Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH / NINDS) Zuschuss 1R01NS086981 und der Conrad N. Hilton Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Laurent Bentolila und Dr. Matthew Schibler für ihre unschätzbare Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken, die an der CLARITY-Forum beigetragen haben (http://forum.claritytechniques.org). Wir danken vor allem Dr. Karl Deisseroth für eröffnet sein Labor diese faszinierende Technik zu lehren. Die Autoren sind dankbar für die großzügige Unterstützung von der Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace-Stiftung, Ahmanson Stiftung, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. und Linda R. Dietel Philanthropische Fund, und Northstar Fund . Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde, auch teilweise von der National Center for Research Resources und vom Amt des Direktors der Nation unterstütztal Institutes of Health unter preis Zahlen C06RR012169, C06RR015431 und S10OD011939. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt. THY1-YFP, PLP-EGFP und PV-tdTomato Mäuse wurden für diese Experimente verwendet, aber alle Mäuse fluoreszierende Proteine ​​exprimieren erfolgreich gelöscht werden kann und abgebildet. 1. Gewebepräparation Achtung: Paraformaldehyd (PFA) und Acrylamid sind giftig und Reizstoffe. Führen Sie Experimente diese Reagenzien in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille). <ol><li> Sacrifice das Tier in Euthanasie Kammer mit ~ 1 ml Isofluran, bis die Atmung aufhört (~ 2 - 3 min). </li><li> Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe auf ~ 5 ml / min bis intrakardial perfuse die Maus mit Perfusionslösung (Tabelle 1) bei 4 ° C , bis das Blut aus den Geweben gelöscht (5 - 10 min). </li><li> Ändern Sie den Perfusat zu Fixierungslösung (Tabelle 1)bei 4 ° C bis zur Ausschöpfung der Hals und Schwanz deutlich versteift (5 - 10 min). </li><li> Beenden Sie die Perfusion und köpfen das Tier. Sezieren vorsichtig heraus das Gehirn aus dem Schädel , indem zuerst das Bindegewebe Entfernen des Schädels umgibt und dann Knochen von der ventralen Oberfläche des Schädels zu entfernen und das Gehirn heraus (Abbildung 1a) anheben, wie in 20 beschrieben. Hinweis: Geben Sie die Entfernung von Knochen besondere Sorgfalt flocculonodularis Lappen des Kleinhirns umgibt und die Riechkolben. <ol><li> Präparieren Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule durch sanft mit der Spitze eines feinen, scharfen Schere zwischen dem Rückenmark und der Wirbelsäule einsetzen und die einzelnen Wirbelsäulensegmenten weg schneiden, wie in 21 beschrieben. </li></ol></li><li> Hemisect das Gehirn, indem es in einer Kunststoffmatrix Mausgehirn Plazieren und mit einer Matrix Klinge entlang der Mittellinie schneiden. </li><li> Fügen Sie jede Hemisphäre und Rückenmark zu trennen 50 ml Zentrifugen Wannees mit ~ 40 ml Hydrogel - Lösung (Tabelle 1). Von diesem Punkt an Abdeckung die Rohre mit einer Aluminiumfolie, die Fluorophore bei allen nachfolgenden Schritten zu schützen. </li><li> Inkubiere das Rohr die Probe in Hydrogel bei 4 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm) für 7 Tage enthält. </li></ol> 2. Polymerisation <ol><li> Verwerfen ~ 25 ml Hydrogel, Konservieren der Probe und ~ 25 ml Hydrogel in dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Desoxygenieren die Probe durch Entfernen der Kappe und das Zentrifugenröhrchen in Exsikkator Glas platzieren und das Glas auf ein Vakuum zu verbinden. Gelten das Vakuum für mindestens 10 min gelösten Gasen zu ermöglichen, aus der Lösung und Blasen bilden zu kommen. Schütteln Sie die Luftblasen zu entfernen. </li><li> Ersetzen Sie das Vakuum im Exsikkator Glas mit 100% Stickstoffgas über 2 - 3 min. Sobald der Druck ausgleicht (einmal die Spitze des Exsikkator Glas geöffnet werden kann), die Kappe schnell das Rohr die Wiedereinführung von Sauerstoff zu verhindern. </li><li> Polymerize das Hydrogel durch das Rohr mit Probenabgabe in einem 37 ° C Wasserbad für 3 Stunden, bis die Polymerisation abgeschlossen ist. Polymerisierte Hydrogel nimmt auf einer gelartigen Konsistenz (Abbildung 1b). Hinweis: Eine geringe Menge an nicht-polymerisierten Hydrogels am oberen akzeptabel ist. