Diese Arbeit wurde durch ein EMBO-Langzeit-Stipendiums (ABW) unterstützt, ein National Science Foundation International Postdoctoral Research Fellowship (ABW), die Max-Planck-Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), ein DIGS-BB-Stipendium (AO), und der Europäische Forschungsrat im Rahmen der Europäischen Gemeinschaften Siebten Rahmenprogramms STG-207634 (DS, ACO). Wir danken Ravi Desai für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Wir möchten auch die MPI-CBG-Protein-Expression Anlage für die Herstellung des Zebrafisch Fibronectin1 Fragment, dem Fisch den zuständigen Personen MPI-CBG für die Pflege und Wartung unserer Fisch-Linien und des MPI-CBG Lichtmikroskopie-Anlage für die Bildgebung Unterstützung danken.

1. Bevor Dissection <ol><li> Am Tag vor der Dissektion erhalten Embryonen aus einer incross der Zebrafisch-Paare heterozygot für das transgene Allel. <ol><li> Heben Embryonen in E3-Medium ohne Methylenblau bei 28 o C bis Schild Stufe (6 Stunden nach der Befruchtung). </li><li> Transfer-Embryonen in E3-Medium ohne Methylenblau bis 20 o CO / N. Bei 20 o C, werden Embryonen 1 h pro Somiten bilden, sobald sie Schwanzknospen-Stadium zu erreichen. Nach 17-20 h O / N bei 20 ° C, sollte Embryonen im 5-8 Somiten sein inszenieren am folgenden Morgen zu Beginn der Dissektion Protokoll. </li></ol></li><li> Assemble-Tools und Reagenzien für die Präparation erforderlich. <ol><li> Feuerpolierte Glaspipette für die Übertragung von Embryonen und Gewebe </li><li> Feinen Pinzette zur Entfernung von Chorion aus Embryonen </li><li> Sylgard-beschichtete 35-mm-Schale für die Präparation - Gießen Sylgard Polymer in eine 35 mm-Schale und Heilung O / N in einem 37 ° C Machen Sie das auch mit Dissektioneine Nadelspitze auf ein kleines Volumen des ausgehärteten Polymer zu entfernen. Das Gericht kann gereinigt und anschließend wiederverwendet werden. </li><li> Geschärfte, abgeflacht Wolframdraht-Tools für PSM Gewebemanipulation </li><li> Mikro-Skalpell zum Schneiden gewünschten Stücke von PSM zu Kultur </li><li> 35-mm-Kunststoffschale für Trypsin Inkubation </li><li> L15-Medium mit 10% fötalem Rinderserum </li><li> 0,25% Trypsin / EDTA-Lösung </li><li> Sigmacoted Gel-loading Tipps für die Verbreitung </li><li> Petrischalen aus Kunststoff E3-Medium ohne Methylenblau. </li></ol></li><li> Decken Sie Glasbodenschale mit Bild Fibronectin1 Substrat (10 ug / ml in PBS). Lassen Gericht auf der Bank zu beschichten beim Präparieren. </li><li> Verwenden Stereoskop mit geeigneten Fluoreszenzfiltern zu identifizieren und zu sortieren positiven transgenen Embryonen (5-8 Somitenstadium). <ol><li> Identifizieren transgenen Embryos durch die Untersuchung der präsomitischen Mesoderm (PSM) für YFP Expression unter Fluoreszenzkanal (Abbildung 1A). Fluoreszenz-shoULD unsichtbar im Bereich der letzten Somiten zum Schwanzknospen. Wählen Embryonen mit hellsten Signal; 25% der Nachkommen sollten homozygoten Embryonen mit 2 Kopien des Transgens sein. Die Anzahl der identifizierten Embryonen erforderlich ist je nach Experiment basiert. Ein Stück wird seziert Schwanzknospen ergeben 1000 Zellen, im Durchschnitt. Normalerweise sind ein paar zusätzliche positive Embryonen nützlich, wenn Fehler während der Präparation gemacht. </li><li> Verwenden Durchlicht als Positionsbezug, jede Autofluoreszenz zu unterscheiden, vor allem in den Dotterzelle, aus dem Signal. </li><li> Übertragen positive Embryonen zu einem separaten Kunststoffpetrischale mit E3-Medium ohne Methylenblau. </li></ol></li></ol> 2. PSM Dissection und Zerstreuung <ol><li> Bereiten Embryonen für die Präparation. <ol><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, mit feinen Pinzette vorsichtig entfernen das Chorion von jedem Embryo in der E3-Medium. Achten Sie darauf, um den Embryo zu beschädigen oder stören die Dotterzelle. </li&gt; <li> Füllen Sylgard-beschichtete Sezieren Gericht