We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Alle Verfahren in der aktuellen Studie wurden unter Verwendung von Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) durchgeführt Protokolle für die Behandlung der Tiere für biologische Studien, La Jolla, CA am Salk Institute genehmigt 1. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des resultierenden PIRK in den Primary Neuronal Culture <ol><li> DNA-Konstruktion <ol><li> Wählen Sie eine Zielstelle von Kir2.1 für Uaa Einbau. Exploit vor Wissen und Informationen über Struktur und Funktion von Kir2.1, so dass der gewählte Standort mit dem photoresponsive Uaa Incorporated ermöglicht eine optische Modulation von Kir2.1 - Funktion 21. </li><li> Konstruieren Sie eine rekombinante DNA, die für Kir2.1-Gen mit dem gewählten Standort der TAG-Amber-Stopcodon mutiert. Verwenden Sie die Standard - Klonierungstechniken 25 der Kir2.1-TAG - DNA in einem Säugetier - Expressionsplasmid zu klonen. </li><li> Clone tRNA / Synthetase-Gene, die für die Uaa spezifisch sind und übernehmen die Uaa als Reaktion aufdas TAG - Stopcodon in ein anderes Säugetier - Expressionsplasmids 21. Anmerkung: Für optimale Uaa Inkorporation unterschiedliche Promotoren und Kombinationen von Genkassetten (für tRNA-Synthetase und Kir2.1) können in verschiedenen Plasmiden getestet werden. </li><li> Erhalten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA unter Verwendung von Miniprep oder Maxipräp kommerzielle Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers. Etwa 1,9 des 260/280 Verhältnis ist optimal für die gereinigte DNA. Wenn nötig, führen Sie eine Agarose - Gelelektrophorese 25 Reinheit der prepped DNA zu überprüfen. Supercoiled Plasmid-DNA mit hoher Reinheit sind am besten für die neuronale Transfektion. </li></ol></li><li> Kultur Ratten-Hippocampus Primary Neurons <ol><li> Platz Glasplättchen (Kreise, 12 mm Durchmesser) in 24-Well-Platten, ein Deckglas auf jede Vertiefung und jede Schicht gut mit 250 ul von 0,5 mg / ml Poly-D-Lysin (in 100 mM Boratpuffer: 1,24 g Borsäure Säure und 1,90 g Natriumtetraborat in 400 ml H 2 O oder ddH 2 destilliertes deionisiertes </sub&gt; O bei pH 8,5) über 10 Stunden bei Raumtemperatur, abgedichtet. Bereiten Sie etwa 10-12 beschichtete Deckgläser pro Welpe. </li><li> Am Tag der Dissektion, sammeln neonatalen Gehirn von postnatalen Rattenjungen (1-4 postnatalen Tag), nachdem sie mit Isofluran und enthaupten anesthetizing. Anesthetize die Welpen in einer anesthetization Kammer mit Isofluran (2-4%). Warten Sie, bis sie das Bewusstsein verlieren und nicht auf taktile Reize zu reagieren und der Pfoten zu kneifen. </li><li> Unter Verwendung der Standardtechnik 26, sezieren Hippocampi aus dem Gehirn in warmer (~ 37 ° C) Kochsalzlösung (10 mM HEPES und 20 mM D-Glucose zugesetzt in Hanks balanced salt solution), und sammeln Hippocampi in einem konischen Röhrchen mit 4,5 ml warmem saline . </li><li> Hinzufügen 500 ul 2,5% Trypsin in die Hippocampi (0,25% Trypsin endgültige Konzentration), und inkubiere für 10 min in einem Wasserbad bei 37 ° C. </li><li> Spülen Sie das Gewebe mit einer Kochsalzlösung (3 x 10 ml) und verreiben. </li><li> Recover die dissoziierten Neuronen in 1 ml wArm Nährmedien Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) enthält, 21,2 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 2% B-27 und 0,1% Serum-Extender. Hinweis: In L-Glutamin und B-27 am Tag der Dissektion frischen Wachstumsmedien herzustellen. </li><li> Zähle die Neuronen mit einem Hämozytometer und Platten sie auf Deckgläschen in 24-Well - Platten bei 1,0-1,5 x 10 5 Zellen / well Dichte mit 500 &amp; mgr; l Wachstumsmedium , nachdem es durch einen 40 um Nylon - Mesh filtriert. </li><li> Inkubiere die neuronale Kultur bei 35 ° C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 2-3 Wochen. Für das beste Ergebnis zu vermeiden, so viel wie möglich während der Inkubation der Kultur zu stören. </li></ol></li><li> Calciumphosphat (Ca-P) Transfektion von primären neuronalen Kultur <ol><li> Make - Stammlösungen und lagern bei 4 ° C: 0,5 M BES (N, N -Bis [2-Hydroxy-ethyl] -2-aminoethansulfonsäure) Puffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); sterile ddH 2 O; steril 1 N NaOH. </li><li> Am Tag der Transfektion machen frisch 2,5 M CaCl 2 -Lösung in ddH 2 O und Sterilfilter mit 0,22 &amp; mgr; m - Filter. Machen frisch 2x BES-gepufferter Salzlösung (BBS) Puffer, der 50 mM BES, 1,5 mM Na 2 HPO 4 und 280 mM NaCl bei pH 7,00 (pH - Einstellung mit NaOH) und Sterilfilter mit 0,22 &amp; mgr; m - Filter. Hinweis: Berechne die Menge an CaCl &amp; sub2 ; -Lösung und BBS - Puffer für die Anzahl der Deckplättchen je transfiziert werden. Schauen Sie auch bei 1.3.4. </li><li> Ersetzen Sie das Kulturwachstumsmedium mit 500 &amp; mgr; l frisch Transfektion Wachstumsmedien vorgewärmten. (Transfektionsmedien mit MEM und 21,2 mM D-Glucose hergestellt werden). Hinweis: Verwenden Sie nicht das alte Medien wegwerfen. </li><li> Berechnen Sie die Menge von ddH 2 O und Vorbereitung zu geben, um die Transfektion Lösung (33 &amp; mgr; l pro jedes Deckglas) mit 1,65 ul CaCl 2, 0,7 ug DNA zu machen, und 16,5 &amp;# 181; l 2x BBS. </li><li> Bereiten Sie die Transfektionslösung, unmittelbar bevor es zu der Kultur hinzugefügt wird. Zur Vorbereitung ersten CaCl 2 und ddH 2 O verbinden , während sie langsam das Rohr gerührt. Weiter Rühren und langsam DNA in die Lösung hinzufügen. Schließlich fügen Sie 2x BBS-Puffer tropfenweise unter Rühren. </li><li> Sofort 30 ul der Lösung in jedes Deckglas neuronaler Kultur Transfektion hinzuzufügen. </li><li> Rock the Kulturschale ein paar Mal die Lösung zu mischen und bei 35 ° C in einem 5% CO 2 inkubieren: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 45 min-1 Std. Nach Neuronen mit der Transfektion Lösung inkubiert werden, sehr feine Ca-P-Ausscheidungen würde eine Schicht bedeckt Neuronen bilden. </li><li> Ersetzen die Transfektionsmedium mit 500 &amp; mgr; l vorgewärmten Waschpuffer (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM Glucose bei pH 7,3, sterile bei 35 gefiltert mit 0,22 &amp; mgr; m-Filter) und Inkubation6; C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 15-20 min. Ca-P-Ausscheidungen würden nach dem Waschschritt verschwinden. </li><li> Ersetzen Sie den Waschpuffer mit 500 ul frischem Wachstumsmedium. Auch das Wachstumsmedium mit dem gespeicherten Original-Medien ersetzen. </li><li> Fügen Sie die Uaa Cmn (vorgemischt in 50 &amp; mgr; l warme Wachstumsmedien) zu der Kultur 1 mM Endkonzentration zu erreichen. </li><li> Inkubieren der transfizierten Kultur bei 35 ° C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 12-48 h vor Assays. </li></ol></li><li> Ganze Zelle Aufnahme mit Lichtaktivierung <ol><li> Bereiten Sie extra / intrazellulären Lösungen. Die intrazelluläre Lösung enthält 135 mM Kaliumgluconat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP und 0,3 mM GTP Li 2 bei pH 7,4. Die extrazelluläre Aufzeichnungslösung enthält 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 10 mM HEPES bei pH 7,4. </li><liMikroskop ausgestattet mit 4-fach und 20-fach Ziele, Differentialinterferenzkontrast (DIC) und mCitrine Filter:&gt; die Elektrophysiologie Rig für whole-cell Patch-Clamp-Set up (Anregung: 495/10 nm, Emission: 525/25 nm); Manipulator; Patch-Clamp-Verstärker; Digitalisierer; Datenerfassungs und Analyse-Software. <ol><li> Installieren einer Leuchtdiode (LED) mit Emission von 385 nm durch das Mikroskop an der rig Licht von 1 cm entfernt in einem Winkel von 45 ° auf den Brennpunkt zu liefern. Überprüfen Sie die Leistung der LED mit einer Lichtleistungsmesser. </li></ol></li><li> Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glaselektroden einen kommerziellen Mikropipette Abzieher 3-6 MOhm Pipette Beständigkeit aufweisen. Folgen Sie Anweisungen des Herstellers der Mikropipette Puller einzurichten. <ol><li> Um zu testen, Pipette Widerstand, füllen Sie zuerst die Pipette mit der intrazellulären Lösung und positionieren Sie es auf dem Elektrodenhalter. Tauchen Sie die Pipette in eine 35-mm-Kulturschale mit der extrazellulären Lösung gefüllt ist, platziert auf dem Mikroskop platform. Tauchen eine Masseelektrode in die Schale, eine Schaltung zu vervollständigen. </li><li> Schalten Sie den Verstärker / Digitalisierer und eine Datenerfassungs-Software starten. Monitor-Pipette Widerstand mit einem Membran-Testprotokoll. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Deckglas des Neurons Kultur aus dem Inkubator heraus und spülen Sie einmal in der extrazellulären Lösung. Mit Vakuumfett, halten Sie das Deckglas in der Mitte einer 35 mm Kulturschale mit dem frischen extrazellulären Lösung gefüllt. </li><li> Legen Sie das Deckglas / Schale auf dem Elektro Mikroskop-Plattform. </li><li> Unter Verwendung der Standard - Patch - Clamp - Techniken, Patch ein Neuron mit mCitrine Fluoreszenz 27. Nehmen Sie die neuronale Aktivität mit Stromzange (I-Klemme) -Methode. Zuerst stellen Sie die Ruhepotential auf etwa -72 mV durch einen kleinen Strom zu injizieren. Dann einen Schritt Strom (10-200 pA) injizieren Dauerfeuer (5-15 Hz) der Aktionspotentiale zu induzieren. </li><li> Manuell oder die Datenerfassungssoftware verwenden, einen Impuls (a sin blinkengle Puls sec Dauer 100 ms -1) der LED mit dem Neuron Licht während der Aufnahme, und sehen , ob Aktionspotentiale betroffen sind. </li><li> In 0,5 mM BaCl 2 in das Bad und überprüfen , ob Aktionspotentiale gewonnen werden. </li></ol></li></ol> 2. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des Resultierende PIRK in der embryonalen Maus - Gehirn - In Vivo <ol><li> DNA-Konstruktion <ol><li> Entwerfen Sie die Plasmid-DNA in ähnlicher Weise wie in Schritt 1.1. Für in - vivo - Expression, einen starken Promotor wie CAG (Huhn beta-Aktin - Promotor mit CMV - Enhancer) verwenden. </li><li> Reinige DNA mit einer Endotoxin-freien maxiprep kommerziellen Kit nach dem Protokoll des Herstellers. Führen Phenol-Chloroform - Extraktion , gefolgt von Ethanolfällung 25 zu erwerben , extrem hohe Qualität DNA (kondensiert 2-5 ug / ul). </li></ol></li><li> In Utero Elektroporation zur embryonalen Maus - Neocortex Hinweis: Die grundlegende technique für in utero Elektroporation wurde zuvor 28 beschrieben. <ol><li> Anesthetize eine zeitlich schwangere Maus am embryonalen Tag 14,5 (E14,5) mit Natriumpentobarbital (intraperitoneale Injektion, 50 ug pro Körpergewicht Gramm) oder Isofluran (Inhalation, 2-4%). Überwachung der Narkosetiefe durch Verlust des Bewusstseins Überprüfung und keine Reaktion auf taktile Reize und Quetschen der Pfoten. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Bauchmittellinie. aussetzen Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und Fingerspitzen. </li><li> Injizieren etwa 1 &amp; mgr; l DNA-Lösung (2-5 ug / ul jedes Plasmids, abhängig von dem Konstrukt) in den lateralen Ventrikel jedes littermate mit einer Glaspipette durch die Gebärmutterwand eingeführt. In den meisten Fällen werden etwa 60-80% der gesamten Embryos injiziert. </li><li> Elektroporation die Embryonen mit einem -Elektroporator (33-35 V, 50 ms Dauer, 950 ms Intervall, 4-8 Pulse). </li><li> Rückgabe der Uterushörner in die Bauchhöhle leicht mit fürCEPS und Fingerspitzen. Nähen Sie die Muskelwand und dann die Haut mit chirurgischem Naht zu ermöglichen, die Embryonen Entwicklung fortzusetzen. </li></ol></li><li> Uaa Mikroinjektions <ol><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Bauchmittellinie wieder an E16.5 und sanft die Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und Fingerspitzen aus. </li><li> Injizieren etwa 2-5 &amp; mgr; l Cmn-Ala (500 mM) zu dem elektroporierten Seite oder beiden Seiten des lateralen Ventrikels mit einer Glaspipette durch die Gebärmutterwand eingeführt. Cmn Bioverfügbarkeit, verwenden Sie das Dipeptid Cmn-Ala (CMN-Alanin) Zur Erhöhung der Cmn 21 in vivo zu liefern. </li><li> Auch hier geben die Gebärmutterhörner in die Bauchhöhle vorsichtig mit einer Pinzette und Fingerspitzen. Nähen Sie die Muskelwand und dann die Haut mit chirurgischem Naht zu ermöglichen, die Embryonen Entwicklung fortzusetzen. </li></ol></li><li> Erhalten Akute Hirnschnitten <ol><li> Machen Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) , enthaltend 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl <sub&gt; 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26,2 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose bei pH 7,3. </li><li> Nehmen Sie 200 ml ACSF und Schnellgefrier bei -80 ° C für 20-30 min. Bubble der Rest ACSF mit 5% CO 2: 95% O &amp; sub2 ; -Gas bei Raumtemperatur. </li><li> Vorbereiten und chirurgische Werkzeuge sterilisieren Gehirne von den Embryonen zu ernten. Auch einen Eimer mit Eis vorzubereiten. </li><li> Machen Sie ~ 100 ml 4% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Lösung in einem Kolben durch Erhitzen in einer Mikrowelle. Das Abkühlen der Lösung für ca. 5 Minuten, bevor es zu erstarren beginnt. </li><li> Euthanize die Maus 12-24 Stunden nach Cmn-Ala Injektion von CO 2 Überdosierung. Machen Sie große Einschnitte in der Bauchbereich und sezieren aus die elektroporierten / mikroinjiziert Embryonen aus der Gebärmutter mit einer feinen Schere und Pinzette. </li><li> Ernte Gehirne von den Embryonen mit einer feinen Schere und Pinzette. </li><li> Legen Sie jedes Gehirn auf einer 10 cm Kulturschale auf dem Eis Eimer gelegt. Teilen Sie zwei Hemisphären eine scharfe Klinge, und legen Sie jeweilsHalbkugel auf