GLP-1-Immunoassays wurde von dem Core Biochemische Assay Laboratory am Addenbrooke Hospital durchgeführt. Diese Arbeit hat, im Laufe der Jahre durch den Wellcome Trust (derzeit aktiv Zuschüsse 106262 / Z / 14 / Z und 106263 / Z / 14 / Z) und das Medical Research Council (MRC) (Zuschüsse MRC_MC_UU_12012 / 3 und MRC_MC_UU_12012 unterstützt / 5).

Alle Tier Verfahren wurden von der University of Cambridge Tierschutz und ethische Prüfungsgremium genehmigt und entsprachen den Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Änderung der Verordnungen (SI 2012/3039). 1. Vorbereitung im Voraus <ol><li> Einen aliquoten Teil Basalmembranmatrix (BMM) (~ 200 &amp; mgr; l) auf Eis auftauen. HINWEIS: Die BMM erstarrt bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Vorwärmen 50 ml sterile Hoch Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (ohne Zusätze) und ~ 40 ml steriles Kulturmedium (High-glucose DMEM mit 10% fötalen Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin (P / S) und 2 mM L-Glutamin) in 50 ml - Zentrifugenröhrchen in einem Wasserbad bei 37 o C. </li><li> Vorkühlung Calcium- und Magnesium-enthaltende Phosphat-gepufferte Saline (PBS). </li><li> Abwiegen 15 mg Kollagenase (XI roh), in dem ein 50 ml Zentrifugenröhrchen halten und es auf Eis. <ol><li&gt; ACHTUNG: Kollagenase ist schädlich. Es verursacht Hautreizungen (H315) und schwere Augenreizung (H319). Es kann Allergien oder Asthma-Symptome oder Atembeschwerden verursachen beim Einatmen (H334). Es kann die Atemwege reizen (H335). Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, Staubbildung vermeiden und Einatmen von Staub vermeiden. Für ausreichende Belüftung. </li></ol></li></ol> 2. Gewebeentnahme <ol><li> Hinzufügen ~ 20 ml L-15-Medium in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen und ihn auf Eis. </li><li> Euthanize eine Maus durch zervikale Dislokation oder andere Zeitplan 1 Methode zugelassen. HINWEIS: Darmgewebe wird in der Regel von Mäusen auf einem C57BL6 Hintergrund erhalten. Allerdings haben andere genetische Hintergründe auch zB 129 / SvEv 15 verwendet. Imaging Experimente erfordern die Verwendung von fluoreszierenden Reporter Mäuse zB GLU-Venus 1. Das Gewebe wird von erwachsenen Mäusen (2-6 Monate) beiderlei Geschlechts erhalten. Die Mäuse werden in individua untergebrachtlly belüftete Käfige mit ad libitum Zugang zu Wasser und reguläres Futter. Allerdings kann die Wirkung einer hohes Fett - Diät, zu testen , Experimente zum Beispiel auf enteroendokrinen Zellfunktion 16 durchgeführt werden , wenn sie von einer Projektlizenz unterstützt. </li><li> Sezieren und sanft entfernen Maus Darms (von Pylorus des Rektums zu starten) unter Verwendung einer Pinzette und Schere Dissektion. Bewahren Sie es in L-15-Medium auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol> 3. Gewebepräparation <ol><li> Platzieren Darmgewebe in einer 10 cm Petrischale ausreichend PBS, das um das Gewebe zu bedecken. Nehmen 10 cm von gewünschten Geweben (zB oberen Dünndarm, top 10 cm, distal Pylorus). </li><li> Auszuspülen Darminhalt unter Verwendung einer Kunststoff - Pasteurpipette und gekühlt PBS. <ol><li> Mit einer Pinzette vorsichtig Griff ein Ende des intestinalen Segments und Ort der Spitze einer Pasteur-Pipette hinein. Auszuspülen Inhalt mit gekühltem PBS. Wiederholen von beiden Enden bis zum majorität des Inhalts ausgespült wurde. Übertragen auf eine saubere Petrischale frisch gekühlt PBS enthält. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette, entfernen Sie das Fettgewebe und Gekröse, kümmert sich die Muskelschicht in der gleichen Zeit nicht abziehen. </li><li> Peel die Muskelschicht „wie eine Socke“ unter einem Präpariermikroskop mit zwei Sätzen von feiner Pinzette aus. HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht wesentlich, aber sehr zu empfehlen. Es gibt alternative Möglichkeiten, die Muskelschicht, die die hier beschriebenen entfernen. Zum Beispiel kann der Darm in Längsrichtung offen erster geschnitten werden, vor der Entfernung des Muskelschicht. <ol><li> Finden Sie einen Ausgangspunkt an dem mehr proximalen Ende des Gewebes, wo es eine sichtbare Klappe des Muskels ist. Ziehen Sie eine kleine Menge der Muskelschicht den ganzen Weg um den Darm entfernt. HINWEIS: Um ein Reißen der Muskelschicht oder das Darmepithel zu vermeiden, verringern die Spannkraft durch eine größere Oberfläche Spann anstatt die tips der feinen Pinzette. </li><li> Festzuklemmen Darm und so viel von den Muskellappen wie möglich ziehen sanft auseinander und beginnt, die Muskelschicht aus dem ganzen Darm Abblättern. Um zu vermeiden, beide Schicht und Epithel des Muskels reißen, halten Sie die Position der Zange Nachstellen, um sie zusammen zu halten schließen. Auf diese Weise entfernen die gesamte Länge des Darmsegments und Verwerfen der Muskelschicht. </li></ol></li><li> Schneiden Sie den Darm offen längs und Wäsche in einem sauberen Petrischale mit frischen, gekühlten PBS wirbeln. Bei Bedarf wiederholen alle verbleibenden Speisebrei oder Schleim zu entfernen. </li><li> Mince Gewebe mit einem chirurgischen Skalpell zu erreichen Quadrate ~ 1-2 mm 2 und fügen diese zu ~ 20 ml gekühlte PBS in einem 50-ml - Zentrifugenröhrchen mit einer Pasteurpipette. Zur Vermeidung von Gewebestücken an der Pipette haften, abgeschnitten der Spitze und benetzen die Pipette durch Verreiben mit PBS. </li><li> Vorsichtig schütteln das Rohr weitere Stücke um das Gewebe zu waschen. Lassen Sie das Gewebe besiedeln und gießen oder pipette die Mehrheit der PBS ab und wiederholen Sie mit frischem PBS, bis die PBS klar aussieht. </li></ol> 4. Herstellung von BBM-beschichteten Platte / Geschirr und Digestionsmedium HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden (mit Inkubationsschritte in 37 ° C-Wasserbad). <ol><li> Vorbereiten einer 2% Lösung in gekühltes BMM DMEM (ohne Zusätze). Während der Arbeit, halten Sie die Lösung auf Eis. Für eine 2% ige Lösung, 140 &amp; mgr; l aufgetaut fügt BMM auf 7 ml DMEM (genug , um eine einzige 24-Well - Platte herzustellen). <ol><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l 2% BMM-Lösung pro Well (24-Well-Platte) oder pro Glasboden Abbildungs ​​Schal. </li><li> mindestens 30 min in einem Inkubator bei 37 ° C inkubieren beschichteten Platten / Geschirr für für eine ausreichende Polymerisation des BMM zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Fügen Sie den 50 ml vorgewärmten DMEM (ohne Zusätze) zu dem 15 mg Kollagenase (aus den Schritten 1.2 und 1.4) , um eine 0,3 mg / ml - Lösung zu bilden und invertieren aufzulösen. <ol><li> Aufce vollständig gelöst, eine 20 ml-Spritze, filtern die Kollagenase-Lösung durch einen 0,2 um Sterilfilter in ein neues steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie diese als Digestionsmedium. </li></ol></li></ol> 5. Gewebeverdauungs <ol><li> Entfernen Sie die Gewebestücke aus dem PBS 10 ml serologische Pipette und fügen in ein steriles 50-ml - Zentrifugenröhrchen gekühltes steriles DMEM , das (ohne Zusätze), Wirbel und dann DMEM entfernen. HINWEIS: Zur Vermeidung von Gewebe an der serologischen Pipette kleben, nass ist es durch Verreiben mit DMEM, bevor sie mit dem Gewebe in Kontakt zu treten. </li><li> ‚Digest‘ 1 und 2: Entfernung von Zelltrümmern und Einzelzellen <ol><li> In 7 ml Digestionsmedium auf die Gewebestücke und gibt einen Wirbel der Röhre. </li><li> Inkubieren Sie für 5 min in einem Wasserbad bei 37 ° C. </li><li> Sachte schütteln das Rohr für ~ 3 s (nicht wirbeln). </li><li> Lassen Sie das Gewebe besiedeln und das Digestionsmedium zu verwerfen, eine Reservierungkleines Volumen an unter dem Mikroskop zu betrachten. HINWEIS: Vor allem, wenn ausgehend, ist es sehr empfehlenswert, ein kleines Volumen jedes ‚verdauen‘ (~ 30 ul) unter dem Mikroskop zu untersuchen den Fortschritt des Verdauungsprozesses zu messen. Wenn viele Krypten in diesem Stadium beobachtet werden, kann das Rütteln zu heftig sein. Für repräsentative Bilder von dem, was die verschiedenen ‚verdauen‘ Stufen typischerweise aussehen, siehe Abbildung 1. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.2.-5.2.4 (mit frischem Digestionsmedium). </li></ol></li><li> ‚Digests‘ 3 bis 5: Sammlung von Krypta - Fragmenten <ol><li> In 7 ml Digestionsmedium zum Gewebe. </li><li> bei 37 ° C für 10 min inkubieren. <ol><li> Während der Inkubation schütteln alle 5 min für 10-12 s. HINWEIS: Das Rütteln ist kräftiger als das Schütteln für ‚verdaut‘ 1 und 2. </li></ol></li><li> Erlauben unverdaute Gewebe zu besiedeln und die Digestionsmedium in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln. ObGewebe wird versehentlich zusammen mit dem Medium gesammelt, lassen es zu, Entfernen einer serologischen 10 ml-Pipette und übertragen sie zurück in die 50-ml-Zentrifugenröhrchen das unverdaute Gewebe enthält. </li><li> Zentrifuge gesammelt Medium / Überstand bei RT für 3 min bei 100 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendiere das Zellpellet in 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium durch vorsichtiges Zerreiben und beiseite gestellt. </li><li> Inspizieren ein kleines Volumen der Zellsuspension unter dem Mikroskop (siehe Anmerkung aus Schritt 5.2.4). HINWEIS: Idealerweise beginnen Krypta-Fragmente in ‚verdaut‘ 3 zusammen mit Zelltrümmern und einzelnen Zellen zu erscheinen. ‚Digests‘ 4 und 5 enthalten , eine signifikant größere Anzahl von Krypta - Fragmenten mit reduzierter Zelldebris (Abbildung 1). Intensität einstellen wie erforderlich Schütteln dh , wenn das Gewebe nicht verdaut und Krypta - Fragment nicht angezeigt werden, stärker schütteln. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.3.1-5.3.6 bis 5 ‚verdaut‘ gewesenabgeschlossen oder bis der größte Teil des Gewebes hat (a 6. verdauen kann erforderlich sein) verdaut worden. </li><li> Wenn alle Überstände von ‚Digests‘ 3-5 (oder 3-6) wurden gesammelt, die Zentrifuge verdauen Überstand bei RT für 3 min bei 100 x g. </li><li> Zum Sekretion Experimenten, vereinige die Überstände von ‚Digests‘ 3-5 (oder 3-6) vor der Zentrifugation. HINWEIS: Weniger Gewebe für die Bildgebung Experimente benötigt wird, also den Digest Überstand wählen, das die sauberste (Fehlen von Zelltrümmern und Einzelzellen) mit der größeren Anzahl der Krypta Fragmente ist. Dies ist in der Regel ‚verdauen‘ 4 oder 5. </li><li> Überstand verwerfen und sanft resuspendieren Sie das Pellet durch Verreiben, bis keine Klumpen sichtbar sind. Resuspendieren des Pellets in vorgewärmtem Kulturmedium mit 10 &amp; mgr; M Y-27632 - Dihydrochlorid ergänzt (zur Verhinderung anoikis 17). Verwenden 5 ml für die Sekretion Experimente und 2 ml Kulturmedium für die Bildgebung Experimente. </li><li> FilterZellsuspension durch ein 100-um-Filter (jede unverdaute Gewebe zu entfernen). Führen Sie eine weitere 2 ml vorgewärmtes Kulturmedium durch den Filter zu waschen (Gesamtvolumen: 7 ml und 4 ml für die Sekretion und Bildgebung, respectively). HINWEIS: Die Filterung ist nicht wesentlich, jedoch größere Gewebestücke neigen dazu, nicht auf die Platte / Geschirr zu halten. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Abbildung 1: repräsentative Bilder von ‚Digests‘ von primären Dünndarms Kulturverfahren. (A) Typisches Material aus ‚Digests‘ 1 und 2 , das im Wesentlichen Einzelzellen und Zelltrümmer. (B) Ein Beispiel für Produkte von ‚verdauen‘ 3. Die schwarzen Pfeile zeigen Krypta - Fragmente in dem Material verdauen erscheinen. (C) Typisch für ‚verdauen‘ 4 oder 5 ist Panel (D) gepoolte Material verdauen darstellt aus‚Digests‘ 3-5 durch einen 100 - um - Filter geleitet , um die größeren unerwünschten Gewebefragmente zu entfernen , in (C) zu sehen. Alle Bilder wurden unter Verwendung eines digitalen inverses Mikroskop mit einem 20x-Objektiv genommen. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 6. Plating Intestinal Cultures (angereichertes für Kryptenzellen) <ol><li> Entfernen überschüssige BMM-Lösung von der Platte oder Geschirr, und fügt auch 250 &amp; mgr; l vorgewärmtes Kulturmedium pro Sekretion. HINWEIS: Imaging Schalen werden ohne Medium belassen, so zum nächsten Schritt schreiten schnell den Schal vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Platte 250 &amp; mgr; l Zellsuspension pro Well (24-Well - Platte) oder pro Glasbodenschale. <ol><li> Platte tropfenweise in einer langsamen ‚Zick-Zack‘ Bewegung über die Brunnen. Allow Krypta-Fragmente für ~ 5 min absetzen, bevor die Platte zu bewegen the Inkubator. Hinweis: Dies sollte eine gleichmäßige Verteilung der Krypten / Zellen innerhalb des Schachtes fördern. </li></ol></li><li> Inkubieren Platte oder Teller über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. ANMERKUNG: Ein ‚flächendeckend‘ einschichtig sollte gebildet haben. Für ein repräsentatives Bild von Kulturen folgenden drei Wäschen, siehe 2A. </li><li> ‚Hochwasser‘ Bildgebungsschalen mit 2 ml vorgewärmtem Kulturmedium pro Schale. HINWEIS: Diese Gerichte werden für die Bildgebung geeignet für bis zu ~ 72 h Plattierung folgen. Kolon-Kulturen dauern in der Regel länger, bis zu 7 Tage. Zellen, die nicht eingehalten haben, können durch einen Waschschritt entfernt werden. Primärkulturen sind nun bereit für Experimente verwendet werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine Dünndarmzellen die Untersuchung von Darmpeptid Sekretion und Einzelzellen-Bildgebung von markierten enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Um die Wahrscheinlichkeit der kleinen intestinalen Kulturen, erfolgreich zu erhöhen, ist es wichtig, dass das Protokoll so schnell wie möglich durchgeführt wird (idealerweise innerhalb von 3 h der Gewebeernte), und dass das Gewebe wird in eiskaltem Medium gehalten oder Puffer vor auf die Verdauung, den Zelltod zu begrenzen. Zwar ist es nicht unbedingt notwendig, vor allem für Kolon-Kulturen ist, die Entfernung von der Muskelschicht aus dem Dünndarm wird stark gefördert. Das kleine Darm-Kultur-Protokoll wird so weit wie möglich standardisiert. Allerdings ist es wichtig, dass kein Verdauungsprozess ist identisch zu beachten. Es gibt viele Schritte in diesem Protokoll wo Variabilität kann zum Beispiel des Grades des Muskelabbaus, die Größe von t an einem Tag zu Tag eingeführt werdener Gewebestücke ‚gehackt‘, um die Stärke des Schüttelns, um die Wirksamkeit einer bestimmten Charge von Kollagenase etc. Es ist daher von größter Bedeutung, Teilmengen von jedem der verschiedenen ‚verdaut‘ unter dem Mikroskop zu untersuchen den Fortschritt der Verdauung und Schneider das Schütteln und die Zahl der ‚Digests‘ entsprechend zu bewerten. Es wird empfohlen, mehr sanft zu schütteln und zu beginnen, wenn Krypta Fragmente aus nicht offensichtlich sind ‚verdauen‘ 3 ab, zu beginnen mehr heftiges Schütteln. Aus unserer Erfahrung nicht in Kultur enteroendokrinen Zellen vermehren sich und werden in der Regel von kleinen Darm Kulturen innerhalb von 4 Tagen verloren. Dennoch ermöglicht diese genügend Zeit gut Peptid-Sekretion Experimente (in der Regel mehr als 2 h, 18-24 h nach Plattieren) auszuführen physiologischen Stimuli und / oder pharmakologische Mittel zu