Die Autoren sind dankbar für Keali Röhm, Louisa Frieß und Heike Menzel für ihre kompetente technische Unterstützung; zu Helga Brünner für die Pflege der Tiere; und Chistopher S. Ward für die Erzeugung und Verteilung von optischen Disector Grid Plugin für die ImageJ-Software.

<ol>
	<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+reduce+nigrostriatal+deficits+in+the+6-hydroxydopamine+mouse+model+of+Parkinson's+disease.">Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease.</a> J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. 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Grid_Overlay.java Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</a> (2010)</li><li>. cell_counter.jar Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> (2010)</li><li>Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. 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C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons+(nuclei+A8,+A9,+and+A10):+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat.">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li><li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL/6+Mice.">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).</li></ol>

C. W. I. diente auf wissenschaftliche Boards für Merz Pharmaceuticals LLC und TEVA; wird finanziell für Reisen von Ipsen, Merz Pharmaceuticals LLC und Allergan, Inc.; und Lautsprecher Honorare von Merz, TEVA und Allergan, Inc. außerhalb der eingereichten Arbeit erhalten hat. J. V. diente als Berater für Boston Scientific, Medtronic und AbbVie und erhielt Honorare von Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan und GlobalKinetics außerhalb der eingereichten Arbeiten.

Stereologie beginnt mit Gewebe Verarbeitung. Das serielle Schneiden von SN Gewebe muss sorgfältig durchgeführt werden, zur Verhinderung des Verlusts der Abschnitte während der stereologischen Analyse. Darüber hinaus ist ein wesentlicher Schritt, eine Hemisphäre zu kennzeichnen, um das Recht von links SN zu unterscheiden, bei der Durchführung der Stereologie. Platzieren ein kleines Loch am oberen Teil der Hirnstamm erzeugt die besten Ergebnisse in der vorgestellten Studie. Darüber hinaus schneiden da die Arbeit mit den Anforderungen der optischen Plasmafraktionierer-Methode, die das Gewebe in dicke Schichten von ca. 30-40 µm, anstatt die 5-10 µm häufiger in Immunohistochemistry, Antikörper und andere Inkubation Fluid Gewebe eindringen während verwendet immunhistochemische Färbung muss gewährleistet werden, so wie mit einem Waschmittel.
Immunhistochemische Färbung für dopaminergen Neuronen mit der TH-Antikörper Etiketten SN Neuronen sowie Neuronen im ventralen Haubengebiet (VTA), befindet sich medial aus der SN und Neuronen im Retrorubral Bereich. Somit ist ein weiterer kritischer Punkt bei der Durchführung der Stereologie von der SN Wissen der Maus SN-Anatomie, da SN Neuronen ausschließlich durch standard immunhistochemische oder histologische Färbung sichtbar gemacht werden können nicht. Stattdessen sind die Anerkennung der anatomischen Landmarken wie subthalamic Nucleus, das Retrorubral-Feld und das VTA wichtig zu bestimmen, das ganze Ausmaß der SN17,18,19.
Bewertung der neuronalen Zahl muss zuverlässig und reproduzierbar sein. Obwohl verschiedene Gruppen im Handel erhältlichen Stereologie Setups verwenden, unterscheiden sich Zahlen von TH + SN dopaminergen Neuronen im wt Mäuse, entnommen aus verschiedenen Publikationen, in Nummer17,20. In Baquet Et Al., Design-basierte stereologischen Analyse in 3 bis 4 Monate alten männlichen und weiblichen C57BL/6J wt Mäuse mit einem handelsüblichen Stereologie System ergab eine geschätzte 8.716 ± 338 TH + SN dopaminergen Neuronen (Bereich: 7.546-9.869)17 . Im Gegensatz dazu Smeyne Et Al. gefunden Sie in 9 bis 16 Wochen alten männlichen C57BL/6J Mäuse, die 0,9 % Kochsalzlösung i.p, von 6.302 ± 262 Zellen bis hin zu 6.861 ± 338 Zellen, mit einer neueren Version des gleichen Stereologie System20erhielten weniger TH + SN Zellen. Allerdings war der erste Autor auch der letzte Autor in dem Baquet