molekulare Muster (PAMPS) wie zum Beispiel das Endotoxin verbunden Lipopolysaccharid (LPS)23. Interaktion mit bakteriellen Verunreinigungen werden in Makrophagen Aktivierung zur Folge und kann dramatisch ändern ihre Funktion24,25. In Bezug auf die gesammelten Myelin-Trümmer empfiehlt sich für Kontamination testen. Endotoxin Nachweismethoden wie Limulus Amebocyte lysate (LAL) Assay haben hohen Empfindlichkeit und habe bisher für diese Anwendung5,19.
Makrophagen spielen eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, doch die Rolle der BMDMs im Rahmen der CNS Verletzung ist derzeit ein wichtiges Thema der Untersuchung. Hier beschriebenen Methoden verwenden, können Forscher beginnen, besser zu verstehen, den Mechanismus der Myelin Schutt Phagozytose durch BMDMs.

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunsystem. Als antigenpräsentierende Zellen (APCs) sie können mit Lymphozyten über beide Antigenpräsentation kommunizieren und Cytokine release1,2,3. Ihre primäre Funktion ist jedoch als professionelle Phagozyten, Krankheitserreger, gealterten Zellen und Zelltrümmer1,4löschen. Nach einer Rückenmarksverletzung ("SCI") ist verantwortlich für CNS Axon Myelinisierung5Zelltyp erhebliche Mengen von Myelin Schutt von sterbenden Oligodendrozyten generiert. Wir und andere haben gezeigt, dass Clearance von Myelin Schutt in erster Linie die Verantwortung der Infiltration BMDMs5,6,7. Allerdings wurde in Verletzung des Rückenmarks Websites Engulfment von Myelin Schutt vorgeschlagen, diese normalerweise entzündungshemmenden Zellen auf einer Pro-entzündliche Zustand5,8,9verschoben. Als wichtige Vermittler von Neuroinflammation im verletzten Rückenmark sind BMDMs wichtige klinische Ziele.
Um den Einfluss der BMDMs im verletzten Rückenmark untersuchen zu helfen, haben wir eine in-Vitro -Modell, um direkt zu studieren, wie BMDMs auf Myelin Schmutz reagieren entwickelt. Zur Verbesserung der biologischen Relevanz sind primären murinen BMDMs und frisch isolierte Myelin Ablagerungen in diesen Untersuchungen verwendet. Als solche, die hier vorgestellten Methoden auch detailliert die Isolation und die Kultur der primären murinen BMDMs und eine modifizierte Saccharose gradient Technik, murine CNS isolieren abgeleitet Myelin Schutt10,11,12. Myelin Schmutz kann leicht beschriftet werden, mit einem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-), zu verfolgen, die die Internalisierung von BMDMs. CFSE-für diese Anwendung geeignet ist, denn es ist nicht zytotoxisch und seine schmalen Fluoreszenzspektrum Genehmigungen Multiplexen mit anderen fluoreszierende Sonden13,14. Nach Phagozytose Myelin Schutt Lipide sind durch den Lysosomen transportiert und als neutralen Lipiden in intrazellulären Lipid Tröpfchen5verpackt. Um diese intrazellulären Lipid-Ansammlung zu quantifizieren, präsentieren wir ein Öl rot O (ORO) Färbung Methode optimiert für quantitative Bildanalyse. Diese einfache Färbung Methode produziert robuste reproduzierbare Ergebnisse und Quantifizierung15. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Myelin Schutt Phagozytose und Lipid-Aufbewahrung mit begrenzten Spezialausrüstung.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Solution</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>United States Origin</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plates</td><td>VWR</td><td>10062-896&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polystyrine, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO for Reconsitution Provided</td></tr><tr><td>Fluoro-gel with Tris Buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td></tr><tr><td>Hand Held Rotary Homogenizer</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind reife Leukozyten, die eine wichtige physiologische Rolle als professionelle Phagozyten in der Lage, der clearing-einer Vielzahl von Teilchen dienen. Normalerweise BMDMs werden daran gehindert, das zentrale Nervensystem (ZNS), aber nach einer Verletzung können sie ohne weiteres zu infiltrieren. Einmal eignen sich in das verletzte Gewebe CNS, BMDMs Primärzelle verantwortlich für die Abfertigung von Verletzungen abgeleitet Zelltrümmer, einschließlich große Mengen an Lipid reichen Myelin Schutt. Die neuropathologische Auswirkungen BMDM Infiltration und Myelin Schutt Phagozytose innerhalb des ZNS sind komplex und nicht gut verstanden. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die direkten in-vitro- Untersuchung der BMDMs im Rahmen der CNS Verletzung. Wir decken murinen BMDM Isolierung und Kultur, Myelin Schutt Vorbereitung und Tests um BMDM Myelin Schutt Phagozytose zu beurteilen. Diese Techniken robuste quantifizierbare Ergebnisse ohne signifikante spezialisierte Geräte oder Materialien zu produzieren, aber können leicht angepasst werden, um die Bedürfnisse der Forscher.