der Schale mit der Medianebene der Boden der Schale berührt. Schnell die Agarose-Lösung über Gehirne übergießen (ca. 500 &amp; mgr; l pro Hemisphäre). </li><li> Mit einem scharfen Messer, schneiden Quadrat der Agarose um ein Gehirn ein Gehirn-embedded Agaroseblock zu machen. </li><li> Mit Gewebekleber, kleben Sie die Midsagittalebene Oberfläche des Agaroseblock an einer Halterung für Vibratom. Füllen Sie die Vibratom Kammer mit vorgekühlten ACSF und schneiden 200 um sagittalen Hirnschnitten. </li><li> Inkubieren Scheiben in acute ACSF mit 3 mM myo - Inositol ergänzt, 0,4 mM Ascorbinsäure und 2 mM Natriumpyruvat bei 33 ° C für 42 min , während sie mit 5% CO 2 sprudelnden: 95% O &amp; sub2 ; -Gas. </li><li> Nach 42 min, drehen Sie die Heizung und weiter zu brüten die Scheiben bei Raumtemperatur mit sprudelnden ab. Beginnen whole-cell Patch Aufzeichnung mindestens 15 min, nachdem die Heizung abgeschaltet wird. </li></ol></li><li> Ganze Zelle Aufnahme mit Lichtaktivierung <ol><li> Bereiten Sie die intraczellulären Lösung , enthaltend 130 mM Kaliumgluconat, 4 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na 2 ATP, 10 mM Natriumkreatinphosphat und 0,1 mM Na 3 GTP bei pH 7,3 mit KOH eingestellt. </li><li> Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glaselektroden einen kommerziellen Mikropipette Abzieher 3-6 MOhm Pipette Beständigkeit aufweisen. </li><li> Stellen Sie die Scheibe Elektro Rig für Ganzzell-Patch-Clamping und superfuse die Aufnahmekammer mit ACSF bei 2 ml / min Rate mit einer Perfusions-Pumpe. Passen Sie die Raumtemperatur auf etwa 33 ° C. Hinweis: Die Scheibe Elektro rig ist mit einer Perfusionskammer ausgestattet, einem Wasserimmersionsobjektiv und einem Temperaturregler. Auch GFP-Filter (Anregung: 480/30 nm, Emission: 535/40 nm) und mCherry Filter (Anregung: 580/20 nm-Emission: 675/130 nm) erforderlich. <ol><li> Installieren Sie eine LED mit Emission von 385 nm durch das Mikroskop auf der Bohrinsel im 45 ° von 1 cm entfernt Licht auf den Brennpunkt zu liefernWinkel. Überprüfen Sie die Leistung der LED mit einer Lichtleistungsmesser. </li></ol></li><li> Pick vorsichtig ein Gehirn Scheibe mit einer Glaspipette und in der Perfusionskammer auf. Halten Sie die Scheibe mit einer Harfe nach unten. </li><li> Patch Ein Neuron mit mCherry / GFP - Fluoreszenz aus dem Neokortex Bereich 27. Nehmen Sie PIRK Aktivität voltage clamp mit (V-Klemme) -Methode. Erstens halten das Membranpotential bei -60 mV. Dann Rekordströme an festen negativen Membranpotentialen (-100 mV) oder Spannungsrampen (-100 mV bis +40 mV). Insbesondere überwachen Kir2.1 spezifische Einwärtsströme bei -100 mV. </li><li> Manuell oder die Datenerfassungssoftware verwenden, blinken einen Impuls (einen einzigen Impuls von sec Dauer 100 ms -1) von LED - Licht auf das Neuron während der Aufnahme, und sehen , ob PIRK Proteine ​​aktiviert werden. Sobald PIRK aktiviert ist, würde Einwärtsströme bei -100 mV deutlich erhöhen. </li><li> In 0,5 mM BaCl 2 in das Bad und überprüfen , ob PIRK wieder inaktiviert wird. </li></ol></li></ol>

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	<li>Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Stimulation+of+Nerve+Cells+in+Aplysia.">Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia.</a> Science. 171 (3974), 907-908 (1971).</li><li>Callaway, E. M., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+using+caged+glutamate+reveals+functional+circuitry+in+living+brain+slices.">Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).</li><li>Cambridge, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-dependent+photoactivated+gene+expression+in+eukaryotic+systems.">Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems.</a> Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).</li><li>Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+cortical+neurons+form+fine-scale+functional+networks.">Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks.</a> Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).</li><li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior.">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+for+remote+control+of+neuronal+firing.">Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing.</a> Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).</li><li>Volgraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+control+of+an+ionotropic+glutamate+receptor+with+an+optical+switch.">Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch.</a> Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).</li><li>Szobota, S., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+neuronal+activity.">Optical control of neuronal activity.</a> Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+disulfide+connectivity+using+backbone+ester+hydrolysis.">Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis.</a> Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).</li><li>Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+caged+cysteine+and+caged+tyrosine+into+a+transmembrane+segment+of+the+nicotinic+ACh+receptor.">Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+decaging+leads+to+substantial+membrane+trafficking+during+modulation+of+an+inward+rectifier+potassium+channel.">Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel.</a> J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).</li><li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code.">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).</li><li>Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Expanding the genetic code of Escherichia coli.</a> Science. 292 (5516), 498-500 (2001).</li><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code.">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+for+cellular+and+neuronal+studies.">Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies.</a> Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).</li><li>Kang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+expression+of+a+light-activatable+potassium+channel+using+unnatural+amino+acids.">In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids.</a> Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).</li><li>Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+functional+studies+with+structures+of+inward-rectifier+K(+)+channels.">Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).</li><li>Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+synaptic+plasticity+triggered+by+selective+suppression+of+activity+in+individual+neurons.">Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons.</a> Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).</li><li>Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+genetic+suppression+of+neuronal+excitability.">Inducible genetic suppression of neuronal excitability.