mit L15-Medium mit Serum. Mit einer Pinzette oder einem anderen flachen Werkzeug, entfernen Sie alle Luftblasen von der Oberfläche des Sylgard. </li><li> Übertragen dechorionated Embryonen mit der feuerpolierten Glaspipette auf die Dissektion Gericht. </li><li> Mit den Drahtwerkzeuge, verschieben Sie alle Embryonen auf der einen Seite der Sezieren Gericht. </li></ol></li><li> Dissect PSM von einer einzigen Embryo. <ol><li> Orient ein einzelner Embryo auf seiner lateralen Seite in der kleinen und in der Sylgard Schicht innerhalb der Sezieren Gericht (Abbildung 1B) gemacht. </li><li> Mit der Mikro-Skalpell, Schnitt durch den Embryo und Dotterzelle knapp vor den Hinterhirn und durch die ventralen Pol des Embryos (1B, gestrichelte rote Linie). </li><li> Entfernen Sie die vordere Stück des Embryos aus dem Brunnen, bewegen sie weg auf die Seite der Schale, und dann die Draht Werkzeuge, um aus dem hinteren Abschnitt einschließlich der PSM weg kratzen restlichen Dotterzelle Körnchen. </li><li>Sobald das Eigelb wurde abgekratzt, glätten und richten Sie die PSM mit dem vorderen Ende nach vom Experimentator und die hintere in Richtung des Experimentators (Abbildung 1C). </li><li> Wenn die dünne Schicht Ektoderm hat sich nicht von dieser Stelle gezogen wird, verwenden Sie die Draht Werkzeuge, um sie zu schälen weg von der Spitze des PSM Gewebe. </li><li> Mit der Mikro-Skalpell die Schwanzknospe, die hintersten Spitze des PSM über das Ende der Chorda, weg vom Rest des Gewebes (1C, gestrichelte rote Linie). Hinweis: andere Gewebeteile von der PSM beispiels anterioren PSM näher an der zuletzt gebildeten Somiten, können auch in Kultur genommen werden, abhängig von den experimentellen Frage. </li><li> Bewegen Sie den Schwanzknospen Stück in eine Ecke der Schale von der Sektionsbereich. Verwenden Sie die Draht Werkzeuge, um jeglichen Schmutz und unerwünschten Embryo Gewebe aus dem Seziersaal Feld zu löschen. </li><li> Wiederholen Sie mit dem nächsten Embryo. </li></ol></li><li> Pool Schwanzknospen Stücke aus mehreren Embryos, je nachdem, wie viele Zellen für das Experiment erforderlich ist. Im Durchschnitt ein einziges Stück Schwanzknospen Gewebe ergibt 1000 Zellen. </li><li> Füllen Sie leere 35-mm-Kunststoffschale mit einem kleinen Volumen von Trypsin-EDTA. </li><li> Mit der feuerpolierten Glas Pipette Schwanzknospen Stücke aus Sezieren Gericht in Schale mit Trypsin / EDTA. Schwanzknospen Stücke inkubieren in Trypsin / EDTA für 20 Minuten bei RT. </li><li> Während das Gewebe wird in Trypsin, entfernen Sie die Fibronectin1 Lösung aus dem Glasboden-Imaging-Gericht. <ol><li> Mit MilliQ Wasser waschen die Lösung aus Glas 3 mal. Saugen Sie jeden Wasch zu entfernen und sicherzustellen, dass das Gericht vollständig trocken ist. </li></ol></li><li> Dispersionsschwanzknospen Stücke in Medium für Bildgebung. <ol><li> Je 100 ul der L15-Medium mit Serum in bildgebenden Gericht. </li><li> Mit einem Gel-beschichteten Spitze, entfernen Sie die Stücke aus der Schwanzknospe Trypsin / EDTA in einem möglichst kleinen Volumen wie möglich. </li><li> Pipettieren Schwanzknospen-Stücke in das Medium in derBild Gericht. Pipettieren Sie die Stücke nach oben und unten mehrmals, um sie auseinander brechen und Zellen aussetzen im Medium. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu einzuführen. Check für Zellklumpen unter dem Mikroskop und verteilen mehr als nötig. </li><li> Lassen Sie verteilten Zellen in der Suspension auf die Fibronectin1-beschichtete Glas für 20 min bei RT begleichen. </li></ol></li><li> Hinzufügen eines kleinen Volumens von Zusatz L15-Medium mit Serum zu den Zellen vor Beginn der Bildgebung. Seien Sie vorsichtig, nicht zu ständiger Zellen zu zerstören. </li><li> Angesichts der experimentellen Frage, fügen Sie keine zusätzliche oder medikamentöse Behandlungen auf die Kultur. </li></ol> 3. Imaging von Dispersed PSM Zellen <ol><li> Richten