GLP-1-Immunoassays wurde von dem Core Biochemische Assay Laboratory am Addenbrooke Hospital durchgeführt. Diese Arbeit hat, im Laufe der Jahre durch den Wellcome Trust (derzeit aktiv Zuschüsse 106262 / Z / 14 / Z und 106263 / Z / 14 / Z) und das Medical Research Council (MRC) (Zuschüsse MRC_MC_UU_12012 / 3 und MRC_MC_UU_12012 unterstützt / 5).

Alle Tier Verfahren wurden von der University of Cambridge Tierschutz und ethische Prüfungsgremium genehmigt und entsprachen den Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Änderung der Verordnungen (SI 2012/3039). 1. Vorbereitung im Voraus <ol><li> Einen aliquoten Teil Basalmembranmatrix (BMM) (~ 200 &amp; mgr; l) auf Eis auftauen. HINWEIS: Die BMM erstarrt bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Vorwärmen 50 ml sterile Hoch Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (ohne Zusätze) und ~ 40 ml steriles Kulturmedium (High-glucose DMEM mit 10% fötalen Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin (P / S) und 2 mM L-Glutamin) in 50 ml - Zentrifugenröhrchen in einem Wasserbad bei 37 o C. </li><li> Vorkühlung Calcium- und Magnesium-enthaltende Phosphat-gepufferte Saline (PBS). </li><li> Abwiegen 15 mg Kollagenase (XI roh), in dem ein 50 ml Zentrifugenröhrchen halten und es auf Eis. <ol><li&gt; ACHTUNG: Kollagenase ist schädlich. Es verursacht Hautreizungen (H315) und schwere Augenreizung (H319). Es kann Allergien oder Asthma-Symptome oder Atembeschwerden verursachen beim Einatmen (H334). Es kann die Atemwege reizen (H335). Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, Staubbildung vermeiden und Einatmen von Staub vermeiden. Für ausreichende Belüftung. </li></ol></li></ol> 2. Gewebeentnahme <ol><li> Hinzufügen ~ 20 ml L-15-Medium in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen und ihn auf Eis. </li><li> Euthanize eine Maus durch zervikale Dislokation oder andere Zeitplan 1 Methode zugelassen. HINWEIS: Darmgewebe wird in der Regel von Mäusen auf einem C57BL6 Hintergrund erhalten. Allerdings haben andere genetische Hintergründe auch zB 129 / SvEv 15 verwendet. Imaging Experimente erfordern die Verwendung von fluoreszierenden Reporter Mäuse zB GLU-Venus 1. Das Gewebe wird von erwachsenen Mäusen (2-6 Monate) beiderlei Geschlechts erhalten. Die Mäuse werden in individua untergebrachtlly belüftete Käfige mit ad libitum Zugang zu Wasser und reguläres Futter. Allerdings kann die Wirkung einer hohes Fett - Diät, zu testen , Experimente zum Beispiel auf enteroendokrinen Zellfunktion 16 durchgeführt werden , wenn sie von einer Projektlizenz unterstützt. </li><li> Sezieren und sanft entfernen Maus Darms (von Pylorus des Rektums zu starten) unter Verwendung einer Pinzette und Schere Dissektion. Bewahren Sie es in L-15-Medium auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol> 3. Gewebepräparation <ol><li> Platzieren Darmgewebe in einer 10 cm Petrischale ausreichend PBS, das um das Gewebe zu bedecken. Nehmen 10 cm von gewünschten Geweben (zB oberen Dünndarm, top 10 cm, distal Pylorus). </li><li> Auszuspülen Darminhalt unter Verwendung einer Kunststoff - Pasteurpipette und gekühlt PBS. <ol><li> Mit einer Pinzette vorsichtig Griff ein Ende des intestinalen Segments und Ort der Spitze einer Pasteur-Pipette hinein. Auszuspülen Inhalt mit gekühltem PBS. Wiederholen von beiden Enden bis zum majorität des Inhalts ausgespült wurde. Übertragen auf eine saubere Petrischale frisch gekühlt PBS enthält. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette, entfernen Sie das Fettgewebe und Gekröse, kümmert sich die Muskelschicht in der gleichen Zeit nicht abziehen. </li><li> Peel die Muskelschicht „wie eine Socke“ unter einem Präpariermikroskop mit zwei Sätzen von feiner Pinzette aus. HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht wesentlich, aber sehr zu empfehlen. Es gibt alternative Möglichkeiten, die Muskelschicht, die die hier beschriebenen entfernen. Zum Beispiel kann der Darm in Längsrichtung offen erster geschnitten werden, vor der Entfernung des Muskelschicht. <ol><li> Finden Sie einen Ausgangspunkt an dem mehr proximalen Ende des Gewebes, wo es eine sichtbare Klappe des Muskels ist. Ziehen Sie eine kleine Menge der Muskelschicht den ganzen Weg um den Darm entfernt. HINWEIS: Um ein Reißen der Muskelschicht oder das Darmepithel zu vermeiden, verringern die Spannkraft durch eine größere Oberfläche Spann anstatt die tips der feinen Pinzette. </li><li> Festzuklemmen Darm und so viel von den Muskellappen wie möglich ziehen sanft auseinander und beginnt, die Muskelschicht aus dem ganzen Darm Abblättern. Um zu vermeiden, beide Schicht und Epithel des Muskels reißen, halten Sie die Position der Zange Nachstellen, um sie zusammen zu halten schließen. Auf diese Weise entfernen die gesamte Länge des Darmsegments und Verwerfen der Muskelschicht. </li></ol></li><li> Schneiden Sie den Darm offen längs und Wäsche in einem sauberen Petrischale mit frischen, gekühlten PBS wirbeln. Bei Bedarf wiederholen alle verbleibenden Speisebrei oder Schleim zu entfernen. </li><li> Mince Gewebe mit einem chirurgischen Skalpell zu erreichen Quadrate ~ 1-2 mm 2 und fügen diese zu ~ 20 ml gekühlte PBS in einem 50-ml - Zentrifugenröhrchen mit einer Pasteurpipette. Zur Vermeidung von Gewebestücken an der Pipette haften, abgeschnitten der Spitze und benetzen die Pipette durch Verreiben mit PBS. </li><li> Vorsichtig schütteln das Rohr weitere Stücke um das Gewebe zu waschen. Lassen Sie das Gewebe besiedeln und gießen oder pipette die Mehrheit der PBS ab und wiederholen Sie mit frischem PBS, bis die PBS klar aussieht. </li></ol> 4. Herstellung von BBM-beschichteten Platte / Geschirr und Digestionsmedium HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden (mit Inkubationsschritte in 37 ° C-Wasserbad). <ol><li> Vorbereiten einer 2% Lösung in gekühltes BMM DMEM (ohne Zusätze). Während der Arbeit, halten Sie die Lösung auf Eis. Für eine 2% ige Lösung, 140 &amp; mgr; l aufgetaut fügt BMM auf 7 ml DMEM (genug , um eine einzige 24-Well - Platte herzustellen). <ol><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l 2% BMM-Lösung pro Well (24-Well-Platte) oder pro Glasboden Abbildungs ​​Schal. </li><li> mindestens 30 min in einem Inkubator bei 37 ° C inkubieren beschichteten Platten / Geschirr für für eine ausreichende Polymerisation des BMM zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Fügen Sie den 50 ml vorgewärmten DMEM (ohne Zusätze) zu dem 15 mg Kollagenase (aus den Schritten 1.2 und 1.4) , um eine 0,3 mg / ml - Lösung zu bilden und invertieren aufzulösen. <ol><li> Aufce vollständig gelöst, eine 20 ml-Spritze, filtern die Kollagenase-Lösung durch einen 0,2 um Sterilfilter in ein neues steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie diese als Digestionsmedium. </li></ol></li></ol> 5. Gewebeverdauungs <ol><li> Entfernen Sie die Gewebestücke aus dem PBS 10 ml serologische Pipette und fügen in ein steriles 50-ml - Zentrifugenröhrchen gekühltes steriles DMEM , das (ohne Zusätze), Wirbel und dann DMEM entfernen. HINWEIS: Zur Vermeidung von Gewebe an der serologischen Pipette kleben, nass ist es durch Verreiben mit DMEM, bevor sie mit dem Gewebe in Kontakt zu treten. </li><li> ‚Digest‘ 1 und 2: Entfernung von Zelltrümmern und Einzelzellen <ol><li> In 7 ml Digestionsmedium auf die Gewebestücke und gibt einen Wirbel der Röhre. </li><li> Inkubieren Sie für 5 min in einem Wasserbad bei 37 ° C. </li><li> Sachte schütteln das Rohr für ~ 3 s (nicht wirbeln). </li><li> Lassen Sie das Gewebe besiedeln und das Digestionsmedium zu verwerfen, eine Reservierungkleines Volumen an unter dem Mikroskop zu betrachten. HINWEIS: Vor allem, wenn ausgehend, ist es sehr empfehlenswert, ein kleines Volumen jedes ‚verdauen‘ (~ 30 ul) unter dem Mikroskop zu untersuchen den Fortschritt des Verdauungsprozesses zu messen. Wenn viele Krypten in diesem Stadium beobachtet werden, kann das Rütteln zu heftig sein. Für repräsentative Bilder von dem, was die verschiedenen ‚verdauen‘ Stufen typischerweise aussehen, siehe Abbildung 1. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.2.-5.2.4 (mit frischem Digestionsmedium). </li></ol></li><li> ‚Digests‘ 3 bis 5: Sammlung von Krypta - Fragmenten <ol><li> In 7 ml Digestionsmedium zum Gewebe. </li><li> bei 37 ° C für 10 min inkubieren. <ol><li> Während der Inkubation schütteln alle 5 min für 10-12 s. HINWEIS: Das Rütteln ist kräftiger als das Schütteln für ‚verdaut‘ 1 und 2. </li></ol></li><li> Erlauben unverdaute Gewebe zu besiedeln und die Digestionsmedium in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln. ObGewebe wird versehentlich zusammen mit dem Medium gesammelt, lassen es zu, Entfernen einer serologischen 10 ml-Pipette und übertragen sie zurück in die 50-ml-Zentrifugenröhrchen das unverdaute Gewebe enthält. </li><li> Zentrifuge gesammelt Medium / Überstand bei RT für 3 min bei 100 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendiere das Zellpellet in 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium durch vorsichtiges Zerreiben und beiseite gestellt. </li><li> Inspizieren ein kleines Volumen der Zellsuspension unter dem Mikroskop (siehe Anmerkung aus Schritt 5.2.4). HINWEIS: Idealerweise beginnen Krypta-Fragmente in ‚verdaut‘ 3 zusammen mit Zelltrümmern und einzelnen Zellen zu erscheinen. ‚Digests‘ 4 und 5 enthalten , eine signifikant größere Anzahl von Krypta - Fragmenten mit reduzierter Zelldebris (Abbildung 1). Intensität einstellen wie erforderlich Schütteln dh , wenn das Gewebe nicht verdaut und Krypta - Fragment nicht angezeigt werden, stärker schütteln. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.3.1-5.3.6 bis 5 ‚verdaut‘ gewesenabgeschlossen oder bis der größte Teil des Gewebes hat (a 6. verdauen kann erforderlich sein) verdaut worden. </li><li> Wenn alle Überstände von ‚Digests‘ 3-5 (oder 3-6) wurden gesammelt, die Zentrifuge verdauen Überstand bei RT für 3 min bei 100 x g. </li><li> Zum Sekretion Experimenten, vereinige die Überstände von ‚Digests‘ 3-5 (oder 3-6) vor der Zentrifugation. HINWEIS: Weniger Gewebe für die Bildgebung Experimente benötigt wird, also den Digest Überstand wählen, das die sauberste (Fehlen von Zelltrümmern und Einzelzellen) mit der größeren Anzahl der Krypta Fragmente ist. Dies ist in der Regel ‚verdauen‘ 4 oder 5. </li><li> Überstand verwerfen und sanft resuspendieren Sie das Pellet durch Verreiben, bis keine Klumpen sichtbar sind. Resuspendieren des Pellets in vorgewärmtem Kulturmedium mit 10 &amp; mgr; M Y-27632 - Dihydrochlorid ergänzt (zur Verhinderung anoikis 17). Verwenden 5 ml für die Sekretion Experimente und 2 ml Kulturmedium für die Bildgebung Experimente. </li><li> FilterZellsuspension durch ein 100-um-Filter (jede unverdaute Gewebe zu entfernen). Führen Sie eine weitere 2 ml vorgewärmtes Kulturmedium durch den Filter zu waschen (Gesamtvolumen: 7 ml und 4 ml für die Sekretion und Bildgebung, respectively). HINWEIS: Die Filterung ist nicht wesentlich, jedoch größere Gewebestücke neigen dazu, nicht auf die Platte / Geschirr zu halten. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Abbildung 1: repräsentative Bilder von ‚Digests‘ von primären Dünndarms Kulturverfahren. (A) Typisches Material aus ‚Digests‘ 1 und 2 , das im Wesentlichen Einzelzellen und Zelltrümmer. (B) Ein Beispiel für Produkte von ‚verdauen‘ 3. Die schwarzen Pfeile zeigen Krypta - Fragmente in dem Material verdauen erscheinen. (C) Typisch für ‚verdauen‘ 4 oder 5 ist Panel (D) gepoolte Material verdauen darstellt aus‚Digests‘ 3-5 durch einen 100 - um - Filter geleitet , um die größeren unerwünschten Gewebefragmente zu entfernen , in (C) zu sehen. Alle Bilder wurden unter Verwendung eines digitalen inverses Mikroskop mit einem 20x-Objektiv genommen. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 6. Plating Intestinal Cultures (angereichertes für Kryptenzellen) <ol><li> Entfernen überschüssige BMM-Lösung von der Platte oder Geschirr, und fügt auch 250 &amp; mgr; l vorgewärmtes Kulturmedium pro Sekretion. HINWEIS: Imaging Schalen werden ohne Medium belassen, so zum nächsten Schritt schreiten schnell den Schal vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Platte 250 &amp; mgr; l Zellsuspension pro Well (24-Well - Platte) oder pro Glasbodenschale. <ol><li> Platte tropfenweise in einer langsamen ‚Zick-Zack‘ Bewegung über die Brunnen. Allow Krypta-Fragmente für ~ 5 min absetzen, bevor die Platte zu bewegen the Inkubator. Hinweis: Dies sollte eine gleichmäßige Verteilung der Krypten / Zellen innerhalb des Schachtes fördern. </li></ol></li><li> Inkubieren Platte oder Teller über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. ANMERKUNG: Ein ‚flächendeckend‘ einschichtig sollte gebildet haben. Für ein repräsentatives Bild von Kulturen folgenden drei Wäschen, siehe 2A. </li><li> ‚Hochwasser‘ Bildgebungsschalen mit 2 ml vorgewärmtem Kulturmedium pro Schale. HINWEIS: Diese Gerichte werden für die Bildgebung geeignet für bis zu ~ 72 h Plattierung folgen. Kolon-Kulturen dauern in der Regel länger, bis zu 7 Tage. Zellen, die nicht eingehalten haben, können durch einen Waschschritt entfernt werden. Primärkulturen sind nun bereit für Experimente verwendet werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine Dünndarmzellen die Untersuchung von Darmpeptid Sekretion und Einzelzellen-Bildgebung von markierten enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Um die Wahrscheinlichkeit der kleinen intestinalen Kulturen, erfolgreich zu erhöhen, ist es wichtig, dass das Protokoll so schnell wie möglich durchgeführt wird (idealerweise innerhalb von 3 h der Gewebeernte), und dass das Gewebe wird in eiskaltem Medium gehalten oder Puffer vor auf die Verdauung, den Zelltod zu begrenzen. Zwar ist es nicht unbedingt notwendig, vor allem für Kolon-Kulturen ist, die Entfernung von der Muskelschicht aus dem Dünndarm wird stark gefördert. Das kleine Darm-Kultur-Protokoll wird so weit wie möglich standardisiert. Allerdings ist es wichtig, dass kein Verdauungsprozess ist identisch zu beachten. Es gibt viele Schritte in diesem Protokoll wo Variabilität kann zum Beispiel des Grades des Muskelabbaus, die Größe von t an einem Tag zu Tag eingeführt werdener Gewebestücke ‚gehackt‘, um die Stärke des Schüttelns, um die Wirksamkeit einer bestimmten Charge von Kollagenase etc. Es ist daher von größter Bedeutung, Teilmengen von jedem der verschiedenen ‚verdaut‘ unter dem Mikroskop zu untersuchen den Fortschritt der Verdauung und Schneider das Schütteln und die Zahl der ‚Digests‘ entsprechend zu bewerten. Es wird empfohlen, mehr sanft zu schütteln und zu beginnen, wenn Krypta Fragmente aus nicht offensichtlich sind ‚verdauen‘ 3 ab, zu beginnen mehr heftiges Schütteln. Aus unserer Erfahrung nicht in Kultur enteroendokrinen Zellen vermehren sich und werden in der Regel von kleinen Darm Kulturen innerhalb von 4 Tagen verloren. Dennoch ermöglicht diese genügend Zeit gut Peptid-Sekretion Experimente (in der Regel mehr als 2 h, 18-24 h nach Plattieren) auszuführen physiologischen Stimuli und / oder pharmakologische Mittel zu testen. Versuche vor dem Experiment Sekretion einer Inkubation über Nacht erfordern , sind auch