Et Al. Papier, daher unterschiedlichem Erfahrungsschatz als Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse ausschließen. Diese widersprüchlichen Daten spiegeln die Notwendigkeit für eine stereologischen Quantifizierungsmethode, die weniger Variabilität zeigt. Um die Technik der Quantifizierung und die Formel zu überprüfen, wurde ein Vergleich der Ergebnisse der SN Nummer Zellzahl mit der beschriebenen Methode mit einer Quantifizierung mit dem im Handel erhältlichen Stereologie-Setup durchgeführt. Statistische Analyse zeigte keine signifikante Unterschiede beim Vergleich der Zahlen von TH + dopaminergen Neuronen in der rechten Ecke und links SN wt Mäuse mit beiden Techniken der Zelle Quantifizierung bestimmt damit zeigen, dass diese Methode für die stereologischen Schätzung der SN Neuronen in den Mäusen.
Der wesentliche Vorteil des beschriebenen Verfahrens ist, dass es die Kosten, die in der Regel verbunden mit der Umsetzung der Stereologie Techniken reduziert für die Zellzählung sind. Ein zweiter Vorteil ist, dass für das beschriebene Verfahren Stapel Bilder von der SN gespeichert werden und jederzeit (auch gleichzeitig) durch einen anderen Prüfer analysiert werden können. Darüber hinaus sind die Akquisition und Analysen der Fluoreszenzbilder mit dieser Methode möglich, weil Graustufenbilder mit "Lookup-Tabellen" in ImageJ gefärbt werden können. Es gibt jedoch Einschränkungen zu dieser Studie. Erstens ist die Quantifizierung der Handynummer mehr Zeit in Anspruch (ca. 50 %) als Quantifizierung mit dem im Handel erhältlichen Stereologie System. Dies ist vor allem aus zwei Gründen: 1. Stapel Bilder von den SN getroffen werden und 2. Berechnung der optischen Disector Platzierung innerhalb jeder SN und Berechnung der geschätzten Zellzahl und CE muss manuell unter Verwendung der Berechnung Vorlagen durchgeführt werden. Zweitens kann mindestens mit dem System in unserem Labor, die Analyse nur auf Graustufenbildern wegen der Dateigröße von Farbbildern, erfolgen die von ImageJ nicht verarbeitet werden konnte. Dies kann ein Problem darstellen, wenn es notwendig ist, zwei unterschiedliche Zellpopulationen zur gleichen Zeit einen doppelten Fleck zu quantifizieren. Es wäre schwieriger, zwei unterschiedlich gefärbten Zell-Populationen in Graustufenbilder zu unterscheiden. Obwohl eine motorisierte Bühne (X, y, Z-Ebene) und die entsprechende Software in vielen Laboratorien arbeiten mit histologischen Proben zur Verfügung stehen, werden die Verwaltung und die Qualität der Bilder stapeln die Mikroskop-Software und die Leistung der verlassen sich daher auf die angeschlossenen Rechner.
Es gibt Möglichkeiten, die Beschränkungen zu überwinden. Indem die Berechnung-Vorlagen, die wir entwickelt, könnte die Programmierung von Makros, einige der derzeit manuell ausgeführten Prozesse zu automatisieren reduzieren Sie Fehler oder Ungenauigkeiten während stereologischen Bewertung und beschleunigen die Geschwindigkeit der Arbeit. Darüber hinaus sollte mit der Weiterentwicklung von ImageJ und andere imaging-Software, sowie mit zunehmender Rechenleistung der Computer, größere Bild-Dateien kein Problem in naher Zukunft dar. Daher werden Analysen der Hellfeld Farbbilder mit der beschriebenen Technik beherrschbar.
Die beschriebene Technik beschränkt sich nicht auf Analysen von TH + SN Zellen jedoch erweitert werden, um andere Zelltypen und Hirnregionen von Nagetieren zu analysieren. Hierzu die anatomischen Grenzen der Region von Interesse müssen ermittelt werden, und die jeweiligen Färbung durchgeführt werden muss. Darüber hinaus kann diese Technik zu dickeren Bereiche angepasst werden. Hierzu muss die Übernahme der Bilder stapeln mehr Stapel Bilder liefern angepasst. Zum Beispiel wenn 40 µm dicken Abschnitt erforderlich sind, montiert die tatsächliche Dicke des Abschnitts nach Gewebe Färbung bewertet werden muss, um die notwendige Höhe der optischen Disector zu bestimmen. Subtrahieren Sie 6 µm (3 µm Schutzbereichen oben und unten) aus der mittleren Gewebe Dicke und nehmen Sie das Ergebnis als die Höhe des optischen Disector.