Sie Bild Gericht Temperaturkammer auf der Zeitraffer-Imaging-Mikroskop. Eingestellt Warner Kammer auf die gewünschte Temperatur für das Experiment. Lassen Gericht für mindestens 30 min ins Gleichgewicht vor Beginn der Bildaufnahme. Crosscheck Temperatur mit externen Temperaturfühler in die Schale gelegt, falls erforderlich. HINWEIS: Aufgrund derdie Beziehung zwischen Temperatur und Somitogenese Rate 21 stabile Temperaturregelung ist für genaue Messungen der Periode, in einzelnen PSM-Zellen. </li><li> Erwerben Sie Testbilder in der Fluoreszenzkanal, um zu überprüfen, dass die Belichtungszeit und Gain bieten einen großen dynamischen Bereich von Intensitäten ohne Sättigung zu guten Rauschpegel zu gewährleisten. Ein typisches Fluoreszenzbild von dispergierten Zellen aus unseren Linien erzeugt mit diesem Protokoll erfassten erfordert 400 ms und 40 ms für einen Durchlichtbild mit einem EMCCD Kamera, die bei einer EM-Gewinn von 85. Außerdem Pre-Amp Gain und Auslesegeschwindigkeit aus der Kamera sind auch wichtig, um das Signal über Lärm zu maximieren. </li><li> Mit dem Durchlichtkanal, wählen Sie Felder von Zellen für die Zeitraffer-Akquisition. </li><li> Führen Zeitraffer-Akquisition-Protokoll für die gewünschte Länge der Zeit. <ol><li> Erwerben Sie ein Durchlicht-und Fluoreszenzbild einer pro Feld. HINWEIS: Stellen Sie ein Intervall zwischen den Anschaffungs rounds, die zeitliche Dynamik ohne Foto-Bleichen über erweiterte Bildgebung oder Induktion Toxizität in den Zellen erfassen wird. Dieses Protokoll verwendet eine 2 Minuten-Intervall. </li></ol></li><li> Überprüfen Zeitraffer-Set-up gelegentlich während der Aufnahme, um sicherzustellen, dass die Zellen im Fokus bleiben, keine Software-oder Hardware-Fehler, etc. </li></ol> 4. Image Processing der erworbenen Zeitraffer-Filme <ol><li> Offen für eine Filmdatei erworben Feld in einer Bildverarbeitungs-Software. HINWEIS: Fidschi wurde für die gesamte Verarbeitung in diesem Protokoll verwendet. <ol><li> Split Durchlicht-und Fluoreszenzbilder von einem Feld in zwei Stapeln von Bildern. </li></ol></li><li> Track eine einzelne Zelle in der Durchlichtkanal. <ol><li> Legen einen kreis ROI (Region von Interesse), die um die ausgewählte Zelle in dem ersten Rahmen in der übertragenen Lichtkanal. HINWEIS:.. Nur Zellen, die ein gesund sind am Ende der Aufnahme, zwei haben nicht bewegen außerhalb des Feldes, und 3 nicht in Kontakt mit anderen ce kommen.lls werden nachverfolgt. </li><li> Speichern Sie eine ROI alle paar Frames an den ROI-Manager. Verfolgen Zelle, bis zum letzten Frame. </li></ol></li><li> Messen Intensität über die gespeicherten ROIs auf die Fluoreszenz-Kanal. <ol><li> Wählen Sie das Fluoreszenz-Stack und mit dem gespeicherten ROIs, verwenden Sie die benutzerdefinierte Kreis Interpolator-Plug-in-und Makro, um die Intensität des Raupen Zelle über die Zeit zu messen. </li><li> Überprüfen Sie die Ausgabe Spur von der Makro. Wenn die Spur qualitativ erfasst Merkmale der Fluoreszenz Zeitraffer, exportieren Sie die Werte in eine Excel-Arbeitsblatt. </li><li> Speichern Sie die ROI-Liste für die Zelle. </li></ol></li><li> Wiederholen Verfolgung in tragenen Kanal und Messen der Fluoreszenzkanal für andere Zellen in dem Feld. </li><li> Wiederholen Sie alle Schritte für weitere Felder aus dem Experiment. </li></ol>

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Autor Beiträge: ABW entwickelt und verfeinert, die Verbreitung, Kultur-, Imaging-und Zell Tracking-Protokolle. DS erzeugt der transgenen Linien und überwachte die Gestaltung der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskop in diesem Protokoll verwendet. AO Pionier ersten Proof-of-principle Experimente zu distanzieren und Bild PSM-Zellen in der Kultur. JS schrieb den Kreis Interpolator Plugin-Tool verwendet werden, um in Fidschi Fluoreszenzintensität von Zeitraffer-Filmen messen. ABW und ACO schrieb das Manuskript.