denkbar , zum Beispielim Fall der Vorbehandlung mit Pertussistoxin 15. Die primäre Kulturtechnik präsentiert hier ist ein gut etabliertes Verfahren, wie durch das Volumen der Forschungsergebnisse belegen sie im Laufe der Jahre hervorgebracht hat. Das primäre Kulturmodell wird verwendet, um die Sekretion einer Vielzahl von gut Peptide zu untersuchen, einschließlich GLP-1 1, GIP 18 und PYY 19, in Reaktion auf diverse Nährstoff- und nicht-Nährstoff 14, 20 Stimuli und Inhibitoren. Darüber hinaus hat die gleiche Technik , 21 zu der Kultur von menschlichen Darmzellen erfolgreich eingesetzt worden. Oft wird eine Kombination aus dem primären Zellkultur - Verfahren zusammen mit einem zusätzlichen experimentellen Modell zB. ex vivo oder in vivo können die meisten Einblick 6 liefern. Insbesondere und im Gegensatz zu anderen Methoden, diese Technik hat important Anwendungen, die über die Messung von Darmpeptidfreisetzung. Wir haben gezeigt , dass primäre Kulturen aus Dünndarm - transgenen Mäusen reporter leistungsfähige Werkzeuge gekoppelt , um die Abfrage von intrazellulären Signalwege sind abgeleitetes Peptid - Sekretion darm, beispielsweise unter Verwendung der Ca 2+ und cAMP - Sensoren, GCaMP3 11, 13 und 14 Epac2camps jeweils sowie elektrophysiologische Techniken 12. Wie bei allen in vitro - Modellen, die primären intestinalen Kulturen bestimmte inhärente Beschränkungen einschließlich dem Verlust der Polarität der Epithelzellen in Kultur, sowie der Verlust der Blutversorgung und Innervation. Es ist schwierig, die potenziellen Auswirkungen dieser künstlichen Bedingungen auf enteroendokrinen Zellfunktion zu schätzen. Doch aus Primärkulturen gewonnenen Daten oft übersetzbar waren in dem in vivo setting (zB Wirkungen von kurzkettigen Fettsäuren auf die GLP-1 - Sekretion 15). Die primären Darm-Kulturen sind eine vielseitige Technik mit vielen Anwendungsmöglichkeiten. Sie haben bereits wichtige mechanistische Einblicke in die Regulation des Darms Peptid Sekretion zur Verfügung gestellt.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, zu isolieren und Kultur gemischt murinen Darmzellen die Untersuchung der Darm-Peptid-Sekretion und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Eine frühe Version dieses Verfahrens wurde ursprünglich im Jahr 2008 von Reimann et al. Und 1 hat , da die Basis von weiteren 20 Veröffentlichungen unserer Arbeitsgruppe gebildet. Aus diesem Manuskript, wählten wir auf kleine Darm-Kulturen zu konzentrieren, da sie schwieriger sind als Kolon-Kulturen zu etablieren. Enteroendokrinen Zellen sezernieren eine Reihe von Darmpeptide einschließlich Glucagon-like Peptid 1 (GLP-1), glukoseabhängige insulinotrope Peptid (GIP), Cholecystokinin (CCK) und Peptid YY (PYY) 2. Diese Darmpeptide haben wichtige physiologische Rolle in der postprandialen Reaktionen wie die Verlangsamung der Darmtransit orchestriert, Potenzierung der Glucose-stimulierte Freisetzung von Insulin und Induktion der Sättigung. GLP-1-Mimetika and Medikamente , die seinen Abbau hemmen , werden derzeit für die Behandlung von Typ - 2 - Diabetes zugelassen , und es gibt die laufende Beurteilung des therapeutischen Potenzials der endogene Sekretion dieses Peptids 3 stimuliert. Ein besseres Verständnis der enteroendokrinen Physiologie und die Mechanismen, durch die die Sekretion entweder stimuliert oder gehemmt ist daher von entscheidender Bedeutung. Gut Peptid - Sekretion untersucht wird , kann eine Vielzahl von in vitro und ex vivo unter Verwendung von experimentellen Modellen, die jeweils Vor- und Nachteilen (für eine umfassende aktuelle Übersicht abdeckt auch die Verwendung von in - vivo - Modellen siehe Svendsen et al. 4). Ex - vivo - Techniken , wie beispielsweise der Darm isoliert perfundierten 5 und Ussing - Kammern 6 sind derzeit verwendeter