testen. Versuche vor dem Experiment Sekretion einer Inkubation über Nacht erfordern , sind auch denkbar , zum Beispielim Fall der Vorbehandlung mit Pertussistoxin 15. Die primäre Kulturtechnik präsentiert hier ist ein gut etabliertes Verfahren, wie durch das Volumen der Forschungsergebnisse belegen sie im Laufe der Jahre hervorgebracht hat. Das primäre Kulturmodell wird verwendet, um die Sekretion einer Vielzahl von gut Peptide zu untersuchen, einschließlich GLP-1 1, GIP 18 und PYY 19, in Reaktion auf diverse Nährstoff- und nicht-Nährstoff 14, 20 Stimuli und Inhibitoren. Darüber hinaus hat die gleiche Technik , 21 zu der Kultur von menschlichen Darmzellen erfolgreich eingesetzt worden. Oft wird eine Kombination aus dem primären Zellkultur - Verfahren zusammen mit einem zusätzlichen experimentellen Modell zB. ex vivo oder in vivo können die meisten Einblick 6 liefern. Insbesondere und im Gegensatz zu anderen Methoden, diese Technik hat important Anwendungen, die über die Messung von Darmpeptidfreisetzung. Wir haben gezeigt , dass primäre Kulturen aus Dünndarm - transgenen Mäusen reporter leistungsfähige Werkzeuge gekoppelt , um die Abfrage von intrazellulären Signalwege sind abgeleitetes Peptid - Sekretion darm, beispielsweise unter Verwendung der Ca 2+ und cAMP - Sensoren, GCaMP3 11, 13 und 14 Epac2camps jeweils sowie elektrophysiologische Techniken 12. Wie bei allen in vitro - Modellen, die primären intestinalen Kulturen bestimmte inhärente Beschränkungen einschließlich dem Verlust der Polarität der Epithelzellen in Kultur, sowie der Verlust der Blutversorgung und Innervation. Es ist schwierig, die potenziellen Auswirkungen dieser künstlichen Bedingungen auf enteroendokrinen Zellfunktion zu schätzen. Doch aus Primärkulturen gewonnenen Daten oft übersetzbar waren in dem in vivo setting (zB Wirkungen von kurzkettigen Fettsäuren auf die GLP-1 - Sekretion 15). Die primären Darm-Kulturen sind eine vielseitige Technik mit vielen Anwendungsmöglichkeiten. Sie haben bereits wichtige mechanistische Einblicke in die Regulation des Darms Peptid Sekretion zur Verfügung gestellt.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, zu isolieren und Kultur gemischt murinen Darmzellen die Untersuchung der Darm-Peptid-Sekretion und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Eine frühe Version dieses Verfahrens wurde ursprünglich im Jahr 2008 von Reimann et al. Und 1 hat , da die Basis von weiteren 20 Veröffentlichungen unserer Arbeitsgruppe gebildet. Aus diesem Manuskript, wählten wir auf kleine Darm-Kulturen zu konzentrieren, da sie schwieriger sind als Kolon-Kulturen zu etablieren. Enteroendokrinen Zellen sezernieren eine Reihe von Darmpeptide einschließlich Glucagon-like Peptid 1 (GLP-1), glukoseabhängige insulinotrope Peptid (GIP), Cholecystokinin (CCK) und Peptid YY (PYY) 2. Diese Darmpeptide haben wichtige physiologische Rolle in der postprandialen Reaktionen wie die Verlangsamung der Darmtransit orchestriert, Potenzierung der Glucose-stimulierte Freisetzung von Insulin und Induktion der Sättigung. GLP-1-Mimetika and Medikamente , die seinen Abbau hemmen , werden derzeit für die Behandlung von Typ - 2 - Diabetes zugelassen , und es gibt die laufende Beurteilung des therapeutischen Potenzials der endogene Sekretion dieses Peptids 3 stimuliert. Ein besseres Verständnis der enteroendokrinen Physiologie und die Mechanismen, durch die die Sekretion entweder stimuliert oder gehemmt ist daher von entscheidender Bedeutung. Gut Peptid - Sekretion untersucht wird , kann eine Vielzahl von in vitro und ex vivo unter Verwendung von experimentellen Modellen, die jeweils Vor- und Nachteilen (für eine umfassende aktuelle Übersicht abdeckt auch die Verwendung von in - vivo - Modellen siehe Svendsen et al. 4). Ex - vivo - Techniken , wie beispielsweise der Darm isoliert perfundierten 5 und Ussing - Kammern 6 sind derzeit verwendeter Darm - Peptid - Sekretion als Antwort auf verschiedene Substanzen zu entdecken. Der Hauptvorteil dieser Methoden, wiePrimärkulturen im Vergleich zu, ist, dass die unmittelbare Umgebung der enteroendokrinen Zellen weitgehend intakt bleibt und vor allem wird die Polarität der Zellen erhalten. Daher ist es möglich , Informationen zu entlocken , die die Zelloberfläche ein Sekretagogum auf 6 wirkt. Diese sind jedoch typischerweise geringe Durchsatzverfahren, und die Qualität der von ihnen abgeleiteten Daten stützt sich stark auf die Integrität und Lebensfähigkeit des Darmgewebes, die zwangsläufig mit der Zeit abnehmen. Intestinale Organoide werden jetzt in zunehmendem Maße als in vitro - Modelle für die Untersuchung der enteroendokrinen Zellfunktion und Entwicklung 7 verwendet wird. Organoide, die sowohl von murinen und humanen Geweben abgeleitet werden können, hat den Vorteil der 3D ‚Krypta-like‘ Strukturen bilden, die Zellpolarität in Kultur halten. Jedoch haben organoiden abgeleitetes enteroendokrinen Zellen noch nicht vollständig an natives L cel charakterisiert und ihre Ähnlichkeit werdenls bleibt weitgehend unbekannt. Primäre Kulturen haben den Vorteil, einen Schritt näher an der physiologischen Einstellung zu sein, wie enteroendokrinen Zellen sind nicht in künstlichen Bedingungen für längere Zeiträume aufrechterhalten und differenziert. Eine alternative Primärkulturverfahren , die für die Bewertung der Darm - Peptid - Sekretion eingesetzt wurde , ist die Isolierung von fötalen Rattendarmzellen (FRICS) 8. Allerdings hat sich die Kultur von adulten Darmgewebe mit weniger Erfolg und einige Unterschiede wurden in der Ansprechbarkeit von FRICS vs. erwachsenen Mäuse - Darm-Zellen (zB Glucose 8) beobachtet. Enteroendokrinen artigen Zelllinien (zB GLUTag, STC-1 und NCI-H716) werden traditionell verwendet worden vs direkt zu unterscheiden. indirekte Wirkungen auf Zellen und enteroendokrinen zugrunde liegende molekulare Mechanismen sezieren, um Sekretionskopplung Reiz; siehe Kuhre et al </em&gt;. 9 für die Peptidproduktion und Sekretion von ‚L zellähnliche‘ immortalisierte Zelllinien. Dies wurde als enteroendokrinen Zellen notwendig gewesen, entlang des Magen - Darm - Trakt verstreut, bilden knapp 1% der intestinalen Epithelzellen 10 und sortierten Zellen, in unseren Händen, nicht überleben in Kultur 1. Zelllinien nützliche Werkzeuge bleiben aufgrund der Tatsache, dass sie eine weitgehend homogene Zellpopulation sind, die auf genetische Manipulationen, wie Gen-Silencing förderlich ist. Folglich ist es leicht, die Rolle von Proteinen zu untersuchen, die nicht pharmakologisch ausgerichtet werden können, wenn transgene Mäuse nicht verfügbar sind. Allerdings Zelllinien sind nicht immer gültig Modelle von Primärzellen. Zwar gibt es viele Ähnlichkeiten, Erkenntnisse aus Primärkulturen gelegentlich hervorgehoben haben Unterschiede in den Signalweg durch bestimmte Nährstoffe in primären L - Zellen im Vergleich zu GLUTag Zellen aktiviert, zum Beispiel (z. B. Peptone &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 11). Entscheidend ist, dass in Kombination mit transgenen Mäusen fluoreszierenden Reporter, das primäre Kulturmodell ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der einzelnen Primär enteroendokrinen Zellen an der intrazellulären Ebene. Fluoreszenz-markierte L - Zellen innerhalb von Primärkulturen werden für die Patch - Clamp - 1, 12 Studien , die von unserer Gruppe verwendet wurden, und Einzelzellen - Calcium 11, 13 und cyclischem Adenosinmonophosphat-FRET - Bildgebung 14 Studien, die wesentliche Fortschritte auf dem Gebiet der enteroendokrinen nachgegeben Physiologie. Das folgende Protokoll ist für die Durchführung der Sekretion Experimente optimiert, eine 24-Well-Platte oder für die Herstellung von bis zu 16 Abbildungs ​​Geschirr, aus einem 10 cm-Abschnitt des Dünndarms von einer einzigen erwachsenen Maus. Das Protokoll kann leicht für die Untersuchung von Kolon-Zellen modifiziert werden, indem Aufschlusszeiten zu erhöhen und Collagenase Konzentration.