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel, um den polymerisierten Probe aus dem Zentrifugenröhrchen zu entfernen, dann schneiden Sie das überschüssige Hydrogel aus der Probe entfernt. </li><li> Entfernen Sie die verbleibenden Hydrogel, das durch die Probe auf einem fusselfreien platzieren frei wischen und sanftes Reiben und Rollen des Gewebes auf sie, nur hinter einer dünnen Schicht aus polymerisiertem Hydrogel auf die Probe zu verlassen. </li></ol> 3. Lipidentfernung Hinweis: Lipid-frei Gewebe zerbrechlich ist, mit Vorsicht handhaben. Verwenden Sie eine Zelle Sieb, wenn das Rohr Ablassen verlieren Probe zu vermeiden. Außerdem quellen die Probe während des gesamten Löschvorgang jedoch Quellung während der Brechungsindex-Anpassungsprozeß umgekehrt werden. Achtung: Sodium Dodecylsulfat (SDS) und Borsäure sind reizend. Führen Sie Experimente, um diese in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Schutzbrille) verwendet wird. <ol><li> Übertragen polymerisierten Probe in ein sauberes 50 - ml - Zentrifugenröhrchen eingewogen und 45 ml Clearing - Puffer (Tabelle 1). Inkubieren bei 45 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm). Ändern Sie den Puffer täglich für zunächst 7 Tage um die verbrauchte Clearing-Puffer in chemische Abfälle Abgießen und Zugabe von ~ 45 ml frischem Clearing-Puffer. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen. </li><li> Nach den ersten 7 Tagen Inkubation der Probe bei 40 ° C und Austausch Clearing Puffer alle 2 - 3 Tage. Weiter Lichtung , bis alle Lipide löslich gemacht sind und Gewebe erreicht Transparenz (Abbildung 1c). Dies wird 4 - 6 Wochen für eine Maus Gehirnhemisphäre und 2 - 4 Wochen für eine Rückenmark. </li><li> Sobald Gewebe gelöscht ist, übertragenProbe auf eine neue 50 ml - Zentrifugenröhrchen und wasche 4 Mal in PBST (Tabelle 1) bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 min) über 24 h Rest SDS zu entfernen. </li></ol> 4. Molekulare Färbung Achtung: 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) ist ein Reizmittel und alle Experimente unter Verwendung sollte es in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden. <ol><li> Übertragen Sie die Probe in einen sauberen 15 ml Zentrifugenröhrchen geben und mit 1 ug / ml DAPI in 1x PBST, pH-Wert 7,5. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 24 Std. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen. </li><li> 3 x waschen in PBST bei RT für mindestens 6 h / Wäsche. </li></ol> 5. Anpassung des Brechungsindex Achtung: 2,2&#39;-Thiodiethanols (TDE) ist ein Reizmittel und alle Experimente verwendet es shOuld in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden. <ol><li> Übertragen, um die Probe in einen sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen geben und mit 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Inkubieren bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 Upm) für 24 Std. </li><li> Austausch von 30% TDE mit 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. bei 40 ° C inkubieren unter leichtem Schütteln 24 Stunden. Hinweis: Die Probe wird schrumpfen zurück auf etwa Originalgröße. </li><li> Auf einem flachen, saubere Oberfläche ein Stück wiederverwendbarer Klebstoff in einen Zylinder mit einheitlichem Durchmesser rollen nur geringfügig größer als die Dicke der Probe. </li><li> Legen Sie den wieder verwendbaren Klebstoffzylinder in einem offenen Kreis (~ 25 mm Innendurchmesser mit einer kleinen Öffnung an der Spitze) auf einem 40 mm Glasbodenschale. Wenn Korrekturen vorgenommen werden müssen, entfernen Sie den Zylinder aus dem Glas und schnitt mit