Die Quantifizierung der neuronalen Zellennummer ist von zentraler Bedeutung in der präklinischen Krankheit Parkinson Forschung zur Bestimmung der Höhe der Neurodegeneration in der Substantia Nigra (SN)1,2. Die unparteiische stereologischen Schätzung der Zellzahl in einer Region von Interesse gilt als der Goldstandard3,4,5.
Vor dem Aufkommen der unvoreingenommene Stereologie wurde die Anzahl der Neuronen in den Abschnitten bewertet, durch Manipulation der gezählten Zelle Profile für die Variable Wahrscheinlichkeiten zu korrigieren, dass Neuronen in Sicht in einem Abschnitt kommen. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden wurde die Korrektur des quantifizierten Zellenzahlen von Abercrombie6beschrieben. Diese Methode versucht, zu berücksichtigen, dass die Zellen mehr als einmal quantifiziert werden können, wenn in benachbarten Dünnschliffe Fragmente der gleichen Zelle gefunden werden. Aus diesem Grund generiert Abercrombie und anderen Autoren Gleichungen, die Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der gezählten Zellen7,8erforderlich. Diese Annahmen wurden jedoch in der Regel nicht realisiert und daher führte zu systematischen Fehlern und Abweichungen von der tatsächlichen Zellzahl (d. h. Bias). Darüber hinaus konnte die Vorspannung nicht durch zusätzliche Probenahme3reduziert werden.
Für die stereologischen Schätzung der Zelle Zahlen mit Hilfe der optischen Plasmafraktionierer sind mathematische Prinzipien angewandt, um direkt die Zellzahlen direkt in einem definierten, 3-dimensionale Volumen schätzen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nicht Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der Zellen gezählt werden. So geschätzte Zellzahlen sind näher an die wahren Werte und näher als die Größe der Stichprobe (d.h., unvoreingenommene)3erhöht. Weil viele Regeln befolgt werden müssen, wenn Sie Stereologie verwenden, um die Methode neutral zu halten, Ready-to-Use kommerzielle Stereologie Systeme wurden entwickelt (Übersicht finden Sie unter Schmitz und Hof, 2005-4). Spezialisierte Stereologie Systeme implementieren Sie Design-basierte stereologischen Methoden mit a priori definiert Sonden und Stichprobenpläne für stereologischen Bewertungen, die zur Unabhängigkeit von Form, Größe, räumliche Verteilung und Ausrichtung der führen die Zellen zu analysierten4,9. Handelsübliche Stereologie Systeme sind jedoch teuer; Dies kann die Umsetzung in neue Forschung einschränken.
Das Ziel dieser Studie war es, eine brauchbare Technik für die Design-basierte stereologischen Schätzung der dopaminergen Zellzahlen in der Maus SN, beschäftigt die optische Plasmafraktionierer-Methode und mit standard-Mikroskopie Ausrüstung (z. B. Licht entwickeln Mikroskop, Mikroskop standard Software und einer motorisierten X, y, Z-Phase). Hierfür ist eine Anleitung, wie Sie Maus Hirngewebe zu verarbeiten und SN Zellzahlen mit Design-basierte unvoreingenommene Stereologie abzuschätzen vorgestellt. Darüber hinaus sind Vorlagen für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen und Koeffizienten der Fehler (CE) zur Verfügung gestellt.
Die hier beschriebene Methode beschränkt sich nicht auf die Analyse der SN, aber für den Einsatz in anderen anatomisch definierten Regionen des Gehirns Maus oder Ratte angepasst werden kann. Zum Beispiel, wurde unvoreingenommene Stereologie zur neuronalen Zellzahlen in der Hippocampus-10 und den Locus Coeruleus11zu schätzen. Darüber hinaus können auch Zelltypen als Neuronen, wie Astrozyten12 und Mikroglia13, beurteilt werden. Diese Methode kann daher nützlich für Wissenschaftler, die unvoreingenommene Stereologie in ihrer Forschung durchführen wollen, aber nicht bereit sind, eine Menge Geld um ein Stereologie System zu kaufen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Paxinos mouse atlas</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet &#38; created by Paul Halasz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">brain matrix slicer mouse</td>
			<td style="width:217px;">Zivic Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS 001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose /D(+) Saccharose&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopentane</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">3927.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040931000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32205-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phosphate buffered saline ingredients:</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1048731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">di-sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1049360500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:217px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A4503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100-100ml</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0</td>
			<td style="width:217px;">Kem En Tec</td>
			<td style="width:119px;">4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">H2O2/ Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1072090250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">avidin/biotin reagent</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32050</td>
			<td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td style="width:217px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">Ab112</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L</td>
			<td style="width:217px;">vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-1000</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
			<td style="width:217px;">MBF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Visiview</td>
			<td style="width:217px;">Visitron Systems GmbH</td>
			<td style="width:119px;">3.3.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:217px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue-TEK OCT</td>
			<td style="width:217px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dry ice</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">grid overlay plugin</td>
			<td style="width:217px;">Wayne Rasband</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell counter plugin</td>
			<td style="width:217px;">Kurt de Vos</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">optical disector macro</td>
			<td style="width:217px;">Christopher Ward</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6N male mice</td>
			<td style="width:217px;">Charles River, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperFrost Plus coated object slides</td>
			<td style="width:217px;">Langenbrinck, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25G needle Microlance 3</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REGLO Analog Infusion pump</td>
			<td style="width:217px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM 829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">StereoInvestigator system</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">BX53 microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">self-assorted stereology</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Visiview</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Axiophot2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment

In präklinischen Krankheit Parkinson Forschung unbedingt Analyse des Nigrostriatal Trakt, einschließlich Quantifizierung der dopaminergen Neuronenverlust in der Substantia Nigra. Um die gesamte dopaminergen Neuron Anzahl abschätzen zu können, gilt unvoreingenommene Stereologie mit der optischen Plasmafraktionierer-Methode heute der Goldstandard. Da die Theorie hinter der optischen Plasmafraktionierer Methode Komplex ist und Stereologie schwierig ist, ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen, sind mehrere handelsübliche komplette Stereologie-Systeme, die die notwendige Software enthalten, rein vorhanden für Zelle zählen Gründe. Da Kauf eine spezialisierte Stereologie Setup nicht immer möglich, aus vielen Gründen ist, dieser Bericht beschreibt eine Methode für die stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronale Zelle mit standard-Mikroskopie zählt, einschließlich einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, Z-Ebene) mit imaging-Software und einem Computer für Analyse. Eine schrittweise Erklärung wird zum stereologischen Quantifizierung der optischen Plasmafraktionierer Methode durchführen, und vorprogrammierte Dateien für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen werden zur Verfügung gestellt. Um die Genauigkeit dieser Methode zu bewerten, wurde ein Vergleich mit Daten aus einem handelsüblichen Stereologie Apparat durchgeführt. Vergleichbare Zellzahlen wurden durch dieses Protokoll und dem Stereologie Gerät, so zeigen die Präzision dieses Protokolls für unvoreingenommene Stereologie gefunden.

