Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der enterischen Neurowissenschaft und Magen-Darm-Physiologie zu beantworten, wie, was sind die Mechanismen der Enterochromaffin-Zellerregbarkeit und Reaktion auf luminale Reize, und was sind die Mechanismen der Magen-Darm-Hormon-Freisetzung? Der Hauptvorteil dieser Technik ist es uns, enterochromaffin-Zellen mit einzelligen Techniken wie der Elektrophysiologie im Detail zu untersuchen. Demonstriert wird das Verfahren von den Co-Erstautoren Kaitlyn Knutson und Peter Strege, den herausragenden Technologen, die diese Techniken entwickelt haben.
Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine sechs Milliliter Spritzennadel gefüllt mit eiskaltem PBS in das Lumen des extrahierten Darmsegments. Verwenden Sie die Mikrodissektionszangen, klemmen und versiegeln Sie den Darm um die Spritzennadel und spülen Sie vorsichtig sechs Milliliter PBS durch das Lumen, um fäkalien Stoffe wegzuspülen. Als nächstes invertieren Sie das Darmgewebe, indem Sie die Mikrodissektion sanft durch das Lumen weben, eine Darmwand kneifen und das Gewebe proximal an die Spitze der Zange zurückziehen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Segment von innen nach außen mit dem Lumen nach außen gerichtet ist. Schneiden Sie die Gewebesegmente mit einer Mikrodissektionsschere in ein Zentimeter große Stücke. Dann übertragen Sie die Gewebesegmente in einen 50-Milliliter-Becher, gefüllt mit fünf Millilitern sterilem PBS.
Anschließend die Gewebeteile zu einer verflüssigten Konsistenz zerkleinern. Übertragen Sie das Hackfleisch und 15 Milliliter eiskalte Seiskalte Seiskalte PBS in ein sauberes 50-Milliliter-Rohr. Trituieren Sie zweimal mit der Transferpipette.
Warten Sie, bis sich das Gewebe absetzt. Entfernen Sie anschließend 15 Milliliter des PBS-Überstands und ersetzen Sie ihn durch frische PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, bis die PBS klar ist.
Für die erste Verdauung, aus dem Wasserbad, holen Sie sich eine der 50-Milliliter-Röhren mit 10 Milliliter vorgewärmten Verdauungsmedien. Als nächstes fügen Sie 250 Mikroliter der PBS-Kollagenase-Lösung in die Röhre mit den gehackten Darmstücken hinzu. Schließlich wurden den Verdauungsmedien und der PBS-Kollagenaselösung gehackte Darmgewebestücke zugesetzt.
Dann legen Sie die Probe in einem Wasserbad für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Das Gewebe einmal mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette langsam titerieren und die Gewebestücke kurz absetzen lassen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um 10 Milliliter des Überstandes zu entfernen.
Für die zweite Verdauung 250 Mikroliter der PBS-Kollagenaselösung in das Gewebe geben und bei 37 Grad Celsius in ein Wasserbad geben. Anschließend die Lösung einmal mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette langsam titerieren. Dann entfernen Sie 10 Milliliter des Überstandes.
Für die dritte Verdauung 250 Mikroliter der PBS-Kollagenaselösung in die Röhre geben. Legen Sie es 10 Minuten lang in ein 37-Grad-Wasserbad. Dann schütteln Sie die Röhre zwei bis drei Mal pro Minute bei einer höheren Intensität als Verdauungen eins und zwei.
Anschließend das Gewebe langsam mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette nach oben und unten pipette und die Gewebestücke kurzzeitig abgleichen lassen. 10 Milliliter des Überstandes in eine neue 15-Milliliter-Röhre geben. Fügen Sie zwei Milliliter erwärmte EC-Zelle komplette Kulturmedien und einmal umkehren, um zu mischen.
Als nächstes drehen Sie die Probe bei 100 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach fünf Minuten den Überstand entfernen und das verbleibende Pellet in 2,5 Millilitern erwärmter EC-Zelle vollständiger Kulturmedien wieder aufhängen. Für die vierte Verdauung, wiederholen Sie die Verdauungsverfahren, aber erhöhen Sie die Inkubationszeit um 15 Minuten für Dickdarm, und bleiben bei 10 Minuten für Jejunum.
Um die Zellen zu kultitomieren, verwenden Sie eine Transferpipette, um die aus den Verdauungsuntersuchungen drei und vier gesammelten Zellsuspensionen in einem neuen 15-Milliliter-Rohr zu kombinieren. Entfernen Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot von Zellen und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Drehen Sie dann die verbleibende Zellsuspension bei 100 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand und fügen Sie EC-Zellen-Komplettkulturmedien mit einer 5-Milliliter-Serologischen Pipette mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter hinzu. Das Gewebe mit einer Transferpipette wieder aufhängen. Anschließend die beschichteten Glasboden-Kulturgerichte aus dem Brutkasten entfernen.