einer Rasierklinge. </li><li> Verwenden Sie Spitze eine p1000 Pipette eine Dichtung zwischen dem wieder verwendbaren Klebstoff und Glas zu schaffen, indemes um den äußeren Rand des Zylinders rollen. </li><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l 63% TDE auf die Glasschale und verteilen um die Glasoberfläche innerhalb des Kreises von wieder verwendbaren Klebstoff zu bedecken. </li><li> Mit einem Spatel, legen Sie sorgfältig die Probe in der Mitte des Kreises, kümmert sich nicht um Blasen zu bilden. </li><li> Pipettieren weitere 100 &amp; mgr; l von 63% TDE direkt auf die Probe, dann sofort legen Sie eine 40 mm Kreisdeckglas über den wieder verwendbaren Klebstoff. </li><li> Mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger beider Hände, drücken Sie vorsichtig um den Umfang des Kreises, bis das Deckglas Kontakt mit der Probe gemacht hat. </li><li> Langsam bringen die Glasbodenschale in eine aufrechte Position gegen eine Fläche ruht, dann fügen Sie 63% TDE mit einer Pipette, bis die Lösung die kleine Öffnung am oberen Ende erreicht. Mit einem fusselfreien wischen Sie die Pipettenspitze zu trocknen, so dass die Lösung nicht auf das Glas tropft. Zur Vermeidung von Blasen in der Kammer, leeren Sie nie die Pipette den ganzen Weg. </li><li> Nachdie kleine Öffnung, fügen Silikonelastomer den Kreis und schaffen eine geschlossene Kammer zu umschließen. Warten Sie 5 Minuten für sie vor der Abbildung, um zu trocknen. </li></ol> 6. Mikroskopie Achtung: Die Laser in der konfokalen, Ebene Beleuchtung und Lichtbogen-Mikroskopie verwendet werden, sind sehr leistungsfähig und kann zur Erblindung führen. Alle Experimente Laser verwendet wird, sollten nach einer umfangreichen Ausbildung und mit großer Vorsicht und entsprechenden Augenschutz durchgeführt werden. <ol><li> Setzen Sie die Druckkammer mit der Probe im Inneren auf der Bühne eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. </li><li> Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien). So schalten Sie die Argon Anregungslaser, klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration an der Spitze des Programms dann den Laser-Symbol. Markieren Sie das Kästchen neben Argon, den Laser einzuschalten und die Folie Skala bis 30% bewegen. Beachten Sie die Zeiger langsam erwärmen zu der gewählten Position. <ol><li> Zurück zur acquire Reiter an der Spitze. In dem großen Feld &quot;Beam Path Settings &amp;# 34; gehen Sie zum Laden / Speichern-Box Einstellung und das Dropdown-Menü wählen Sie einen entsprechenden Wellenlängenkanal Bild YFP (527 nm) zu wählen. </li></ol></li><li> Wählen Sie die entsprechende Ziele für die Bildgebung durch den roten Hyperlink Auffinden der Aufschrift &quot;Ziel: aktuelle Objekt&quot; unter dem Kanaleinstellungen Feld. Ein Klick auf die Registerkarte öffnet alle verfügbaren Ziele und eine Auswahl automatisch den Turm drehen. <ol><li> Verwendung Ziele (z. B. 10X) mit einem großen Arbeitsabstand (größer als die Dicke des Gewebes abgebildet, beispielsweise 11 mm ist) und eine große numerische Apertur (z. B. 0,3) in der Ebene der Bildauflösung zu maximieren und zu minimieren optische Schnittdicke. </li></ol></li><li> Auf der linken Spalte der Dropdown-Menüs, öffnen Sie die &quot;XY: Auflösung&quot; Fenster Erfassungsmatrix zu setzen, die so genannte &quot;Format&quot;, auf 1.024 x 1.024 oder ein angemessener Wert für die laterale Auflösungsgrenze des Objektivs. Stellen Sie den Zoomfaktor so gering wie möglich (z. B. 10,7). </li><li> Im gleichen Fenster stellen 8 Linie Durchschnitt und 1 Frame durchschnittliche Parameter durch Eintropfen entsprechend die individuell beschriftet Menüs nach unten. Verwenden, um große Werte für ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis und kleine Werte für eine schnelle Akquisition. Hinweis: 8-Zeilen-Mittelwerte und 1 Frame Durchschnitt erwirbt qualitativ hochwertige Bilder einer Maus Gehirnhälfte in etwa 