Die vorgestellte Methode, die geschätzte Anzahl der TH + dopaminergen Neuronen in der rechten Ecke SN lag zwischen 7.363 und 7.987 Zellen und in der linken SN, verwenden zwischen 7.446 und 7.904 Zellen. So war die durchschnittliche Anzahl von dopaminergen Neuronen (± SEM) 7.647 ± 83 Zellen für die Rechte SN und 7.675 ± 66 für die linke SN. Die berechneten CE für jedes Tier war niedriger als 0,08 (Bereich: 0.0.73.-0.079) (Abbildung 7). Um die Vergleichbarkeit dieser Methode mit handelsüblicher und spezialisierten Stereologie Systemen zu ermitteln, wurden auch SN Zellzahlen quantifiziert mit dem Stereologie Setup (Abbildung 8). Die Zählung Parameter waren: Rastergröße, 130 x 130 µm; Counting-Rahmen, 50 x 50 µm; Schutzbereichen, 3 µm. Abschnitte wurden analysiert mit einem 100 X / 1,25 numerische Apertur Ziel am BX53 Mikroskop. Die geschätzte Bevölkerung von TH + SN Neuronen mit reichten von 7.067 8.105 Zellen/SN und 7.164 auf 8.015 Zellen/SN auf der rechten und linken Seite jeweils mittlere Schnittdicke. Die mittlere Anzahl der neuronale wurde als 7.535 ± 155 für das Recht SN und 7.699 ± 128 Zellen für die linke SN berechnet. Die Gundersen-CE (m = 1) war ≤0.08 in jeder SN quantifiziert (Abbildung 7). Statistische Analyse mit gepaarten Student t-Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den TH + Zellzahlen der beiden Methoden in der rechten oder der linken SN (meine ± SEM; rechts: t (5) = 0.9524, P &#62; 0,05; links: t (5) = 0.2928, P &#62; 0,05) (Abbildung 7 ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56103/56103fig1.jpg"> 
Abbildung 1. Repräsentative Bilder von Maus SN gebeizt für dopaminergen Neuronen. 
(a) ein Überblick über einen Vertreter Maus SN wird im oberen Bereich angezeigt. Beachten Sie das kleine Loch im oberen Teil der rechten Hirnstamm, der der rechten Seite markiert. Höherer Vergrößerung der Inset (Black Box) zeigt TH + dopaminergen Neuronen. (b) eine Reihe von TH-gefärbten SN Abschnitten wird gezeigt, für die ganze Maus SN von rostral zur kaudalen. (c) jeder Abschnitt ist von aufeinander folgenden Abschnitt durch 120 µm. Maßstabsleisten getrennt: a, oberen Bereich 500 µm; untere Leiste, großes Bild, 100 µm; untere Leiste, Inset, 50 µm; b, 500 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/56103fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Abbildung 2. Erwerb von Bildern für die stereologischen Analyse über die imaging-Software. (a) roter Pfeil: Öffnen Sie das Fenster Erwerb; grüner Pfeil: gesetzt, binning, "2;" "blauer Pfeil: das live-Bild zeigen. (b) ein neues Fenster mit dem live-Bild (roter Pfeil) wird geöffnet. (c) roter Pfeil: Wählen Sie das Menü "Bühne"; grüner Pfeil: Wählen Sie die Option "Scan-Slide"; blauer Pfeil: Aktivieren Sie die Option "Scan-Slide"; schwarzer Pfeil: definieren die linke obere Ecke. Schwarzer Pfeil (d) : definieren die untere rechte Ecke. (e) roter Pfeil: Wählen Sie das Menü "Z-Serie"; grüner Pfeil: Überprüfen Sie die "Z-Plane-Serie"; blauer Pfeil: "Ansicht oben Offset" zu suchen, die oben im Abschnitt zu beginnen. Roter Pfeil (f) : Klicken Sie auf "Stop Blick Top" zu definieren, die oben im Abschnitt; grüner Pfeil: "Ansicht unten Offset" zu suchen, die unten im Abschnitt zu beginnen. (g) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Stop Ansicht unten", die unten im Abschnitt zu definieren. (h) roter Pfeil: subtrahieren 3-µm-Guard zone aus der "Top-Offset" und legen Sie das Ergebnis in die "Offset Top" Slot. (i) roter Pfeil: 13 µm aus der "Top-Offset" Zahl subtrahieren und legen Sie das Ergebnis in den Schlitz "unten Offset"; grüner Pfeil: definieren Sie 14 Stufen, das entspricht einer Z-Ebene Stärke von 13 µm; blauer Pfeil: eine Größe von 1,00 µm, das entspricht einer 1 µm Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Bildern definieren. (j) roter Pfeil: Wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern der Datei; blauer Pfeil: Klicken Sie auf "Sequenz" den Erwerb von Bildern beginnen. (k) roter Pfeil: Klicken Sie auf "In Bearbeitung"; überprüfen Sie die folgenden Parameter: grüner Pfeil: "Alle Ebenen"; blauer Pfeil: "Sequence"; schwarzer Pfeil: "Montage"; grauer Pfeil: "Nähte"; lila Pfeil: schnell. (l) klicken Sie auf den gelben Pfeil beginnen Nähte die Bilder. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/Fig_2.pdf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56103/56103fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Verarbeitung der Bilder für die stereologischen Analyse. (a) ein Beispielbild Stack eine Maus SN entnommen. (b und c) Nach dem randomisierten einsetzen eines Rasters darüberliegende SN (türkisfarbene Linien, b) wird die SN in einem zweiten Schritt (blaue Linie, c) beschrieben. (d) eine optische Disector ist in das SN-Stack-Bild eingefügt. (e) sechs aufeinander folgenden fokalen Flugzeuge im SN-Stack Bild decken in der Z-Ebene insgesamt 13 µm. Skalieren Sie Bars: a-d, 100 µm; e, 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/56103fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Abbildung 4. Reihenfolge der stereologischen Bewertung mit ImageJ. (a) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Datei" → "Öffnen", um ein Stack-Bild zu öffnen. (b) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Analysieren" → "Set Scale". (c) rote Pfeile: definieren Sie die Parameter für den "Abstand in Pixel," "Bekannte Distanz" und "Einheit der Länge." (d) roter Pfeil: Wählen Sie "Plugins" → "Raster." (e) roter Pfeil: Wählen Sie "Linien"; grüner Pfeil: Überprüfen Sie "Random Offset;" blauer Pfeil: Legen Sie die Größe des Rasters in µm2. Roter Pfeil (f) : Klicken Sie auf "Bild" → "Typ" → "RGB-Farbe." Roter Pfeil (g) : Wählen Sie das Pinselwerkzeug; grüner Pfeil: definieren Sie die "Pinsel Breite" als 11. Roter Pfeil (h) : anfangen einzukreisen der SNpc. (i) rote Pfeile zeigen die eingekreisten SNpc. (j) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Analysieren" → "Set Scale" und entfernen Sie die Skala (k) durch Klicken auf "Klicken Sie auf Entfernen Scale," dargestellt durch die rote Pfeil. Beachten Sie die Änderung von µm (k, grüner Pfeil) Pixel (l, roter Pfeil). (m) einen Screenshot (rote Pfeil zeigt in Richtung der Screenshot) und (n) öffnen Sie die Screenshot-Image-Datei mit ImageJ. (o) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Punkt." (p) roter Pfeil: einfügen eine Bürste-Breite von 25. (Q) der rote Pfeil zeigt die markierten Planquadrate, die die SNpc. (R) wenden Sie sich an der rote Pfeil in der oberen linken Ecke ein Planquadrat verweist, die die SN gehört. Setzen Sie den Cursor an dieser Stelle, die x-und y-Koordinaten für die "optische Disector-Position" (Schritt 4) gemessen und in die "optische Disector position.xlsx" Vorlage (s, roter Pfeil) eingefügt. Roter Pfeil (t) : Wählen Sie "Plugins" →"Makros" → "bearbeiten." Roter Pfeil (u) : Wählen Sie die Datei "opt_dis_grid.txt". Ein neues Fenster öffnet sich (V). Legen Sie die Größe des "Usergrid", in Pixeln (V, roter Pfeil) und die x-und y-Koordinaten (V, grüner Pfeil). (w) führen Sie das Makro "opt_dis_grid.txt" (roter Pfeil). (X) eine optische Disector erscheint in der Mitte der zuvor definierten Planquadrat (roter Pfeil). Roter Pfeil (y) : Klicken Sie auf "Plugins" → "Cell Counter." (Z) Initialisieren der Zelle Zähler (roter Pfeil) und wählen Sie eine Markierung (grüner Pfeil). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/Fig_4.pdf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56103/56103fig5.jpg"> 
Abbildung 5. Platzierung der optischen Disector. (a) Darstellung der optischen Disector für unvoreingenommene Stereologie verwendet. Die optische Disector besteht aus einem 3-dimensionalen Würfel. Drei schematische Zellen sind innerhalb der optischen Disector sichtbar. Die stereologischen Regeln für die Quantifizierung der Zellen zeigen, dass Zellen berühren die roten beschrifteten Seiten des optischen Disector ausgeschlossen (Erythrozyten), während Zellen, die das Grün Kontakt beschriftete Seiten in Zelle zählen (grüne Zellen) enthalten sind. (b) eine optische Disector wird in jedes Planquadrat platziert, die in Kontakt mit der SN kommt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/56103fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56103/56103fig6.jpg"> 
Abbildung 6. Berechnung der optischen Disector und Abschätzung der Anzahl von Zellen. (a) eine Beispielrechnung für die Positionierung des optischen Disector durchgeführt. (b) ein Beispiel für die Schätzung der gesamten Zellennummer. Die Zahl der quantifizierten Zellen werden in die grauen Felder eingefügt, während die Parameter der stereologischen Quantifizierung in die gelben Felder eingefügt werden. Die geschätzte Handynummer und die CE werden in die blauen Felder angezeigt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/56103fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56103/56103fig7.jpg"> 
Abbildung 7. Vergleich der Zelle Parameter zählen. (a) vergleicht den geschätzten TH + Zellzahl der rechten und linken Maus SN erhalten von der beschriebenen stereologischen Methode mit den Daten aus der Analyse mit dem im Handel erhältlichen Stereologie System erworben zeigten keine signifikanten Unterschiede. Eine detaillierte Liste der erhaltenen Daten des Rechts (b) und Links (c) SN ist mit den geschätzten Zellzahl pro Tier, die Anzahl der Zellen, die tatsächlich gezählt, die Anzahl der Abschnitte gezählt und die Anzahl der Probenahmestellen (z. B. gegeben. die Anzahl der Raster-Quadrate gezählt) für beide Methoden. Die Werte in die Balkendiagramme sind der Mittelwert ± SEM Daten aus 6 Mäuse. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/56103fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56103/56103fig8.jpg"> 
Abbildung 8. Quantifizierung der Zellen mit dem im Handel erhältlichen Stereologie System. (b) Der Umriss der SN wird gezeichnet und (c) die Positionen der optischen Disectors werden automatisch ermittelt. (d-e) Jedes optische Disector für Zellzahl von konzentriert sich entlang der Z-Ebene analysiert. Sechs aufeinander folgenden fokale Flächen innerhalb der SN werden angezeigt. Die roten und grünen Linien entsprechen der optischen Disector. Skalieren Sie Bars: a-d, 100 µm; e, 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/56103fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1. opt_dis_grid.txt <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/opt_dis_grid.txt">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2. Optische Disector position.xlsx <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/optical_disector_position.xlsx">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3. Berechnung der Zelle count.xlsx <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56103/calculation_of_cell_count.xlsx">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment at JoVE.