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>For secretion experiments</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 15 mL, sterile</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>For tissue preperation/digestion</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 50 mL, sterile</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430828</td><td>For tissue preperation/ digestion</td></tr><tr><td>Collagenase XI (Crude)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>For making up digestion medium</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>DMEM High glucose (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>For dissolving matrigel (keep at 4 &amp;deg;C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Forceps/Tweezers</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>High precision tweezer (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>For removing muscle layer</td></tr><tr><td>High resolution digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>For collecting tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td></tr><tr><td>MetaFluor&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td><td>-</td><td>Fluorescence ratio imaging software</td></tr><tr><td>Mice (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td></tr><tr><td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>in house</td><td>-</td><td>For calcium imaging and secretion experiments</td></tr><tr><td>Microscope (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>For photomicrographs of cultures</td></tr><tr><td>Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>For cleaning tissue</td></tr><tr><td>PBS containing Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>For washing tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>Penicillin &amp;amp; Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Sterile cell strainer 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td></tr><tr><td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>For dicing tissue</td></tr><tr><td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &amp;micro;m pore size)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Xenon arc lamp 75W</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)</td></tr></tbody></table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, mit hormonsezerniere enteroendokrinen Zellen entlang der Länge des Magen-Darm-Epithel entfernt. Trotz ihrer physiologischen Bedeutung, repräsentieren enteroendokrinen Zellen nur einen kleinen Teil der epithelialen Zellpopulation und in der Vergangenheit hat ihre Charakterisierung eine große Herausforderung in einer Abhängigkeit von Zelllinie Modellen resultierende präsentiert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese Primärkulturen wurden verwendet, um die Signalwege, die unter der Stimulierung und Hemmung von Darmpeptid Sekretion in Reaktion auf eine Reihe von Nährstoffen und Neuropeptiden sowie pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren. Ferner wird in Kombination mit der Verwendung von transgenen Mäusen fluoreszierender Reporter haben wir gezeigt, daß diese Primärkulturen ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Zellen an den enteroendokrinen in wordenzellulären Ebene, unter Verwendung von Verfahren wie Patch-Clamp und Einzelzellen-Calcium und cAMP-FRET-Bildgebung.