4 Stunden. </li><li> Suchen Sie die Probe mit Hilfe der Bühne steuert. Sobald eine repräsentative Feld sichtbar ist, stellen Sie die Verstärkung und Offset. Hinweis: Die Verstärkung und Offset werden im Wesentlichen basierend auf dem Gewebetyp variieren, Fluorophore und / oder anatomischen Merkmal abgebildet wird. Für YFP, stellen Werte von 760 bis 780 für die Verstärkung und von -1,0 bis -1,5 für den Offset. </li><li> Wählen Sie &quot;Kachel-Scan&quot; und wählen Sie die Grenzen der Region von Interesse. Den oberen und unteren Grenzen des z-Stapel zu erwerb. Stellen Sie die Dicke des optischen Abschnitt auf der Basis der optischen Schnittauflösungsgrenze des Ziels. Hinweis: Ein Ziel deroptische Abschnitt Auflösungsgrenze wird in erster Linie durch seine numerische Apertur definiert. Die meisten Mikroskop Steuerungssoftware wird automatisch ein angemessener Wert für die objektive Berechnung verwendet wird. Für einen 10X-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,3 das wäre etwa 11 um betragen. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Hinweis: Dies kann mehrere Stunden dauern. </li><li> Sammeln Sie Bilder mit höherer Auflösung höherer Vergrößerung Ziele aus bestimmten Regionen von Interesse verwendet wird. </li></ol>

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	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+histology+in+the+pursuit+of+connectomes.">Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.</a> J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).</li><li>MacKenzie-Graham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimodal,+multidimensional+atlas+of+the+C57BL/6J+mouse+brain.">A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain.</a> J Anat. 204, 93-102 (2004).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy.">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Theer, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+fundamental+imaging-depth+limit+in+two-photon+microscopy.">On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy.">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> Neuroimage. 101, 625-632 (2014).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Sci Rep. 5, 9808 (2015).</li><li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li><li>Parra, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+brain+expressing+YFP.">Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP.</a> J Vis Exp. (67), e3848 (2012).</li><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> J Viz Exp. (96), e52580 (2015).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Passive Clearing von Hydrogel eingebettet Gewebe (passive CLARITY) ist eine einfache und kostengünstige Methode für große Gewebestücke zu löschen. Dieser Ansatz erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann leicht in einem temperaturgesteuerten Schüttler durchgeführt werden. Über den Zeitraum von einigen Wochen, auch große, hoch myelinisierten Gewebe, wie eine gesamte Gehirn oder Rückenmark, werden für die Mikroskopie transparent und geeignet sind. Auch wenn dieser Bericht über das Clearing von ZNS-Gewebe konzentriert hat, können passive CLARITY zu jedem Gewebe aufgebracht werden. Die relativen Stärken und Schwächen der optischen Clearing- Techniken 13,17,22, zuvor in der Literatur diskutiert worden, aber sind am deutlichsten in 23 angelegt. Passive CLARITY ist gut geeignet für Experimente, bei denen eine große Anzahl von Proben gelöscht werden gleichzeitig und Reproduzierbarkeit ist von großer Bedeutung. Die Verwendung eines Hydrogels, zusätzlich zu unterstützen, um das Gewebe erleichtert multiple Sondieren des Gewebes. In diesem Bericht wird ein kleines Molekulargewicht Farbstoff, DAPI, wurde gezeigt, aber mehrere Runden von Antikörper-Sondierung sind auch möglich mit diesem Ansatz. Der beschriebene Ansatz weicht die oben von unserem bisher veröffentlichten Protokoll 15 in ein paar