Darm - Peptid - Sekretion als Antwort auf verschiedene Substanzen zu entdecken. Der Hauptvorteil dieser Methoden, wiePrimärkulturen im Vergleich zu, ist, dass die unmittelbare Umgebung der enteroendokrinen Zellen weitgehend intakt bleibt und vor allem wird die Polarität der Zellen erhalten. Daher ist es möglich , Informationen zu entlocken , die die Zelloberfläche ein Sekretagogum auf 6 wirkt. Diese sind jedoch typischerweise geringe Durchsatzverfahren, und die Qualität der von ihnen abgeleiteten Daten stützt sich stark auf die Integrität und Lebensfähigkeit des Darmgewebes, die zwangsläufig mit der Zeit abnehmen. Intestinale Organoide werden jetzt in zunehmendem Maße als in vitro - Modelle für die Untersuchung der enteroendokrinen Zellfunktion und Entwicklung 7 verwendet wird. Organoide, die sowohl von murinen und humanen Geweben abgeleitet werden können, hat den Vorteil der 3D ‚Krypta-like‘ Strukturen bilden, die Zellpolarität in Kultur halten. Jedoch haben organoiden abgeleitetes enteroendokrinen Zellen noch nicht vollständig an natives L cel charakterisiert und ihre Ähnlichkeit werdenls bleibt weitgehend unbekannt. Primäre Kulturen haben den Vorteil, einen Schritt näher an der physiologischen Einstellung zu sein, wie enteroendokrinen Zellen sind nicht in künstlichen Bedingungen für längere Zeiträume aufrechterhalten und differenziert. Eine alternative Primärkulturverfahren , die für die Bewertung der Darm - Peptid - Sekretion eingesetzt wurde , ist die Isolierung von fötalen Rattendarmzellen (FRICS) 8. Allerdings hat sich die Kultur von adulten Darmgewebe mit weniger Erfolg und einige Unterschiede wurden in der Ansprechbarkeit von FRICS vs. erwachsenen Mäuse - Darm-Zellen (zB Glucose 8) beobachtet. Enteroendokrinen artigen Zelllinien (zB GLUTag, STC-1 und NCI-H716) werden traditionell verwendet worden vs direkt zu unterscheiden. indirekte Wirkungen auf Zellen und enteroendokrinen zugrunde liegende molekulare Mechanismen sezieren, um Sekretionskopplung Reiz; siehe Kuhre et al </em&gt;. 9 für die Peptidproduktion und Sekretion von ‚L zellähnliche‘ immortalisierte Zelllinien. Dies wurde als enteroendokrinen Zellen notwendig gewesen, entlang des Magen - Darm - Trakt verstreut, bilden knapp 1% der intestinalen Epithelzellen 10 und sortierten Zellen, in unseren Händen, nicht überleben in Kultur 1. Zelllinien nützliche Werkzeuge bleiben aufgrund der Tatsache, dass sie eine weitgehend homogene Zellpopulation sind, die auf genetische Manipulationen, wie Gen-Silencing förderlich ist. Folglich ist es leicht, die Rolle von Proteinen zu untersuchen, die nicht pharmakologisch ausgerichtet werden können, wenn transgene Mäuse nicht verfügbar sind. Allerdings Zelllinien sind nicht immer gültig Modelle von Primärzellen. Zwar gibt es viele Ähnlichkeiten, Erkenntnisse aus Primärkulturen gelegentlich hervorgehoben haben Unterschiede in den Signalweg durch bestimmte Nährstoffe in primären L - Zellen im Vergleich zu GLUTag Zellen aktiviert, zum Beispiel (z. B. Peptone &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 11). Entscheidend ist, dass in Kombination mit transgenen Mäusen fluoreszierenden Reporter, das primäre Kulturmodell ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der einzelnen Primär enteroendokrinen Zellen an der intrazellulären Ebene. Fluoreszenz-markierte L - Zellen innerhalb von Primärkulturen werden für die Patch - Clamp - 1, 12 Studien , die von unserer Gruppe verwendet wurden, und Einzelzellen - Calcium 11, 13 und cyclischem Adenosinmonophosphat-FRET - Bildgebung 14 Studien, die wesentliche Fortschritte auf dem Gebiet der enteroendokrinen nachgegeben Physiologie. Das folgende Protokoll ist für die Durchführung der Sekretion Experimente optimiert, eine 24-Well-Platte oder für die Herstellung von bis zu 16 Abbildungs ​​Geschirr, aus einem 10 cm-Abschnitt des Dünndarms von einer einzigen erwachsenen Maus. Das Protokoll kann leicht für die Untersuchung von Kolon-Zellen modifiziert werden, indem Aufschlusszeiten zu erhöhen und Collagenase Konzentration.