</a> J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+protein+phosphorylation+with+a+genetically+encoded+photocaged+amino+acid.">Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid.</a> Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).</li><li>Coin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+chemical+probes+in+cells+reveal+the+binding+path+of+urocortin-I+to+CRF+class+B+GPCR.">Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR.</a> Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).</li><li>Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterification+of+an+unnatural+amino+acid+structurally+deviating+from+canonical+amino+acids+promotes+its+uptake+and+incorporation+into+proteins+in+mammalian+cells.">Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells.</a> Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).</li><li>Parrish, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Genetic+Code+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Bacterial+Aminoacyl-tRNA+Synthetase/tRNA+Pairs.">Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs.</a> ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).</li><li>Lu, H., Klaassen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+and+thyroid+hormone+regulation+of+Pept1+and+Pept2+mRNA+in+rodents.">Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents.</a> Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Plaster, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Kir2.1+cause+the+developmental+and+episodic+electrical+phenotypes+of+Andersen's+syndrome.">Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome.</a> Cell. 105 (4), 511-519 (2001).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+short+QT+syndrome+(SQT3)+is+caused+by+a+mutation+in+the+KCNJ2+gene.">A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene.</a> Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).</li><li>Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+mapping+ion+channel+function.">Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function.</a> Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).</li><li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+photoswitchable+click+amino+acids+in+Escherichia+coli+and+mammalian+cells.">Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).</li><li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Formation+of+an+Azo+Bridge+on+Proteins+Controllable+by+Visible+Light.">In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light.</a> J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um eine effektive Photomodulations erreichen, ist der erster wichtiger Schritt, um zu entscheiden, wo das Licht ansprechende Uaa in dem Zielprotein zu integrieren. Strukturelle und funktionelle Informationen des Zielproteins ist sehr hilfreich, um die Auswahl von Kandidaten Seiten zu führen. Zugleich würde der Zweck der Lichtregulierung bestimmen, welche Seite am besten geeignet ist. Nach der Auswahl von Kandidaten - Websites, empfehlen wir die Standorte in Säugetierzelllinien wie die menschliche embryonale Nieren (HEK - Zellen) für eine einfachere Kultur und Manipulation zu testen, bevor zu primären Neuronen und in vivo fortfahren. Um eine Site für Kir2.1 Photoaktivierungs, mehrere Standorte entlang der Pore von Kir2.1 identifizieren wurden in HEK-Zellen zunächst getestet. C169 von Kir2.1 wurde optimal gefunden, weil die Kir2.1 Porengröße in dem C169 groß genug befindet, ist Cmn Seitenketten, aber klein genug, um für die CMN Seitenketten Ionendurchgang zu blockieren aufzunehmen. Wenn Cmn bei C169 in Kir2.1 aufgenommen wurde in HEK-Zellen exprimiert, ter resultierenden mutierten Kir2.1 inaktiv war, wurde aber nach kurzer pule von Licht aktiviert und bestätigt erfolgreiche PIRK Entwicklung 21. Effiziente Expression der orthogonale tRNA - Synthetase und ist kritisch hohe Uaa Einbaueffizienz in Zellen zu erhalten und in vivo. Die orthogonale Synthetase-Gen effizient II-Promotor und poly-A-Signale unter Verwendung von Polymerase häufig in Säugerzellen und Neuronen verwendet exprimiert. Zur Expression der orthogonalen tRNA, einem speziellen Typ-3 - Polymerase III - Promotor, wie der Promotor H1 hier zusammen mit einer 3&#39;-flankierenden Sequenz verwendet werden benötigt , wie zuvor beschrieben 18,20. Für in - vivo - Studien haben wir festgestellt , dass drei Kopien der tRNA - Expressionskassette Cmn Einlagerungsleistung erhöhte sich im Vergleich zu einer Kopie (5A). In einer anderen Studie , in Säugetierzellen, die Anzahl der tRNA - Expressionskassette Erhöhung erhöht auch Uaa Einlagerungsleistung 30. Therefore, schlagen wir vor, die Optimierung der Anzahl der tRNA-Expressionskassetten für verschiedene UAAs, Zellen und Zielproteine ​​bei Uaa Einbaueffizienz verbessert werden muss. Die Bioverfügbarkeit von UAAs in Zellen und in vivo ist ein weiterer entscheidender Faktor für Uaa Einbau. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Veresterung von UAAs erhöht ihre Aufnahme in Säugetierzellen 31 gezeigt, und dass die Herstellung von UAAs in dem Dipeptid Form erhöht Uaa Aufnahme in die Zellen in Caenorhabditis elegans 32. Wir fanden , dass direkt Cmn zu neuronalen Kulturmedien Einspeisen ausreichend ist für Cmn Inkorporation in Kir2.1 in kultivierten primären Neuronen exprimiert, aber nicht ausreichend für die Einarbeitung in das Gehirn der Maus in vivo 21. Daher wurde das Dipeptid Cmn-Ala synthetisiert und in das Gehirn der Maus injiziert. Oligopeptid - Transporter PEPT2 in Nagetier Gehirn 33, stark exprimiert , die den Transport des Dipeptid in Neuronen erleichtern können. Die internalisiert dipeptide würde durch zelluläre Peptidasen hydrolysiert werden, um die Uaa Cmn zur Einarbeitung zu erhalten. Tatsächlich mit dieser Optimierung erzielten wir effiziente Cmn Einbau in neuronale Proteine ​​an mehreren Regionen des embryonalen Mäusegehirn, einschließlich Neocortex, Thalamus und Hypothalamus 21. Erfolgreiche PIRK Expression in Neuronen hängt stark von der Herstellung von gesunden neuronalen Kultur. Jeder Schritt in dem Protokoll sollte in einer präzisen und sorgfältigen Art und Weise durchgeführt werden. Nach Kultur Vorbereitung, ist es am besten, die Kultur in den Inkubator ohne Störung aufrecht zu erhalten. Öffnung und der Inkubator Tür zu schließen, sowie die Kulturschale kann zu untergraben die Qualität der Kultur summieren sich in und aus dem Inkubator bewegt. Untere Inkubatortemperatur (35 ° C statt 37 ° C) hilft Exzitotoxizität reduzieren. Auf eine ähnliche Notiz, sollte Ca-P-Transfektion mit besonders vorsichtig erfolgen. Herstellung von 2x BBS-Puffer ist ein kritischer Schritt. Es ist eine gute Idee, caliBråte den optimalen pH-Wert für 