Die Verwendung von serieller Verdauung Schritten ermöglicht die Sammlung von einer relativ sauberen Herstellung von Krypta-Fragmenten für Experimente überzogen werden. Die ersten beiden Digests Entfernen hauptsächlich Einzelzellen und Zelltrümmer aus dem Aufschlußmaterial (1A). Während des dritten digest erscheinen Krypta - Fragmente in dem aufgeschlossenen Material (1B). Digests 4 und 5 ergab eine größere Anzahl von Krypta - Fragmenten mit weniger einzelnen Zellen (1C). Filtern des gepoolten Materials von Digests 3-5 größere Stücke von unverdauten Gewebe entfernt, was zu der Kultur nachteilig sein kann, die Herstellung einer sauberen Krypta Fragment Zubereitung (1D). Folgende 18-24 h der Kultur, Monoschichten von Primärzellen des Dünndarms beobachtet (2A). Unter Verwendung von transgenen Mäusen erzeugt Kulturen spezifisch die cal exprimierendenCium Fluoreszenzsensor, GCaMP3, unter der Kontrolle des Promotors Proglucagon 11 sind L - Zellen leicht erkennbar und durchsetzt in der Kultur (2B). In primären Kulturen Dünndarms, Verbindungen , die die G q -Ca 2+ Targeting i und cAMP i -abhängigen Wege die Sekretion von GLP-1 (für die Sekretion Experiment Methodik siehe Reimann et al. 1) stimuliert. Bombesin (BBS, 100 nM) und Co-Applikation von Forskolin und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 &amp; mgr; M jeweils) lösten eine 2- und 11-fach, Stimulation von GLP-1-Freisetzung im Verhältnis zu basalen bzw. (2C). Spezifische L-Zellexpression von GCaMP3 ermöglicht die Identifizierung von und Echtzeit-Überwachung der Calciummobilisierung in einzelnen L-Zellen. Sowohl 100 nM Bombesin (BBS) und 30 mM Kaliumchlorid (KCl) stimuliert vorübergehende Anstiege des intrazellulären Calciums , welches die bekannten G q &lt;/ sub&gt; - und elektrogen gekoppelter Pfade in primären L - Zellen (2D). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Daten aus primären Dünndarms Kulturen abgeleitet. Beispiel Bilder aus gemischten primären Dünndarms Kulturen verwendet für (A) Sekretion und (B) Bildgebung Experimente Stütze 24 h Plattierung. (A) Bild von einer 24-Well - Platte entnommen, ein digitales inverses Mikroskop mit einem 4X - Ziel verwendet wird . Maßstabsbalken = 500 &amp; mgr; m. (B) Unter Verwendung von GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 Mäuse - L - Zellen in dem Sichtfeld (grüner Zellen) wurden durch die Fluoreszenz von GCaMP3 identifiziert. Maßstabsbalken entspricht 50 &amp; mgr; m. (C) GLP-1 - Sekretion wurde in Reaktion gemessen Bombesin (BBS, 100 nM) und Forskolin / 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 &amp; mgr; M jeweils). Prozentsatz GLP-1-Sekretion wurde berechnet,durch GLP-1-Spiegel in den Überständen und Zelllysaten gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von n = 3 für jede Bedingung. (D) GCaMP3 Fluoreszenz (Reflexions cytosolische Calcium) der beiden Zellen in (B) dargelegt und in Echtzeit in Reaktion auf Kaliumchlorid überwacht (KCl, 30 mM) und BBS (100 nM). Einzelzellen-Bildgebung wurde mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv durchgeführt. GCaMP3 wurde bei 475/10 nm angeregt wird, eine 75-W-Xenon-Bogenlampe und einen Monochromator durch Fluoreszenz-Imaging-Software gesteuert. Emission wurde mit einer hochauflösenden digitalen charge-coupled device (CCD) Kamera aufgenommen einen dichroitischen Spiegel und ein 510-560 nm Bandfilter verwendet wird. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken.

Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Aufrufe.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge.  Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken. 

Serie: Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Krebsforschung

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Biotechnik

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medizin

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Mechanismen, die Hormonausschüttung der Darm mit der isolierten durchblutet Ratte Dünndarm

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Immunologie und Infektion

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biologie

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

3D-Kultur von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einzelnen Stammzellen

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autor im Rampenlicht: Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...