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>For secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bombesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4272</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 ml, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml, sterile</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430828</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI (Crude)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>For making up digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose (4500 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td>For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps/Tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT520</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td><a href="https://ufslive.admin.cam.ac.uk/OA_HTML/OA.jsp?OAFunc=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;OASF=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;reqHeaderId=%7B%21%21VHZooXq3GHQ6ng85h4o4sA%7D&amp;retainAM=Y&amp;addBreadCrumb=Y&amp;_ti=372495995&amp;oapc=18&amp;oas=dSLT2zPz7cgLm-ZkBP6Y6Q.." title="MatTek glass bottom dishes P35G-0-14-C">P35G-0-14-C</a></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High precision tweezer (110 mm)</td>
			<td>IDEAL-TEK</td>
			<td>3480641 (5 SA)</td>
			<td>For removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution digital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-ER</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td>For collecting tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaFluor&#160;</td>
			<td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence ratio imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL6)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>For calcium imaging and secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (EVOS XL Core)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>For photomicrographs of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4234</td>
			<td>For cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>For washing tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/4280/53</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT554</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>0308</td>
			<td>For dicing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip</td>
			<td>BD</td>
			<td>300613</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp 75W</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, mit hormonsezerniere enteroendokrinen Zellen entlang der Länge des Magen-Darm-Epithel entfernt. Trotz ihrer physiologischen Bedeutung, repräsentieren enteroendokrinen Zellen nur einen kleinen Teil der epithelialen Zellpopulation und in der Vergangenheit hat ihre Charakterisierung eine große Herausforderung in einer Abhängigkeit von Zelllinie Modellen resultierende präsentiert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese Primärkulturen wurden verwendet, um die Signalwege, die unter der Stimulierung und Hemmung von Darmpeptid Sekretion in Reaktion auf eine Reihe von Nährstoffen und Neuropeptiden sowie pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren. Ferner wird in Kombination mit der Verwendung von transgenen Mäusen fluoreszierender Reporter haben wir gezeigt, daß diese Primärkulturen ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Zellen an den enteroendokrinen in wordenzellulären Ebene, unter Verwendung von Verfahren wie Patch-Clamp und Einzelzellen-Calcium und cAMP-FRET-Bildgebung.