2x BBS-Puffer zwischen pH 6,90-7,15, da neue DNA-Konstrukte oder Preps Transfektion Bedingungen ändern könnte. Der Puffer pH kann mit Präzision auf die Ziffern 0,01 eingestellt werden, wenn sie konsistente Ergebnisse zu erzielen hilft. Vor der Transfektion wird das Wachstumsmedium neuronaler Kultur mit frischem ersetzt. Es ist entscheidend, den ursprünglichen Wachstumsmedien zu speichern, und fügen Sie die Kultur nach der Transfektion den ursprünglichen Zustand wiederherzustellen zurück. Aufrechterhaltung neuron Kultur in frischem Medium nach der Transfektion würde stören Neuronen aus erholt, da es aus Neuronen Schlüsselmoleküle für die Zellproliferation, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren freigesetzt fehlt. Für Lichtaktivierung von PIRK in kultivierten Zellen und Gewebeschnitten, brauchen richtige Lichtquelle und Liefermethode bestimmt werden. CMN absorbiert Lang- und Mittelwelle UV-Licht (280-400 nm). Jedoch Belichtung mit UV-Licht zu ergänzen, insbesondere für kürzere Wellenlänge UV-Licht, wäre schädlich für die Zellen. Am same Zeit könnte weit rotes Licht die Probe stören die Zellen erwärmen. Daher ist eine LED mit einer einzigen Wellenlänge Emission am besten für PIRK Aktivierung. Für die CMN Photolyse, eine LED mit Emission von 385 nm (~ 40 mW; Prizmatix) ausgewählt wurde. Die LED wird von außen in der Nähe des Mikroskops montiert, und eine optische Faser verwendet wird, Licht mit dem Neuron in Fokus genau zu liefern. Für reproduzierbare Datenerfassung wird die optische Faser 1 cm entfernt in einem Winkel von 45 ° von dem Neuron im Fokus einzurichten. Lichtleistung an der Probe gemessen wurde , 40 mW / cm 2. Es ist auch die LED-Leistung empfohlen, die Verwendung eines optischen Leistungsmesser in regelmäßigen Abständen überprüfen. Wir zeigen , dass in utero Elektroporation ist eine effektive Technik , um genetisch UAAs in vivo einzubringen. In utero Elektroporation von Plasmid - DNA in die embryonale Maus Neocortex , wie beschrieben durchgeführt wird , 34 vorher, mit geringfügigen Modifikationen. Um auszudrücken PIRK Proteine ​​in neonatal Gehirn der Maus, zwei chirurgische Eingriffe erforderlich sind (5B). Der erste Schritt ist Genkonstrukte für PIRK Expression durch Elektroporation gefolgt einzuspritzen. Zwei Tage später wurde die zweite Gehirn Einspritzung durchgeführt Cmn-Ala zu liefern. Es wäre Praxis erfordern proficiently Operationen durchführen, ohne die Tiere zu viel zu belasten. Nach jeder Operation sollten die Tiere nach und während der Erholung in regelmäßigen Abständen überprüft betrachtet werden. Eine ausreichende und rechtzeitige Verfügbarkeit von Cmn im Gehirn ist für die richtige PIRK Ausdruck von wesentlicher Bedeutung. 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) wird in der Regel zu einem embryonalen Gehirn injiziert. Manchmal hilft es, Cmn-Ala im Ventrikel sowohl auf der Elektroporation und der gegenüberliegenden Halbkugel, da Cmn-Ala von der gegenüberliegenden Seite zu der Seite elektroporiert für längere Cmn Versorgung würde diffundieren zu injizieren. Unter Berücksichtigung allgemeiner Nützlichkeit von in utero Elektroporation, könnte diese Technik angewendet werden , nicht nur auf neokortikalen Neuronen , sondern auch auf Neuronenin anderen Hirnregionen wie Striatum, Dienzephalon und Cerebellum, wenn Elektroporation / Injektionsstelle für jede Region angepasst wird. Embryonale / Neugeborenen-Gehirne sind viel weicher als erwachsenen Gehirn, so wäre es schwierig, akute Scheiben Experimente für die Elektro zu bekommen. Agarose Einbettung hilft, die embryonalen Hirnstruktur für Vibratom Schneiden stabilisieren. Obwohl mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose Temperaturschock zu Hirngewebe minimiert, Vorsicht ist geboten, wenn Agarose über kalte Gehirn geschmolzen Ausgießen. Die Wirkung von Temperaturschock auf das Gewebe aus Agarose Einbettung war während der ganzen Zelle Aufzeichnungs unnoticeable. Genetisch kodierend photoresponsive UAAs in kultivierten Neuronen und in vivo, veranschaulicht durch PIRK hier wird eine optogenetische Technik leisten verschiedene neuronale Proteinaktivitäten mit Licht in ihrer natürlichen Umgebung zu steuern. Das aktuelle Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Verfahren PIRK Expression und Aktivierung Experimente i auszuführenn neuronale Kultur in vitro und in Nagetier Gehirn in vivo, die die erste erfolgreiche Entwicklung des Uaa Systems zur Verwendung in Säugetier Gehirne. Es hat das Potenzial der Forschung vieler natürlicher Proteine ​​zu profitieren, sowie deren Auswirkungen in Krankheiten. Beispielsweise α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren und N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) -Rezeptoren haben ähnliche Strukturen mit Transmembran- Kir2.1 Kanälen. Es wäre daher möglich PIRK Methodik zu diesen Liganden-gesteuerte Ionenkanäle anzuwenden. Außerdem könnte PIRK Technik auch 35,36 die Pathophysiologie der Kir2.1 verwandten genetischen Krankheiten, wie Andersen-Syndrom und Herz kurze QT Syndrom ansprechen verwendet werden. Zusätzlich zu &quot;Block-and-release&quot; Cys über CMN mehrere Aminosäuren wie Tyrosin, Serin, Lysin, Glutamat, Aspartat und Glycin wurden mit verschiedenen Gruppen durch Licht 37 in Käfigen gehalten worden. Somit können ähnliche Strategien nützend auf photo regulieren diese Aminosäuren in Neuronen in vitro und in vivo. Darüber hinaus können reversible optische Kontrolle mit azobenzolhaltigen UAAs erreicht werden, und solche UAAs jetzt genetisch in E. codiert wurden , coli und Säugerzellen 38,39. Zusammenfassend stellt dieses Protokoll eine allgemeine Methode, um die Aktivität neuronaler Proteine ​​in ihrer nativen Einstellungen mit Licht zu steuern. Im Vergleich zu anderen optogenetische Methoden, bei denen Opsin-Familie und andere lichtempfindliche Proteine ​​oder Domänen verwendet dieses Verfahren genetisch lichtempfindlichen UAAs und Änderungen codiert nur einen einzigen Rest. Daher sollte es minimale Interferenz mit der Funktion, den Handel und die Lokalisation des Zielproteins untersucht haben. Hohe Website-Selektivität kann auch mit diesen genetisch kodierten lichtreaktions UAAs erreicht werden, um mehr zu schaffen Flexibilität und Spezifität für die detaillierte molekulare Untersuchung. Dieses Protokoll liefert auch die erste comprehensive, einfach zu befolgende Verfahren , wie man erfolgreich UAAs in Proteine ​​in Neuronen in vitro und in vivo einzubringen. Optische Kontrolle der allgemeinen Proteine ​​über genetisch kodierte UAAs in Neuronen in vitro und in vivo hat ein großes Potenzial sowohl grundlegende und translationale Wissenschaft zu profitieren, und das Protokoll würde helfen , seine Anwendung zu fördern.