Behandlung von BMDMs mit CFSE beschriftet Myelin Ablagerungen sollten klare Internalisierung (Abbildung 2) ergeben. Während eine 3-stündigen Interaktionszeit für BMDMs, genügend zusätzlichen Myelin Schutt für robuste nachgelagerten Erkennung phagozytieren ausreicht, kann mit weniger als 1 Stunde von Interaktion intrazelluläre Akkumulation beobachtet werden. Jedoch kann einige Myelin Trümmer nach dem Waschen immer noch auf der Zelloberfläche vorhanden sein. Dies ist möglicherweise aufgrund von nicht genügend Wasch- oder Partikel, die nicht vollständig in den frühen Phasen der Phagozytose verinnerlicht wird.
Während BMDMs Myelin Schmutz schnell verinnerlichen können, lysosomalen Verarbeitung vor ORO färbbaren Lipid Tröpfchen Form erforderlich. Um zu demonstrieren, wurden BMDMs mit Myelin Schutt für 90 Minuten inkubiert, gewaschen und für zusätzliche Mengen an Zeit vor der Fixierung und Färbung (Abbildung 3) kultiviert. Abbildung 4 zeigt, dass es eine Verzögerung zwischen dem Behandlungsbeginn und neutral Lipid aussehen. Anzumerken ist, dass Lipid Aufbewahrung während der Kultur nicht stabil ist. BMDMs startet um kumulierte Lipide bald nach Tropfenbildung zu metabolisieren. Daher empfehlen wir warten nicht länger als 24 Stunden zwischen waschen Weg nicht verschlungen Myelin Schutt und Fixierung.
Quantifizierung der ORO gefärbten Bereich zeigt die Rate der Myelin Fettstoffwechsel in BMDMs (Abbildung 5). Nach einer 90-minütigen Interaktion wurden Zellen nach Inkubation in frischen CMCM zurückgegeben. In der Frühzeit der Chase in frisches Medium verstoffwechseln die BMDMs die phagozytiertes Myelin Schutt Lipidkomponente in neutralen ORO färbbaren Lipide. Eine stetige Zunahme im positiven Bereich ORO ist typisch in den Stunden nach der Interaktion. Nach 24 Stunden jedoch die BMDMs Effluxed haben oder einen erheblichen Teil der intrazellulären Lipide metabolisiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Vertreter BMDM Kulturen. Paar adhärente Zellen werden zunächst beobachtet werden. Am 3. Tag werden alle nicht-anhaftende Zellen entfernt. Tag 7 werden Reifen Knochenmark stammenden Makrophagen eingehalten. Skala = 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Vertreter Bilder von BMDM Myelin Schutt Phagozytose Assay. Zellen wurden behandelt mit 1mg/mL CFSE beschriftet Myelin Schutt für 1 Stunde vor dem Waschen und Fixierung mit 4 % PFA. Verinnerlichten Myelin Trümmer kann mit standard GFP Filtersätze auf einem Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop visualisiert werden. Skala = 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Diagramm der Versuchsplanung Öl rot O (ORO). BMDM sind mit 1mg/mL Myelin Schutt (1: 100 Verdünnung) für 90 Minuten, gefolgt von Wasch- und Kultur in frischem Medium vor Fixierung behandelt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : ORO Färbung des BMDM nach Myelin Schutt Phagozytose. Folgenden Fixierung mit 4 % PFA zu den angegebenen Zeitpunkten, BMDMs mit ORO und Hoechst 33258 befleckt waren. Repräsentative Bilder für jeden Zeitpunkt angezeigt werden. Skala = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : Quantitative Bildanalyse von ORO beflecken. Für die Quantifizierung der ORO Färbung wurden 3 Brunnen bei 20 X mit 5 Bildern pro Bohrloch abgebildet. Alle Bildeinstellungen Erwerb waren identisch. Fehlerbalken = SEM (n = 3). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

12.6K Aufrufe.  Florida State University. Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

Serie: In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Neurowissenschaften

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Phagozytäre Assay-Bewertung von neonatalen Makrophagen aus dem Knochenmark 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer reproduzierbaren Methode zur Isolierung von Makrophagen aus dem Knochenmark von neugeborenen Mäusen zur Förderung der Immunantwort im frühen Leben

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...