wichtigen Punkten. Zum einen in dem aktuellen Ansatz wurden die Proben nicht intrakardial mit Hydrogel perfundiert. Dies war aufgrund der Tatsache, daß das Hydrogel vorzeitig in den Schlauch und Nadeln der Perfusionsapparatur polymerisieren kann, unvollständiger Perfusionen und inkonsistente Clearing führt. Paraformaldehyd fixierten Gewebe in Hydrogel Inkubieren für 7 Tage ist konsistent mit der ursprünglichen Klarheit Protokoll 14, obwohl ein 1 Tag Inkubation für 1 verwendet wird - 3 mm dicke Gewebeschnitte in dem passiven CLARITY Technique (PACT) 17. Zweitens führt dieser Ansatz Lipidentfernung bei einer etwas höheren Temperatur , die zuvor 15-17 berichtet. Höhere Temperature beschleunigt Lipidentfernung, sondern muss gegen die Möglichkeit eines katastrophalen Verlust der Gewebeintegrität (Schmelzen) ausgeglichen werden. Durch die Erhöhung der Inkubationstemperatur von 8 ° C (bis 45 ° C) für 7 Tage und dann mit 3 ° C (bis 40 ° C) für den Rest des Lipidentfernungsprozesses ist Gewebe Clearing- beschleunigt, aber ohne die gleichzeitige Risiko von der Verlust der Gewebeintegrität. Dieser Temperaturanstieg ist mit Temperaturen während der elektrophoretischen Tissue Clearing (ETC) in der ursprünglichen CLARITY Protokoll gemeldet (50 ° C) 14 konsistent. Weiterhin wurde keine Abnahme in der Intensität der transgen exprimierten Fluorophore oder Abnahme der DAPI-Färbung beobachtet. Desoxygenierung ist ein wichtiger Schritt bei der Schaffung des Hydrogels. Das Hydrogel kann in Gegenwart von Sauerstoff in dem Hydrogel-Lösung gelöst polymerisieren, aber in unseren Händen die Geschwindigkeit und Vollständigkeit der Polymerisation war viel variabler ohne deoxygenation. Wenn die hydrogel nicht polymerisieren nicht der häufigste Grund ist die Anwesenheit von Sauerstoff in dem Hydrogel. Die optische Clearing-Prozess bemerkenswert einfach ist, jedoch zu implementieren, dass die Mikroskopie folgt kann ziemlich kompliziert sein. Von entscheidender Bedeutung sind die das Gewebe abzubilden Ziele. Der Arbeitsabstand eines Objektivs definiert die Tiefe, dass es Bild in einer Gewebeprobe. Ein Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 2 mm kann nur Bild 2 mm in eine Probe, muss daher der Arbeitsabstand einer Objektiv größer sein als die Dicke der Probe, um sie vollständig zu Bild. In ähnlicher Weise stellt die numerische Apertur einer Objektiv eine Begrenzung der Größe von Funktionen, die es lösen können sowohl in der Ebene als auch die Dicke der optischen Abschnitte, die es sinnvoll zu erwerben. Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) und Lichtblatt-Mikroskopie (LSM) kann durch die Art der Beleuchtung, die Beschränkung auf optische Schnittdicke zu überwinden, aber diese Mikrosmeistert sind nicht überall verfügbar. Hohe numerische Apertur, großen Arbeitsabstand Ziele sind selten und teuer, aber notwendig sind, um für hohe Bildqualität von großen optisch gelöscht Abschnitte. Sobald die Bilder erfasst wurden, sind sie oft sehr groß ist, für eine niedrige Auflösung von mehreren hundert MB Bereich (sowohl in der Ebene als auch der z-Richtung) Bild zu einigen TB für ein hochauflösendes Bild auf einem LSM gesammelt. Die Computer für die Bildanalyse verwendet werden, erfordern nicht nur viel Stauraum, aber große Mengen an Direktzugriffsspeicher (RAM) für die Bildverarbeitung. Software - Pakete geeignet für die Analyse von großen optisch gelöscht Bild Bände umfassen Amira, Imaris und ImageJ 14-16. Unter den Grenzen dieses Ansatzes erfordert passive CLARITY mehr Zeit Gewebe als andere optische Clearing Ansätze zu löschen. das Volumen des Gewebes abnimmt, indem es Trimmen gelöscht werden oder in kleinere Stücke können sectioning ACCELerate Lipid-Entfernung. Auch wird wiederum Abnahme Vernetzung der Konzentration von Paraformaldehyd in dem Hydrogel verringert und die Hydrogel Porengröße zu erhöhen, zu einer schnelleren Clearing führenden 17, obwohl