Die Verwendung von serieller Verdauung Schritten ermöglicht die Sammlung von einer relativ sauberen Herstellung von Krypta-Fragmenten für Experimente überzogen werden. Die ersten beiden Digests Entfernen hauptsächlich Einzelzellen und Zelltrümmer aus dem Aufschlußmaterial (1A). Während des dritten digest erscheinen Krypta - Fragmente in dem aufgeschlossenen Material (1B). Digests 4 und 5 ergab eine größere Anzahl von Krypta - Fragmenten mit weniger einzelnen Zellen (1C). Filtern des gepoolten Materials von Digests 3-5 größere Stücke von unverdauten Gewebe entfernt, was zu der Kultur nachteilig sein kann, die Herstellung einer sauberen Krypta Fragment Zubereitung (1D). Folgende 18-24 h der Kultur, Monoschichten von Primärzellen des Dünndarms beobachtet (2A). Unter Verwendung von transgenen Mäusen erzeugt Kulturen spezifisch die cal exprimierendenCium Fluoreszenzsensor, GCaMP3, unter der Kontrolle des Promotors Proglucagon 11 sind L - Zellen leicht erkennbar und durchsetzt in der Kultur (2B). In primären Kulturen Dünndarms, Verbindungen , die die G q -Ca 2+ Targeting i und cAMP i -abhängigen Wege die Sekretion von GLP-1 (für die Sekretion Experiment Methodik siehe Reimann et al. 1) stimuliert. Bombesin (BBS, 100 nM) und Co-Applikation von Forskolin und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 &amp; mgr; M jeweils) lösten eine 2- und 11-fach, Stimulation von GLP-1-Freisetzung im Verhältnis zu basalen bzw. (2C). Spezifische L-Zellexpression von GCaMP3 ermöglicht die Identifizierung von und Echtzeit-Überwachung der Calciummobilisierung in einzelnen L-Zellen. Sowohl 100 nM Bombesin (BBS) und 30 mM Kaliumchlorid (KCl) stimuliert vorübergehende Anstiege des intrazellulären Calciums , welches die bekannten G q &lt;/ sub&gt; - und elektrogen gekoppelter Pfade in primären L - Zellen (2D). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Daten aus primären Dünndarms Kulturen abgeleitet. Beispiel Bilder aus gemischten primären Dünndarms Kulturen verwendet für (A) Sekretion und (B) Bildgebung Experimente Stütze 24 h Plattierung. (A) Bild von einer 24-Well - Platte entnommen, ein digitales inverses Mikroskop mit einem 4X - Ziel verwendet wird . Maßstabsbalken = 500 &amp; mgr; m. (B) Unter Verwendung von GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 Mäuse - L - Zellen in dem Sichtfeld (grüner Zellen) wurden durch die Fluoreszenz von GCaMP3 identifiziert. Maßstabsbalken entspricht 50 &amp; mgr; m. (C) GLP-1 - Sekretion wurde in Reaktion gemessen Bombesin (BBS, 100 nM) und Forskolin / 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 &amp; mgr; M jeweils). Prozentsatz GLP-1-Sekretion wurde berechnet,durch GLP-1-Spiegel in den Überständen und Zelllysaten gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von n = 3 für jede Bedingung. (D) GCaMP3 Fluoreszenz (Reflexions cytosolische Calcium) der beiden Zellen in (B) dargelegt und in Echtzeit in Reaktion auf Kaliumchlorid überwacht (KCl, 30 mM) und BBS (100 nM). Einzelzellen-Bildgebung wurde mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv durchgeführt. GCaMP3 wurde bei 475/10 nm angeregt wird, eine 75-W-Xenon-Bogenlampe und einen Monochromator durch Fluoreszenz-Imaging-Software gesteuert. Emission wurde mit einer hochauflösenden digitalen charge-coupled device (CCD) Kamera aufgenommen einen dichroitischen Spiegel und ein 510-560 nm Bandfilter verwendet wird. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken.

Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

mixed-primary-cultures-murine-small-intestine-intended-for-study-gut

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Aufrufe.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge.  Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken. 

Serie: Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...