Im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation bietet Photo größere zeitliche und räumliche Auflösung bei minimaler Störung des physiologischen Systems von Proben. Seit der Demonstration Laser mit Neuronen im Jahr 1971 1, viele kreative Möglichkeiten zu stimulieren erfunden worden exogen mit Licht neuronale Aktivität zu kontrollieren. Optische Freisetzung von photoaktivierbaren Agonisten ist seit langem verwendet worden , um Liganden 2,3,4 physiologische Antwort des neuronalen Netzes zu untersuchen. Diese Technik hat Spezifität begrenzt durch Diffusion von caged-Agonisten. Genetische Spezifität wird durch ektopisch exprimieren , lichtempfindliche Opsin Kanäle erreicht und Pumpen 5,6,7, und es wurde erfolgreich zu modulieren ausgewählte neuronale Netzwerke in verschiedenen Modellorganismen eingesetzt. Allerdings würde es schwierig sein, diese Methode anzuwenden, optisch auf verschiedene andere neuronale Proteine ​​steuern, da Photoreaktivität von den Opsin Proteinen an andere Proteine ​​Pfropfung would intensiv Engineering erfordern, die die natürlichen Eigenschaften des Proteins untersuchten verändern können. Chemisch Anbindehaltung ein exogener lichtempfindlichen Ligand an ein Protein einen anderen Weg , um die Funktionalität von Kanalproteinen 8,9,10 zu steuern unter Beweis gestellt hat. Der Ligand wird präsentiert oder von der Bindungsstelle des Proteins durch die Photoisomerisierung des Azobenzoleinheit zurückgezogen. Anbinden Chemie beschränkt die Anwendung vor allem auf der extrazellulären Seite der Membranproteine, mit Ausnahme der intrazellulären Seite und intrazellulären Proteinen. Lichtempfindliche UAAs, nachdem sie in Proteine ​​eingebaut werden, eine allgemeine Strategie Proteine ​​mit Licht zu manipulieren. In frühen Bemühungen, tRNAs chemisch acyliert mit photoaktivierbaren UAAs in Xenopus - Oozyten mikroinjiziert wurden 11, die UAAs in Membranrezeptoren und Ionenkanäle zu integrieren , die das Verständnis ihrer Struktur-Funktionsbeziehungen 12,13,14 vorangebracht haben.Diese Mikroinjektions Ansatz ist vor allem auf große Eizellen begrenzt. Genetische Einbau eines Uaa umgeht die technisch anspruchsvolle tRNA Acylierung und die Mikroinjektion durch eine orthogonale tRNA / Synthetase - Paar verwenden, die die Uaa durch endogene Proteintranslation in lebenden Zellen 15,16,17,18 enthält. Uaa Einbau in neuronale Proteine ​​wurde in primären Neuronen und neuronalen Stammzellen 19,20 demonstriert. In jüngerer Zeit wurde auf Licht ansprechende Uaa genetisch in ein neuronales Protein im Gehirn von Säugetieren in vivo zum ersten Mal 21 eingebaut. Diese Fortschritte ermöglichen es, neuronale Proteine ​​mit UAAs in ihrer nativen zellulären Umgebung zu studieren. Einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal Kir2.1 ist ein starker Gleichrichter, der K + -Ströme mehr geht leicht in als aus der Zelle, und es ist wichtig bei der Regulierung der physiologischen Prozessen einschließlich Zell Erregbarkeit, Gefäßtonus, Herzfrequenz, renal Salzfluss und Insulinfreisetzung 22. Überexpression von Kir2.1 hyperpolarisiert die Membranpotential des Zielneurons, das weniger erregbar 23,24 wird. Optisch Kir2.1 in seiner nativen Zellen kontrollieren, Kang et al. Genetisch a photo-responsive Uaa in Kir2.1 inkorporiert in Säugerzellen exprimiert, Neuronen und embryonalen Maushirnen 21. Ein kurzer Lichtimpuls konnte die Uaa in einer natürlichen Aminosäure Cys, wodurch die Ziel Kir2.1-Protein aktivierenden zu konvertieren. Wenn diese fotoinduzierbaren einwärtsgleichrichtenden Kalium (PIRK) Kanalprotein in Ratten-Hippocampus primäre Neuronen exprimiert wurde, unterdrückt es neuronale Aktivität in Reaktion auf Lichtaktivierung. Außerdem wurde gemessen, die PIRK Kanal wurde in der embryonalen Maus Neocortex und das lichtaktivierte PIRK Strom in kortikalen Neuronen exprimiert. Die erfolgreiche Umsetzung der Uaa Technologie in vivo im Gehirn von Säugetieren öffnet die Tür zu optisch neuronale Proteine ​​steuernin ihrer natürlichen Umgebung, die optische Präparation neuronaler Prozesse und Mechanismen auf molekularer Ebene ermöglichen. In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur genetischen Einbau von UAAs in primäre Neuronen in der Kultur und in der embryonalen Gehirn der Maus in vivo. Die photoresponsive Uaa Cmn und Kir2.1 werden verwendet, um den Prozess zu veranschaulichen. Methoden erfolgreich Uaa Einbau und optische Kontrolle der neuronalen Proteinaktivität sind vorgesehen, um beurteilen zu können. Dieses Protokoll stellt eine klare Anleitung zur genetisch kodierend UAAs in Neuronen und in vivo und in optisch neuronale Proteinfunktion über eine auf Licht ansprechende Uaa regulieren. Wir erwarten , dass dieses Protokoll , um die Annahme der in vivo Uaa Technologie für Neurowissenschaften und optogenetische biologische Untersuchungen zu erleichtern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm</td>
			<td style="width:455px;">Carolina Biologicals</td>
			<td style="width:301px;">633029</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:455px;">Corning Discovery Labware</td>
			<td style="width:301px;">354210</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">G8769</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Iris Spatula-curved</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10092-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Dissecting Knife - Fine Angled Tip</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10056-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td style="width:455px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:301px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">MITO+ Serum Extender</td>
			<td style="width:455px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:301px;">355006</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:455px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:301px;">352340</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:301px;">BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">B6420</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">LED LIGHT SOURCE &#8211; Black LED 385</td>
			<td style="width:455px;">Prizmatix Ltd.</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td style="width:455px;">Promega</td>