Um einen zellulären Prozess, der im Laufe der embryonalen Entwicklung stattfindet, zu studieren, Biologen verwenden typischerweise einen Ansatz im Kontext des gesamten Embryos. Jedoch zu verstehen, wie eine einzelne Zelle in einem Entwicklungszeitrahmen verhält, ist eine Methode, zu prüfen und zu stören einzelnen Zellen isoliert auch sehr nützlich. Durch die Erzeugung verteilt PSM Zellkulturen unter Verwendung von transgenen Zebrafischembryonen haben wir jetzt ein Werkzeug, um die Zelle autonome Natur des genetischen Schwingungen im Segmentierung Uhr in einer quantitativ direkt studieren. Es ist möglich, die Dynamik der Schwingungen im Fluoreszenzreporter in Hunderten von Zellen, die unter einer Vielzahl von Bedingungen zu messen. Der Beobachtungszeitraum von Einzelzellen in Kultur ist länger als die Periode Somitogenese im intakten Embryo. Wir beobachten, dass eine intakte PSM Explantat in Kultur zeigt auch langsamer Schwingungen als das intakte Embryo (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet that die in isolierten Zellen beobachtet längeren Zeitraum ist nicht einfach bei einem Schaden aus Zerstreuung. Eine variable Periode und Amplitude wird in den meisten unserer Single-Cell-Zeitreihen beobachtet. Die Quelle dieser Variabilität ist nicht bekannt, sollte aber wichtige Details über Tempo-Schaltungen machen die Segmentierung der Uhr zeigen. Mit dieser Methode können wir die genetischen Komponenten der Segmentierung auf der zellulären Ebene, und Fragen, die herausfordernd sind, um in der ganzen Embryo untersuchen zu studieren. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von bekannten Signalmoleküle in den sich entwickelnden Embryo in unseren Kulturen zu finden, können wir ihre Auswirkungen auf die einzelnen PSM zellulären Oszillators in einer robusten und reproduzierbaren Assay zu prüfen. Unsere PSM Kultursystem öffnet die Tür zu einer strengen Bewertung, welche Faktoren allein oder in Kombination zu fördern Schwingungen in diesen Zellen, welche Faktoren diese Schwingungen zu verhindern, und um das Zusammenspiel zwischen solchen Molekülen zu testen. Mit diesen Werkzeugen in der Hand, wollen wirbewerten bestehenden Modelle der Somitogenese veröffentlicht, die auf Gewebe-Level-Daten, sowie die Nutzung Ergebnisse in einzelnen Zellen basieren, um Vorhersagen, die in der ganzen Embryo getestet werden können, zu erzeugen. Nach unserem Wissen ist dies der erste Zebrafisch primären Zellkultur-Protokoll für akute Zeitraffer-Aufnahme der Fluoreszenz in Einzelzellen; Weiterentwicklung und Verfeinerung dieses Protokolls ist kein Zweifel möglich ist. Andere Protokolle verwenden oft Zebrafischembryonen in stabilen Zelllinien, die mit Reporter transfiziert und für die Langzeitabbildungs ​​27-29 verwendet werden kann, zu erzeugen. Während stabile Linien sind nützlich für die Abbildung ein Prozess, der nicht für die Entwicklung Timing, wie der circadianen Uhr gebunden ist, ist die Frage der embryonalen Segmentierung erfordert sofortige Bildgebung während Zellen noch in den oszillierenden, Stammvater Staat. Sobald Zellen stoppen Schwing, nehmen sie eine differenzierte Zelle Schicksal, und als im Gewebe, würde sich in ein Somiten integriert werden. Es ist possible dass mit dem richtigen Faktor oder in vitro vorhanden Faktoren, die wir PSM-wie Zebrafisch-Zellkulturlinien, die Schwingungs bleiben würde, so dass deutlich mehr Zeitbeobachtungen, mehrere aufeinander folgende Störungen oder Hochdurchsatz-Screening erzeugen könnte. Wir erwarten, dass diese Verfahren zur Herstellung von Primärkulturen von dispergierten Zellen für Zeitabbildungs ​​ist gut geeignet für die Untersuchung von jedem zellulären Prozess, der in einer Entwicklungszeitrahmen, die nicht zugänglich Zebrafisch unter Verwendung stabiler Zelllinien auftritt. Die Isolierung der verschiedenen Zelltypen auf unterschiedliche Entwicklungsstadien aus den entsprechenden transgenen Linien Reporter, entweder über Dissektion oder über FACS nach embryonalen Dissoziation, könnte die Ausgangszellen zu liefern. Einige Optimierung der Kulturbedingungen, die embryonalen Ursprungs der Zellen geführt wird, kann erforderlich sein. Durch die Kombination dieser flexiblen und sensiblen Protokoll mit der schnell wachsenden Sammlung von transgenen ZebrafischLinien, hoffen wir, ein in vitro-Ansatz der Entwicklungsbiologie, die komplementär zu klassischen genetischen und embryologischen Methoden ist, zu erleichtern.