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.

Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

stereological-estimation-dopaminergic-neuron-number-mouse-substantia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K Aufrufe.  University Hospital of Würzburg. Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.

Serie: Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells or structures. These methods have been revolutionary for quantitative analysis of the mammalian brain, in which volumetric cell populations are too high to count manually, and stereology is now the technique of choice whenever estimates of three-dimensional quantities need to be extracted from measurements on two-dimensional sections. All stereological methods are in principle unbiased; however, they rely on proper knowledge about the structure of interest and the characteristics of the tissue. Stereology is based on Systematic Uniformly Random Sampling (SURS), with adjustment of sampling to the most efficient level in respect to precision, providing reliable, quantitative information about the whole structure of interest. Here we present the optical fractionator in conjunction with BrdU immunohistochemistry to estimate the production and survival of newly-formed neurons in the granule cell layer (including the sub-granular zone) of the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation, which is among the most potent stimulators of neurogenesis. The optical fractionator technique is designed to provide estimates of the total number of cells from thick sections sampled from the full structure. Thick sections provide the opportunity to observe cells in their full 3-D extent and thus, allow for easy and robust cell classification based on morphological criteria. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of the optical fractionator provides accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Here, we present a stereological method, the optical fractionator, used to quantify the formation of new neurons, and their survival, in the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of stereological methods ensures accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Die optische Fraktionator-Technik zur Schätzung der Zellzahlen in einem Rattenmodell der elektrokonvulsiven Therapie

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a useful method to quantify neuronal profiles of various brain structures. Here we provide a software-based stereology protocol to estimate the total length of cholinergic fibers in the nucleus basalis of Meynert (NBM) of the basal forebrain. The method uses a space ball probe for length estimates. The cholinergic fibers are visualized by choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining with the horseradish peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detection system. The staining protocol is also valid for fiber and cell number estimation in various brain regions using stereology software. The stereology protocol can be used for estimation of any linear profiles such as cholinoceptive fibers, dopaminergic/catecholaminergic fibers, serotonergic fibers, astrocyte processes, or even vascular profiles.

Neuronal fiber length within a three-dimensional structure of a brain region is a reliable parameter to quantify specific neuronal structural integrity or degeneration. This article details a stereological quantification method to measure cholinergic fiber length within the nucleus basalis of Meynert in mice as an example.

Stereologische Abschätzung der cholinergen Faserlänge im Nukleus Basalis von Meynert des Maushirns

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...