			<td style="width:301px;">V2111</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical control of a neuronal protein using a genetically encoded unnatural amino acid in neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Um genetisch eine Uaa in ein Protein in den Nervenzellen übernehmen, ist der erste wichtige Schritt ist, entsprechende Gen zu entwerfen die Gene zu liefern und zu exprimieren effizient in Neuronen. Es gibt drei genetische Komponenten für Uaa Einarbeitung: (1) das Ziel-Gen mit dem TAG amber Stop-Codon an der gewählten Stelle eingeführt für Uaa Einbau (2) eine orthogonale tRNA, die das mutierte TAG Stopcodon, und (3) eine orthogonale Aminoacyl zu erkennen -tRNA Synthetase die Uaa auf die orthogonale tRNA aufzuladen. Jede Komponente benötigt, die in geeigneten Promotor angetrieben werden. Diese drei Genkassetten kann in einem Plasmid oder getrennt in mehreren Plasmiden enthalten sein. Unter Verwendung der orthogonalen tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA - Synthetase) Paar für die CMN 21,29 spezifisch zu sein entwickelte sich zu äußern PIRK in Neuronen, die photoreaktiven Uaa CMN in Kir2.1 eingebaut. Der Rest Cys169 von Kir2.1-Gen wird auf das TAG-Amber-Stopp-Codon (Kir2 mutiert.1-TAG) und das fluoreszierende Protein mCitrine an den C-Terminus von Kir2.1 fusioniert ist PIRK Expression in neuronalen Kultur (1) zu visualisieren. gute Qualität neuronale Kultur zu erhalten ist eine Voraussetzung für eine erfolgreiche PIRK Experimente. Postnatalen Tag 1-4 Sprague Dawley Ratten-Jungen sind für neuronale Kultur Vorbereitung im Allgemeinen verwendet, noch Rattenembryonen werden ebenfalls häufig verwendet. Wenn auf Deckgläser plattiert in 24-Well - Platten bei 1,0 bis 1,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung Dichte, sollte man mit nicht zu viel Mikroglia oder andere Verunreinigungen (2A) gut getrennten gesunden Neuronen zu sehen. Gesunde Neuronen haben umfangreiche Prozesse und Zellkörper (Soma) sind plump (2B). Unverwechselbar sichtbar suborganelle Struktur ist in der Regel ein Zeichen für ungesunde Kultur. 95% Luft befeuchteten Inkubator: Neuronal Kultur kann für 2-3 Wochen bei 35 ° C in 5% CO 2 gehalten werden. Calcium Phosphat (Ca-P) Transfektion ist eine sehr sanfte Transfektionsverfahren geeignet für empfindliche neuronale Kultur. Es erfordert jedoch extreme Präzision und Vorsicht hohe Transfektionseffizienz in Neuronen zu erzielen. Vorratslösungen müssen bei 4 ° C gelagert werden, und gemischt, um 2x BBS-Puffer am Tag der Transfektion zu machen. Präzise pH-Einstellung ist der Schlüssel zu reproduzierbar erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Die 2,5 M CaCl 2 -Lösung sollte auch frisch am Tag der Transfektion durchgeführt werden. Alle Puffer müssen gefiltert werden. Darüber hinaus frische DNA-Plasmide mit hoher Reinheit und Qualität zu verbessern, die Ergebnisse. Die besten Ergebnisse erzielen, kann man frische DNA Mini-prepped erhalten von nicht bewachsen Escherichia coli - Kultur (~ 12 Stunden bei 37 ° C im Schüttelinkubator). Nachdem alle Puffer bereit sind, bringen die Lösungen in der Kultur Haube Gewebe und für die Transfektion vorzubereiten. Unter Verwendung eines Vortex bei einer niedrigen Geschwindigkeit, agitieren die Transfektionseffizienz Lösung unter Mischen. Sofort im die gemischte Lösung auf die neuronale culture, und bringen die Kulturschale zurück in den Inkubator. Stoppen Sie die Transfektion nach 45 min-1 h, und fügen Sie für die kontinuierliche Inkubation zur Kultur zurück, um den ursprünglichen Wachstumsmedien. Die transfizierten Neuronen von 6 Stunden nach der Transfektion sichtbar gemacht werden , beendet wird (Abbildung 3). In Gegenwart von Cmn in den Kulturmedien wird PIRK exprimiert und PIRK-exprimierenden Neuronen sind grün-fluoreszierendes aufgrund der mCitrine Protein fusioniert an den C-Terminus von PIRK (Abbildung 3D). PIRK-exprimierenden Neuronen haben normale basal Physiologie und sie sind in der Lage Abfeuern Aktionspotentialen als Reaktion auf injizierte Ströme (Abbildung 4). Jedoch ist diese Reihe von Aktionspotentialen sofort mit einem kurzen Lichtimpuls an die Zelle (4A) leuchtete unterdrückt. Wenn 0,5 mM BaCl 2, ein Kir2.1 spezifischer Inhibitor, dem Bad zugesetzt wird, wird die neuronale Feuern wieder aufgenommen , dann, was darauf hinweist , dass die vorherige Unterdrückung durch die l auf die Aktivierung des Kir2.1 zurückzuführenight (4B). Untransfizierten Kontroll Neuronen reagieren nicht auf das Licht oder Ba 2+ (4C, D). Um PIRK in vivo, hochreinen und konzentrierte DNA - Plasmide (2-5 ug / ul) exprimieren sollten darauf vorbereitet sein. Spezifische Plasmide in diesen Experimenten verwendet werden , in 5A gezeigt. Zusätzlich zu der orthogonalen tRNA Leu CUA / CmnRS Paar und dem Ziel Kir2.1-TAG - Gen, ein Gen kodierend grün fluoreszierendes Protein mit einer Mutation TAG (GFP-TAG) ist auch co-elektroporiert als fluoreszierender Reporter. Der Nachweis von GFP - Fluoreszenz würde die erfolgreiche Lieferung aller drei Plasmide zeigen, da TAG Unterdrückung in GFP würde die tRNA Leu CUA beide erfordern und die CmnRS; CMN Einbau in GFP-TAG würde Cmn Einbau in Kir2.1-Tagas vorschlagen gut, da beide Gene in der gleichen Zelle sind. Die drei Genkonstrukte sind alle injected in den lateralen Ventrikel von Mausembryonen auf E14.5 (5B, links). Nach der Elektroporation, kehren die Embryonen in die Bauchhöhle die Embryonen zu ermöglichen Entwicklung fortzusetzen. Zwei Tage später injizieren etwa 2-5 &amp; mgr; l Cmn-Ala (500 mM) zu dem elektroporierten Seite oder auf beiden Seiten der lateralen Ventrikel, in gleicher Weise wie DNA - Injektion (5B, mittleres Feld). Auch hier geben die Embryonen in die Bauchhöhle für eine kontinuierliche Entwicklung. Die Embryonen können sich auf E17.5 für die Bildgebung oder elektro Assays geerntet werden. Wie erwartet, nur mit Cmn-Ala-Injektion werden grün fluoreszierende Zellen in der Maus Neocortex beobachtet. Die Zellen mit den beiden roten und grünen Fluoreszenz hätte Cmn in Kir2.1-TAG eingebaut PIRK Kanäle (6A) zu machen. Whole-cell recording aus dem embryonalen neokortikalen Scheibe wird in ähnlicher Weise durchgeführt, wie es auf die neuronale Kultur durchgeführt wird. Die grünen und roten Fluoreszenz-Neuronen haben keine nach innen gerichteten Strom an negative Haltepotential, aber ein kurzer Lichtimpuls aktiviert schnell die nach innen gerichteten Strom (6B). Der Strom wird durch Zugabe von Ba 2+ vollständig blockiert, was bestätigt , dass es durch PIRK erzeugt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig1.jpg" /> Abbildung 1: PIRK Expressionsplasmid Satz für Neuron Kultur Scheme exemplarischen Plasmid - Design für PIRK Expression in neuronalen Kultur zeigt.. Top-Plasmid kodiert für Kir2.1-Gen (grau) mit einer einzigen Aminosäure-Mutation in C169-Website unter Cytomegalovirus (CMV) Promotor. C169 ist mit dem TAG-Amber-Stopcodon mutiert, wobei die Uaa Cmn eingebaut werden würde. Kir2.1-Gen wird durch mCitrine Gen (grün) gefolgt. mCitrine ist mit dem C-Terminus des Kir2.1-Gens fusioniert PIRK exprimierenden Zellen sichtbar zu machen. Bottom-Plasmid kodiert CmnRS (pink), CMN spezifische Synthetase, angetrieben durch die Maus Phosphoglyceratkinase-1 (mPGK) Promotor. tRNA <sup<html> &gt; Leu CUA (blau), die orthogonale tRNA 21, wird auch durch die H1 - Promotor angetrieben in dem gleichen Plasmid exprimiert, jedoch in einer umgekehrten Richtung. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig2.jpg" /> Abbildung 2: Ratten - Hippocampus primären neuronalen Kultur Exemplarische Bilder gesunden Ratten - Hippocampus neuronale Kulturen.. (A) A DIC Bild neuronaler Kultur von 10 Tagen in vitro (DIV). Neurone reifen, wie sie Dendriten und Axone verzweigen. Mikroglia-Zellen (kleine und runde Zellen ohne Prozesse) koexistieren, aber nicht überwältigen die Kultur. (B) Eine vergrößerte DIC Bild von gesunden kultivierten Neuronen. Eine gesunde Neuron zeigt plump Zellkörper (Soma) und ausgeprägte Dendriten / Axone. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53818/53818fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53818/53818fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig3.jpg" /> Fig . 3: PIRK Expression in kultivierten primären Neuronen DIC und Fluoreszenzbilder von Ratten - Hippokampus - Neuronen in vitro kultiviert und transfiziert mit Genkonstrukte in Figur 1 für PIRK Ausdruck dargestellt. Wenn Cmn nicht in der Kultur nach der Transfektion (A und B) hinzugefügt wird , wird keine grüne Fluoreszenz von den Neuronen nachgewiesen. In voller Länge PIRK-mCitrine Proteine ​​in Gegenwart von Cmn (1 mM) im Wachstumsmedium, transfizierten Neuronen sind in der Lage zum Ausdruck zu bringen, so dass grüne Fluoreszenz (C und D) zeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53818/53818fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53818/53818fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> .jpg &quot;/&gt; Abb . 4: Die Lichtaktivierung von PIRK unterdrückt von Ratten - Hippocampus - Neuronen feuern (A) Ein einzelner Lichtimpuls unterdrückt Aktivität des Hippocampus exprimiert PIRK. Repräsentative Spannungs Spuren werden kontinuierlich in Strom-Clamp aufgezeichnet. Aktionspotential das Brennen von 20 pA Stromeinspeisung (I-Schritt) hervorgerufen. Belichtung (385 nm, 40 mW / cm 2, 1 sec; mit Pfeil angedeutet) , schnell und vollständig unterdrückt neuronale Feuern. Gebrannt wird mit extrazellulären 500 mM BaCl 2, wieder hergestellt , die Kir2.1 Kanäle selektiv hemmt. (B) Ultraviolett (UV) Beleuchtung (385 nm, 40 mW / cm 2, 6 sec; mit gelben Feld angezeigt wird ) , ändert nichts an Erregbarkeit der Kontrolle, nicht transfizierten Neuronen. Aktionspotential das Brennen von 50 pA Stromeinspeisung (I-Schritt) hervorgerufen. (C und D) Weder UV - Beleuchtung oder BaCl 2 (500 mM) wirkt Erregbarkeit Steuer Neuronen. Aktion potential wird von 50 pA Stromeinspeisung (I-Schritt) hervorgerufen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig5.jpg" /> Abbildung 5: Verfahren zur PIRK Expression in der Maus Neokortex in vivo. (A) PIRK Expressionsplasmid gesetzt. Top Plasmid: das Plasmid für CmnRS durch den CAG-Promotor und mCherry über interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) angetrieben. mCherry Fluoreszenz würde die erfolgreiche Expression von CmnRS überprüfen. Mittel Plasmid: das Plasmid für Kir2.1 - Gen gekoppelt mit drei Kopien von tRNA Leu CUA, die orthogonale tRNA für die CMN Einbau 21. Bottom - Plasmid: das Plasmid für GFP_Y182 TAG. Das Gen für GFP mit einem Amber - Stopcodon bei der permissiven Tyr182 Website (GFP_Y182 TAG) entwickelt , um erfolgreiche Integration von Cmn visualisieren Websites TAG 21. (B) Cartoon shoFlügel ein experimentelles Verfahren für PIRK Expression in vivo. Genkonstrukte für PIRK Ausdruck in die Maus Neokortex (E14.5) injiziert und durch Elektroporation in utero (linkes Bild). Zwei Tage später wird Cmn-Ala an den Ventrikel in der elektroporierten Seite oder auf beiden Seiten der zerebralen Hemisphären (Mitte) injiziert. Slice-Bildgebung und elektro Test kann auf E17.5-E18.5 (rechts) durchgeführt werden. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig6.jpg" /> Abbildung 6: PIRK Expression in der Maus Neokortex und Lichtaktivierung. (A) Fluoreszenzbilder von embryonalen Maus - kortikalen Neuronen den Einbau von Cmn in GFP und Kir2.1 Proteine ​​in vivo zeigt. Die drei Genkonstrukte in 5A sind in utero elektroporiert. mCherry Fluoreszenz zeigt die erfolgreiche Expression von CMN spezifischen synthetase Gen, CmnRS. GFP - Fluoreszenz ist nur mit Cmn-Ala - Injektion (unten), was anzeigt , Cmn Inkorporation in GFP TAG und wahrscheinlich Cmn Inkorporation in Kir2.1 TAG detektiert. So, grüne und rote Fluoreszenz zeigt die erfolgreiche Expression aller drei Plasmide und der CMN Einbau. (B) IV Plot von Strömen von Mäusen neokortikalen Neuronen zeigt lichtabhängige Aktivierung von PIRK aufgezeichnet. Zwei Tage nach der Genkonstrukte in 5A wurden elektroporiert, Cmn-Ala wurde in utero injiziert; 12-48 Stunden nach Cmn-Ala-Injektion, neokortikalen akuten Scheiben wurden aus den Embryonen hergestellt. PIRK-exprimierenden Neuronen in den Scheiben, sowohl rote und grüne Fluoreszenz detektiert werden vor (schwarz) aufgezeichnet und nach (blau) Belichtung (385 nm, 8 mW / cm 2, 10 sec für gesättigte Exposition). BaCl 2 (500 mM) wird zu PIRK spezifische Ströme nach Photoaktivierung (orange) zu überprüfen.

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Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

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Research

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Neuroscience

7.9K Aufrufe.  Tufts University. Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Serie: Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...