dies zu einer größeren Gewebeexpansion führen kann, können einzelne Experimentatoren feststellen , dass es sich lohnt, die Abnahme der Lichtung Zeit. Weiterhin mit TDE als Klärungsmittel kombiniert, kann die Menge des gesamten Gewebeexpansion begrenzt werden. Obwohl dieser Bericht die Verwendung von kleinen Molekulargewicht Farbstoffe beschreibt, Sondieren Antikörper ist eine sehr natürliche nächste Schritt. Die Anwesenheit des Hydrogels bietet nicht nur körperliche Unterstützung für die gelöscht Gewebe, sondern dient auch als ein Hindernis für das Eindringen von Antikörpern tief in das Gewebe. Eine Verringerung der Acrylamidkonzentration oder die Paraformaldehydkonzentration wird die Porengröße in dem Hydrogel zu erhöhen, zu erleichtern (und damit die Beschleunigung) Antikörper 17 Penetration, aber dies hat eine schädliche Wirkung auf tissue Expansion. Dennoch können Antikörper Sondieren von Blöcken von Gewebe in wenigen Tagen erreicht werden und ganze Gehirn in ein paar Wochen das Acrylamid und Paraformaldehyd Konzentrationen in dem ursprünglichen Bericht 14 beschrieben ist . Optische Clearing- Techniken ermöglichen einen tief in das Gehirn zu sehen, Förderung des Verständnisses der Struktur und Funktion. Diese neuen Werkzeuge ermöglichen es den Forschern, das Gehirn auf zellulärer und molekularer Auflösung sichtbar zu machen, unser Verständnis dieser komplexen Organen zu erhöhen.

The ability to image complete neuroanatomical structures is immensely valuable for understanding the brain in health and disease. Traditionally, 3D imaging has required tissue sectioning to provide the axial resolution and to visualize deep anatomical structures. This approach can produce high-resolution data sets, but requires sophisticated image reconstruction techniques and is very labor intensive. As a result, it has been limited to the imaging of small volumes of tissue1-3. Optical sectioning, on the other hand, is well suited for the creation of high-resolution 3D images of fluorescently labeled tissues. Since optical sectioning is inherently three dimensional, it does not require extensive computation to produce a 3D image volume. However, light scattering and tissue opacity limit the depth at which tissues can be optically sectioned. The depth of imaging is limited to about 150 &#181;m in laser scanning confocal microscopy and to less than 800 &#181;m using two-photon excitation microscopy4-8.
In order to overcome these limitations, several optical clearing techniques have been recently developed and then further refined to permit the deep microscopic imaging of intact tissues. The use of benzyl alcohol and benzyl benzoate (BABB) to render fixed tissues transparent was among one of the earliest approaches9. However, this approach was limited by the quenching of fluorescence in the samples and incomplete clearing of highly myelinated structures10. Refinements of this technique, such as 3D Imaging of Solvent Cleared Organs (3DISCO), have led to very rapid and complete tissue clearing, but still suffer from rapid loss of fluorescent signals, especially yellow fluorescent protein (YFP)10. Water-based clearing solutions, such as Sca/e11 and SeeDB12, preserve fluorescent signals, but do not completely clear highly myelinated tissues. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) is a promising new optical clearing technology that appears to overcome the limitations of previously developed water-based clearing solutions13. In contrast with other optical clearing techniques, Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 embeds the brain in a porous matrix that provides structural integrity to proteins, nucleic acids and small molecules, while leaving lipids unbound. The lipids are then removed electrophoretically, culminating in an optically cleared brain that can be easily visualized and equally easily probed using commonly available techniques.