Ersetzen Sie mit einer P1000 Pipette die extrazelluläre Matrix aus jeder Kulturschale durch 250 Mikroliter der endgültigen Zellsuspension. Um ein ganzes Zellgaseal zu erreichen, senken Sie die Elektrode in die Badlösung. Mit dem Mikromanipulator die Elektrodenspitze in der Ebene mit und direkt horizontal aus der Zelle manövrieren.
Dann 0,2 Milliliter Luft aus der Spritze vertreiben. Bewegen Sie die Elektrode vorsichtig horizontal entlang der X-Achse, um die Zelle zu berühren. Achten Sie darauf, dass ein Dimple auf der EC-Zelle erscheint und die Membranbeständigkeit bei den Dichtungstests erhöht wird.
0,1 bis 0,2 Milliliter Saugkraft auf die Spritze auftragen und den Kolben stabil halten, bis 100 Mega-Ohm erreicht sind. Dann lassen Sie den Griff aus dem Kolben. Warten Sie, bis die Zelle gigaseal.
Trennen Sie dann die Spritze vorsichtig. Um den ganzzelligen spannungsverzierbaren Natriumstrom aufzuzeichnen, wenden Sie einen schnellen Absaugvorgang auf eine Spritze an. Wiederholen Sie dies, bis der gesamte Zellzugriff erreicht ist, bevor die Spritze vorsichtig getrennt wird.
Schalten Sie als Nächstes die gesamte Zellkapazitätskompensation ein und passen Sie die Kapazität und den Serienwiderstand an. Schalten Sie die Widerstandskompensation der Serie ein. Bei einer Verzögerung von 60 Mikrosekunden stellen Sie die Widerstandskompensation der Serie ein und schließen Sie den Dichtungstest.
Zeichnen Sie durchschnittlich fünf Durchläufe von Ganzzell-Spannungs-Gate-Natriumstrom auf. Notieren Sie sich schnell zwei Parameter des spannungsgebundenen Natriumstroms: die Spannung am Fensterstrom und die Spitzen-Natriumstromdichte. Um die ausgelösten Aktionspotentiale aufzuzeichnen, schalten Sie den Modus von der Spannungsklemme auf die Stromklemme um.
Laden Sie das episodische Stromklemmenprotokoll. Passen Sie hier den Haltestrom auf Null picoamp an und aktivieren Sie den externen Befehl. Zeichnen Sie die ausgelösten Aktionspotenziale auf.
Beachten Sie die geringste Menge an Strom, die injiziert wird, um ein Aktionspotenzial abzufeuern. Um spontane Aktionspotenziale aufzuzeichnen, deaktivieren Sie den externen Befehl. Laden Sie ein lückenloses Stromklemmenprotokoll.
Ändern Sie den Haltestrom in die Menge des Stroms, der im letzten Sweep des ausgelösten Protokolls eingespritzt wurde und das kein Aktionspotenzial ausgelöst hat. Aktivieren Sie anschließend den externen Befehl. Überprüfen Sie, ob der vorhergesagte Haltestrom das Membranpotenzial unterhalb der Schwelle bringt, um ein Aktionspotenzial abzufeuern.
Passen Sie ggf. den Haltestrom an und zeichnen Sie die spontane Aktivität auf. Kulturen, die für die Elektrophysiologie optimiert wurden, bestanden aus Einzelzellen und kleinen Klumpen mit hellem CFP-Signal. Wenn die Kulturbedingungen nicht optimiert wurden, bestand die Epithelzellkultur aus großen Klumpen, schwimmenden Zellablagerungen, beschädigten Membranen und schwachem CFP-Signal in den EC-Zellen.
EC-Vollzellen wurden bei 30 plus oder minus 7% der Versuche aus Doppelpunktkulturen und 41 plus oder minus 3% der Versuche aus der Jejunumkultur erhalten. Bei der gesamten Zellelektrophysiologie wurden Natriumströme von 81,3 plus oder minus 4,0% der TPH-1 CPF-positiven Zellen aus Jejunum und 64,1 plus oder minus 9,2% von ihnen aus dem Dickdarm aufgezeichnet. Von 59 EC-Zellen aus Jejunumkulturen feuerten 19 EC-Zellen im aktuellen Klemmmodus spontan AP aus, 29 EC-Zellen feuerten AP nur ab, wenn sie durch ein Schrittprotokoll im aktuellen Klemmmodus ausgelöst wurden, und 11 EC-Zellen feuerten AP weder spontan noch durch Schrittprotokoll ab.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das optimale Verdauungsprotokoll für primäre Epithelkulturen zwischen den Anwendungen variabel sein kann, daher ist es wichtig, die optimale Menge an Agitation zu bestimmen, um einzelne Zellen zu erhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie Einzelzell-PCR und Fluoreszenz, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. was Enterochromaffinzellen ausdrücken und wie Reize an interzelluläre Signalisierung gekoppelt sind. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschungen in der Magen-Darm-Physiologie zu erforschen, wie Enterochromaffin-Zellen arbeiten und wie sie magenintestinale Motilität und Sekretion bei Mäusen regulieren.