Die periodische Bildung von Segmenten entlang der Wirbeltierkörperachse oder Somitogenese, ist ein Beweis für eine räumliche und zeitliche Oszillator im sich entwickelnden Embryo. Die bevorzugte Mechanismus Steuerung Somitogenese ist konzeptionell von einem &quot;Takt-und Wellenfront&quot;-Modell ein, bei dem die &quot;Uhr&quot;, bestehend aus zellulären Oszillatoren jetzt vermutlich intrazellulär durch die rhythmische Expression einer Reihe von Genen zyklischen 2 angetrieben werden, hakt die Bildung beschrieben Somiten von präsomitischen Mesoderm (PSM). Da der Embryo entwickelt, eine Reifung &quot;Wellenfront&quot; in der PSM bewegt sich zusammen mit der Geweberückschritte in Richtung der hinteren, Verlangsamung und verhaften zellulären Oszillatoren, wie es geht 3. Gemeinsam wird diese raumzeitlich dynamischen System die Segmentierung Uhr bezeichnet. Aktuelle Ansätze zur Segmentierung Uhr Spannweite drei zunehmenden Organisation der genetischen Oszillator in einzelnen Zellen auf lokale Kopplung th studierenan tritt zwischen Zellen und schließlich die weltweite Regulierung der Positionsinformationen in der kollektiven PSM Gewebe 4. Frühere Studien legen nahe, die zellautonome Segmentierung Oszillator im Zebrafisch besteht aus Genen und Proteinprodukte aus der ihr / hes factorfamily Transkription, die gedacht werden, um eine negative Rückkopplungsschleife über Transkriptionsrepression 5-7 bilden. Die Delta / Notch-Signalwegs synchronisiert Schwingungen zwischen Nachbarzellen und reguliert die Tarifperiode der Bevölkerung 10.8. In der Schwanzknospe erzeugt Fgf Signalmoleküle scheinen einen Gradienten über die Zebrafisch-PSM zu bauen, und dabei die Hypothese aufgestellt, um zu verlangsamen und zu verhaften oszillierenden Zellen in der vorderen 11 beitragen. Bis jetzt haben die funktionellen Rollen jedes dieser Moleküle in Somitogenese durch genetische Mutation, Morpholino-Injektion, Hitzeschock-Überexpression und-Antagonist Medikament TREA suchttment Uhr von Komponenten und Signalisierung zwischen Zellen 5,7,10,12. Mit Hilfe dieser Störungen hat Segmentierung Uhr-Funktion von Gewebe-Level-Beschreibungen der Somitendefekten und den Verlust der gleichmäßigen Schwingungen in der Expression von Genen wie zyklische her1, her7 und Delta abgeleitet worden C. Doch fast alle diese Daten sind von Embryonen fixiert und nicht zu Veränderungen, was für das dynamische Funktion der Segmentierung Uhr sind genau zu erfassen. In jüngerer Zeit hat mehr Embryo Zeitraffer-Bildgebung die ersten Mutanten mit veränderter Oszillatorperiode offenbart, sondern diese Beobachtungen wurden auch bei der Gewebeniveau 7,13 gemacht. So wurde die Hypothese aufgestellt Verhalten der Zelle autonomen Oszillators während Somitogenese nicht beobachtet. Statische Schnappschüsse von Somitogenese ein unvollständiges Bild, denn von Natur aus, wird der Prozess durch ein schwingfähiges System angetrieben. Frühere Arbeiten in Maus-und Küken-Zellen zeigten, dass das Niveau der Niederschriftund Protein-Aufstieg und Fall, aber Abtasten eines ca. 2 h Schwingung alle 30 oder 45 min beschränkt notwendigerweise die gesammelten Daten und damit die Schlussfolgerungen, die gezogen werden können 14,15. Studium der anderen biologischen Oszillatoren, vor allem, circadiane Uhren, hat sich von inszenierten Messungen von Gen-und Proteinexpression um Echtzeit-Überwachung mit Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter 16,17 bewegt. Diese Instrumente sind wichtig für den Nachweis Uhr Eigenschaften von Einzelzellen 18. Ein Reporter der Biolumineszenz Hes1 zyklischen Gen wurde entwickelt und kurz in einzelnen Zellen der Maus PSM 19 aus. Die Durchschnittsperiode und der Varianz wurden für eine kleine Anzahl von Zellen berechnet wird, zeigt, dass Schwingungen bestehen für mehrere Zyklen in vitro. Allerdings haben diese Studien nicht quantitativ anzugehen, die Stabilität und Robustheit der Oszillator-Frequenz und Amplitude, ob Zellen können spontan betreten oder verlassen Schwingungen,und wie die Zellen behalten ihre Phasenbeziehungen. Zusätzlich können die Effekte von Signalmolekülen in der Embryos auf dem Zell-autonome Uhr wurden nicht direkt getestet. Folglich sind diese grundlegenden Eigenschaften der einzelnen Zelle Oszillator bleiben völlig unbekannt. Wir haben vor kurzem transgene Fische Linien mit BAC Rekombination 20 bis Venus (YFP) Fluoreszenz-Reporter von 30 her1 Ausdruck fahren entwickelt. Solche Leitungen nutzen die regulatorischen Signale des intakten chromosomalen Locus in die sie eingebettet sind, und wiederholen die zeitliche Dynamik und räumlichen Muster der HER1. Dieser Durchbruch ermöglicht die Echtzeit-Überwachung der Gen-Expression in sich entwickelnden Zebrafischembryos in vivo. Um die grundlegenden Eigenschaften von Zell-autonome Schwingungen und wie solche Ausdruck wird über die Zeit geregelt zu studieren, haben wir vor kurzem eine zuverlässige Methode, um von PSM-Zellen in vitro zu isolieren und zu Rekord. Diese Protocol beschreibt, wie wir unsere Reporter transgenen Linien verwendet werden, um verteilte Zellkulturen, aus denen wir die Schwingungen des Zebrafisch-Segmentierung Uhr in einzelne Zellen zu charakterisieren generieren. Wir können damit noch offenen Fragen anzugehen in dem Feld, das nicht zugänglich mit statischen oder Gewebe-Level-Analyse waren, als auch direkt manipulieren die Segmentierung Uhr auf Einzelzellebene mit Signalmolekülen und Inhibitoren.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

Segmentierung ist ein periodischer und sequentielle morphogenetischen Prozess bei Wirbeltieren. Diese rhythmische Bildung von Blöcken aus Gewebe genannt Somiten entlang der Körperachse ist Nachweis einer genetischen Oszillator Strukturieren des sich entwickelnden Embryos. Im Zebrafisch wird die intrazelluläre Uhr fahren Segmentierung der Mitglieder des Her / Hes Transkriptionsfaktor-Familie in den negativen Rückkopplungsschleifen organisiert zusammen. Wir haben kürzlich erzeugten transgenen fluoreszierenden Reporterlinien für die zyklische Gen HER1, die die räumlich-zeitliche Muster der Schwingungen in präsomitischen Mesoderm (PSM) zu rekapitulieren. Mit diesen Zeilen, ein in vitro-Kultursystem, die Echtzeit-Analyse der Segmentierung Uhr Schwingungen innerhalb einzelner, isolierter PSM Zellen erlaubt entwickelten wir. Durch das Entfernen von PSM Gewebe von transgenen Embryos und dann Dispergieren Zellen aus schwing Regionen auf Glasboden Gerichte erzielten wir Kulturen geeignet für Zeitraffer-Bildgebung der Fluoreszenzsignal voneinzelnen Taktzellen. Dieser Ansatz bietet eine experimentelle und konzeptuelle Rahmen für die direkte Manipulation der Segmentierung Uhr mit beispiellosen Einzelzellen-Auflösung, so dass seine zellautonome und Tissue Level-Eigenschaften zu unterscheiden und seziert werden.