Electrophoretic tissue clearing (ETC) is used to remove lipids from hydrogel embedded tissues in CLARITY, however, ETC can be difficult to implement consistently and tissues subject to electrophoresis can exhibit tissue distortion, browning, loss of fluorescence and antibody reactivity. Passive lipid clearing avoids these limitations, but requires increased clearing times15-17. Passive clearing also permits the clearing of large numbers of samples in parallel, since it is not limited by the number of ETC apparatuses available. Decreasing the concentration of paraformaldehyde and excluding bis-acrylamide from the hydrogel have led to great increases in the speed of clearing at the expense of greater tissue expansion16. Less expensive alternatives to the refractive index matching solution used in the original CLARITY technique have been developed17-19. 2,2'-thiodiethanol (TDE) is an inexpensive and rapid brain clearing agent that reverses some of the tissue expansion that occurs during lipid removal18. This report incorporates passive clearing of hydrogel embedded tissue and the use of TDE as a refractive index matching solution to the original CLARITY technique to produce a highly reproducible and inexpensive protocol for the optical clearing of the mouse central nervous system.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP399-1</td>
			<td style="width:203px;">buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:212px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714-5</td>
			<td>perfusion and hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,2&#39;-thiodiethanol (TDE)</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">166782-500G</td>
			<td>refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% acrylamide</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0140</td>
			<td>hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2% bis-acrylamide</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0142</td>
			<td>hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VA-044 initiator</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>VA044</td>
			<td>hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">boric acid</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7901</td>
			<td>clearing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP166-5</td>
			<td>clearing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">55255-1</td>
			<td>buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium azide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">52002-100G</td>
			<td>preservative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">triton x-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100-500G</td>
			<td>buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heparin</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3393-50KU</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium nitrate</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP360-500</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">99.9% isoflurane</td>
			<td style="width:212px;">Phoenix</td>
			<td style="width:119px;">57319-559-06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">hydrocholoric acid</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A1445-500</td>
			<td>buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass bottom dish</td>
			<td style="width:212px;">Willco</td>
			<td style="width:119px;">HBSB-5040</td>
			<td>Willco dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">reusable adhesive</td>
			<td style="width:212px;">Bostick</td>
			<td style="width:119px;">371351</td>
			<td>Blu-Tack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">silicon elastomer</td>
			<td style="width:212px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-CAST</td>
			<td>Kwik-Cast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lint-free wipe</td>
			<td style="width:212px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td>KimWipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse brain matrix</td>
			<td style="width:212px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">SA-2175</td>
			<td>sectioning tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">matrix blades</td>
			<td style="width:212px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-9887</td>
			<td>sectioning tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:212px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77122-24</td>
			<td>pefusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">imaging software</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">LAS AF</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of the mouse central nervous system using passive clarity

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