Dieses Protokoll produziert von lebensfähigen Kulturen, verteilt, einzelne PSM Zellen für Zeitraffer-Bildgebung der Fluoreszenzsignal (Abbildung 2). Unsere Transgen erzeugt einen Reporter, dessen Kreislauf von Produktion und Abbau erfolgt mit ähnlicher Dynamik zu dem endogenen Gen-und Protein im Embryo, in der Größenordnung von einer halben Stunde. Aufgrund seiner schnellen Umsatz, sollte die YFP-Signal in Einzelzellen schnell erkannt, um die Bleich zu minimieren und mit hoher Zeitauflösung, um die Funktionen der einzelnen Schwingungszyklus zu erfassen. Auch angesichts der relativen Dunkelheit des Signals, Kultur-und Erwerbsbedingungen sind sorgfältig abgestimmt, um empfindliche und robuste Ergebnisse zu gewährleisten. . 1 Ein ECM-Substrat für die Beschichtung der Glasbodenkulturschalen verwendet: Wir haben die folgenden Faktoren bei der Erzeugung optimal PSM Zellkulturen für die Bildgebung wichtig gefunden. 2. Zugabe von Serum auf die Präparation und Abbildungsmedium. 3. Präparation von PSM identifiziert Embryonen nach der Paarung hete genommenrozygous Paare, deren Nachkommen zwei Kopien des Transgens potenziell tragen. 4. Bilderfassung in einem optimalen Vergrößerungsbereich, mit einer höheren NA Ziel, effiziente Erfassung des Fluoreszenzsignals zu gewährleisten. 5. Beleuchtung mit einem Festkörperlichtquelle, um Intensitätsschwankungen, die Hintergrundgeräusche beitragen könnten, minimiert. 6. Signaldetektion mit einem hochempfindlichen EM-CCD-Kamera, um die Signalauslese maximieren. Suboptimale Kulturen Zellen, die nicht in der gesamten Aufnahme bleiben Sie gesund gerundet und enthalten. Wir vermuten, dass unsere ECM-Substrat, ein Fragment von Zebrafisch fibronectin1 hält Zellen in einem undifferenzierten PSM-ähnlichen Zustand, im Vergleich zu anderen häufig verwendeten Substraten wie Poly-Lysin oder Laminin. Andere Substrate, die wir getestet verursacht Zellen auf dem Glas und der Verlust von Schwingungsfluoreszenzsignal im Verlauf der Aufzeichnung zu glätten. Wir fanden auch, dass die Zugabe von Serum in dem Medium während der Dissektion Streuung,und die Aufnahme war nicht nur wichtig, um das Trypsin für die Dissoziation verwendet zu stillen, sondern auch erhöhte Fluoreszenzintensität über Hintergrund, wahrscheinlich aufgrund der verbesserten Zelllebensfähigkeit. Um eine optimale Signalerfassung von einzelnen Zellen zu gewährleisten verwendeten wir eine 40x-Objektiv speziell für Fluoreszenz-Bildgebung (Zeiss-Plan NeoFluor Serie) entwickelt mit einer hohen NA. Wir fanden auch, dass ein Festkörper-Lichtquelle stabiler als herkömmliche Beleuchtung Quecksilberlampen, die kritisch zu Hintergrundschwankungen, die zu verrauschten Bildern beitragen minimieren. Diese Modifikationen sind wichtig, um robuste Ergebnisse zu gewährleisten. Unter Verwendung dieses Protokolls erwarten wir Kulturen, in denen die Mehrzahl der Zellen in einem bestimmten Bereich an einem gewissen Punkt während der Aufzeichnung fluoreszierend. Wir finden, dass fluoreszierende Zellen typischerweise während der Aufnahmen bleiben gerundet und sind manchmal ziemlich beweglich. Einige Zellen, einschließlich fluoreszierenden Zellen können während der Aufnahme apoptotisch. Diese Zellen werden von jedem ein ausgeschlossennalyse. Wir Zellen, die in Kontakt mit anderen Zellen kommen auch ausschließen oder verschieben außerhalb des Sichtfeld. Im Durchschnitt sehen wir eine Reduktion von 12% der Zellzahl pro Halbbild bis zum Ende der 10 h nach Aufnahme durch Zählen der Anzahl von gesunden Zellen in der übertragenen Lichtkanal gemessen. Dieser Verlust beinhaltet sowohl Zelltod und Zellen, die aus dem Feld bewegt haben. Angesichts dieser Vorbehalte können wir im Durchschnitt, Track 5 fluoreszierenden Zellen pro Feld, das lebensfähig und sichtbar bleiben, und in der Regel erfassen 6 Felder pro Zustand. Zum