die strukturelle Organisation des Gehirns sichtbar machen ist entscheidend für das Verständnis, wie die Morphologie und Konnektivität Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit beeinflussen. Optische Clearing-Techniken machen es möglich, Bildzellpopulationen in 3D in intakten Geweben, so dass wir kohäsiv Morphologie und Konnektivität zu studieren. Mäuse, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, angetrieben durch spezifische Promotoren Subpopulationen von Zellen ein ermöglichen, die komplexen Muster der neuronalen Verbindungen im Gehirn zu necken auseinander. THY1-YFP transgene Mäuse wurden ausführlich in der optischen Clearing- Literatur verwendet , da diese Mäuse in einer Untergruppe von Projektionsneuronen YFP exprimieren, die in der Großhirnrinde und des Hippocampus befinden, sowie andere Strukturen im Gehirn (2a &amp; b). Darüber hinaus YFP + Rindenschicht V Neuronen projizieren durch den corticospinal - Darm - Trakt in den spinal Kabel (Abbildung 2c und d), so dass sie sehr nützlich bei der Beurteilung der Wirkung der axonalen Beleidigung und / oder Verletzungen im Rückenmark auf die kortikale Neuronen 15 zu machen. Durch die Verwendung der konfokalen Mikroskopie und optische Schnitte von optisch gelöscht Geweben kann man leicht Unterschiede in neuronal Dichte über große anatomische Strukturen zu bewerten. Zusätzlich zu THY1-YFP-transgenen Mäusen kann eine beliebige Anzahl von transgenen Mäusen, abgebildet werden. PLP-EGFP transgenen Mäuse exprimieren im gesamten Gehirn und Rückenmark (Abbildung 3a) grün fluoreszierende Protein (EGFP) in reifen Oligodendrozyten exprimieren Proteo Protein (PLP) verbessert. PV-tdTomato transgenen Mäuse exprimieren tdTomato in einer Untergruppe von Parvalbumin (PV) Exprimieren Inter im Cerebellum, Striatum und Hippocampus (Abbildung 3b). Auch in Mäusen, die nicht exprimieren fluoreszierendes Transgenen, niedermolekulare fluoreszierende Farbstoffe, wie zum Beispiel DAPI kann leicht diffundieren in Hydrogel eingebetteten Geweben und erlauben die Bewertung der Zellkerne im Gehirn (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig1.jpg" /> Abb . 1: Verschiedene Phasen der Gehirn Clearing Fotografie von THY1-YFP + Gehirn der Maus , die aus dem Schädel (a) entfernt wurde. Fotografie von Hydrogel eingebettet THY1-YFP + Maus Gehirnhemisphäre (b). Fotografie von THY1-YFP + Maus Gehirnhemisphäre nach Lipidentfernung (c). Maßstabsbalken sind 5 mm in jeder Platte. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig2.jpg" /> Abbildung 2: THY1-YFP - Expression im Gehirn einnd Spinal Cord. THY1-YFP + Neuronen in der Großhirnrinde und des Hippocampus bei 5fache Vergrößerung abgebildet und rekonstruiert in 3D (a). Ein maximaler Intensitätsprojektion eines 10fach-Bildstapel der Hirnrinde die dendritische arborization der Rindenschicht V Pyramidenneuronen (b) zeigt. THY1-YFP-Expression in einer intakten Hals- und Brustrückenmark bei 5fache Vergrößerung abgebildet und rekonstruiert in 3D (c). Ein maximaler Intensitätsprojektion eines 10fach-Bildstapel des Rückenmarks zeigen einzelne Axone (d). Maßstabsbalken sind 1 mm in (a), 100 &amp; mgr; m in (b), 2 mm (c), und 100 &amp; mgr; m in (d). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig3.jpg" /> Abbildung 3: PLP-EGFP und PV-tdTomato Expression im Gehirn. </strong&gt; PLP-EGFP-Expression in einer 2 mm dicken Abschnitt koronalen Gehirn bei 5fache Vergrößerung abgebildet (a). Dieses Bild ist in etwa 1 mm von der Oberfläche des Gewebeschnittes. PV-tdTomato Ausdruck im Cerebellum einer intakten Hirnhemisphäre abgebildet bei 10-facher Vergrößerung (b). Dieses Bild ist etwa 0,5 mm von der Midsagittalebene. Maßstabsbalken sind 1 mm in (a) und 250 &amp; mgr; m in (b). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig4.jpg" /> Abbildung 4: DAPI - Färbung im Gehirn DAPI Ausdruck im Cerebellum einer intakten Hirnhemisphäre bei 5fache Vergrößerung abgebildet.. Das Bild ist in etwa 1 mm von der Medianebene. Der Einschub zeigt die Detailebene sichtbar bei diesem Abbildungstiefe bei 10-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken einre 250 &amp; mgr; m in der Hauptkonsole und 50 &amp; mgr; m im Einsatz. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Puffer </td><td> Chemisch </td><td> Die Endkonzentration </td></tr><tr><td> Perfusions - Lösung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Natriumnitrat </td><td> 0,5% w / v </td></tr><tr><td></td><td> Heparin </td><td> 10 U / ml </td></tr><tr><td> Fixierlösung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Paraformaldehyde </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td> Hydrogellösung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Paraformaldehyd </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Acrylamide </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Bis-Acrylamid </td><td> 0,05% v / v </td></tr><tr><td></td><td> VA-044-Initiator </td><td> 0,25% w / v </td></tr><tr><td> Clearing - Puffer </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Borsäure </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td></td><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> 4% w / v </td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x phosphatgepufferte Salzlösung </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Triton X-100 </td><td> 0,1% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Natriumazid </td><td> 0,1% w / v </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Puffer und Lösungen.

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Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

optical-clearing-mouse-central-nervous-system-using-passive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Serie: Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...