Beispiel wird ein Experiment mit vier Bedingungen haben insgesamt 24 Feldern erworben und in der Regel etwa 30 verfolgt Zellen pro Zustand. Unter Standardaufnahmebedingungen mit L15-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, finden wir, daß PSM-Zellen (n = 101 Zellen aus 4 Experimentwiederholungen) zwischen 2 und 7 Spitzen erzeugen, wobei der Mittelwert und Standardabweichung von 3 ± 1 Spitzen (2 -3 Zyklen). Die mittlere Spitzenzahl, sowie die 25%-Perzentil, 2 Spitzen und das 75%-Perzentil is drei Spitzen. Mit unserem semi-automatische Nachverfolgung und Analyse können wir schnell Fluoreszenzintensität über die Zeit zu generieren Spuren für einzelne PSM-Zellen mit einem in 2C gezeigt Vertreter Zelle Spur. Diese Ausgangs Spuren können dann verwendet werden, um quantitative Messungen der Eigenschaften der Schwingungs PSM Zellen, wie Frequenz, Amplitude, Anzahl der Zyklen und Zeitsteuerung von Spitzen herzustellen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> Abbildung 1. Identifizierung von transgenen Embryos und Schaltpläne der Dissektion. (A) Seitenansicht eines transgenen Zebrafischembryo YFP Fluoreszenz ausdrücken bei ~ 5-Somiten-Stadium. Bild ist eine Überlagerung von Durchlicht-und Fluoreszenzkanal. Pfeile zeigen Bereiche des Signals ausgehend von der Spitze der Schwanzknospen, während PSM Richtung l<html> ast Somiten gebildet. Inset zeigt eine schematische Darstellung des Reporter-Transgen (für weitere Informationen über die Entwicklung und in-vivo-Verhalten finden Sie Soroldoni et al. 30. (B) Schematische Darstellung der Seitenansicht eines Embryos vor der ersten bei der Präparation geschnitten. Punktierte rote Linie zeigt den ersten Schnitt über die Hinterhirn gemacht, obwohl das Eigelb Zelle direkt hinter der Schwanzknospe. (C) Schematische Darstellung der abgeflachten PSM nach der Entfernung des Dotterkörnchen und Epidermis, entlang der anterior-posterioren Achse ausgerichtet. punktierte rote Linie zeigt den zweiten Schnitt, um die Spitze zu entfernen der Schwanzknospe für Zerstreuung und Kultur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Repräsentative Bilder und Spuren aus einer Einzelzelle in einem verteilten PSM Kultur. (A) Montage von Durchlichtbilder aus einer einzigen Zelle PSM in einem 6-h Zeitraffer-Aufnahme. Beachten Sie, dass die Zelle weiterhin gerundet und gesund im Verlauf der Aufzeichnung. (B) entsprechende Montage der Fluoreszenzbilder von einer einzelnen Zelle PSM. Intensitätsspitzen der Zelle im Verlauf der Aufzeichnung gezählt. (C) Durchschnittsintensität über die Zeit von einem ROI auf dieser Zelle angeordnet gemessen. Die Werte werden von jedem Bild aus einem Video mit einer Bildrate von einem pro 2 min mit dem Kreis Interpolator-Plug-in und benutzerdefinierte Makros in Fidschi geschrieben übernommen. Peaks in der Intensität sind wieder in der gesamten Spur nummeriert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenese ist eine rhythmische Entwicklungsprozess, die räumlich Muster die Körperachse von Wirbeltierembryonen. Bisher haben wir transgenen Zebrafischlinien, die fluoreszierenden Reporter nutzen, um die zyklischen Gene, die dieser Prozess vorangetrieben beobachten. Hier wir Kultur verteilt Zellen aus diesen Linien und Bild ihre Schwingungen über die Zeit in vitro.

Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K Aufrufe.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenese ist eine rhythmische Entwicklungsprozess, die räumlich Muster die Körperachse von Wirbeltierembryonen. Bisher haben wir transgenen Zebrafischlinien, die fluoreszierenden Reporter nutzen, um die zyklischen Gene, die dieser Prozess vorangetrieben beobachten. Hier wir Kultur verteilt Zellen aus diesen Linien und Bild ihre Schwingungen über die Zeit in vitro. 

Serie: Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...