Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (F32 NS059120 zu RLM und R01NS25217 und P30NS048154 zu ABR) unterstützt.

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die elektrische und morphologische Charakterisierung von sensorischen und motorischen Neuronen von Zebrabärbling Embryonen nach minimaler Zerlegung des Rückenmarks. Neurone bleibt für mindestens 1 h gesund, die Frist auf diesen Aufnahmen auferlegt. Neurone wurden unter Verwendung der Standard Gesamtzellkonfiguration aufgezeichnet, sowie von nukleierten Patches; Das letztere Verfahren minimiert Raum-clamp - Probleme , die eine detaillierte Untersuchung der biophysikalischen lonenströme 9 ausschließen können. Eine wichtige Herausforderung besteht darin, die feste Bindung des Embryos oder Larve in die Kammer zu erreichen, um die Haut zu entfernen und die begrenzte Dissektion auszuführen erforderlichen Zugang zu den Neuronen von Interesse bereitzustellen. Die Zubereitung muss auch für das Ganzzell-Patch-Clamp-Verfahren auf die Aufzeichnungskammer richtig gesichert werden. Ein Verfahren, das diese Aufgabe durch die Verwendung von Tierarztes Nahtkleber erfüllt den Embryo oder Larve zu befestigen, umDie Dissektion / Aufnahmekammer ist hier beschrieben, ein Ansatz, der für das Aufschneiden der anderen Modellorganismen (zB Drosophila) 63 verwendet wurde. Aus unserer Erfahrung die Ausbildung anderer, finden wir, dass der wichtigste Schritt zu meistern die kontrollierte und präzise Lieferung von kleinen Mengen an Klebstoff ist. Hier wird eine Klebstoffspendervorrichtung, die ein Benutzer Druck anzuwenden negativen und positiven ermöglicht Leim laden in der oder aus der Spitze einer Mikropipette auszustoßen, wird diskutiert. Unter Verwendung des Nahtkleber, Embryonen und Larven können fest an der Kammer angebracht werden, und entweder dorsal-orientierten Seite nach oben oder seitlich. Auf diese Weise sind verschiedene Zugriffsmöglichkeiten für eine Vielzahl von Neuronen zur Verfügung. Auch kann die Schicht aus Silikonelastomer auf dem Kammerboden sein, auch dünner als der 1 mm hier angegebenen Bereitstellen Potential optische Vorteile. Ein anderes Verfahren, häufiger die Vorbereitung auf eine Aufzeichnungskammer zu befestigen, beinhaltet die Verwendung von feinen Wolframstiften 1 &lt;sup&gt;, 2, 3, 4, 5. Während das Verfahren unterscheiden, erlauben sowohl elektro Zugang zu Zebrabärbling Wirbelsäulenneuronen, Forscher mit Optionen ergab, die auf der Grundlage der Ziele und Herausforderungen des Experiments ausgewählt werden können. Die hier beschriebene Zubereitung Zebrabärbling ermöglicht die elektrische und morphologische Untersuchung von spinalen Neuronen in situ während der frühesten Stadien der Differenzierung. Durch die von spinalen Neuronen Aufzeichnung unter Verwendung dieser Verfahren, haben wir einen Einblick in die zellulären Effekte von mehreren Mutationen gewonnen, auch vor der Identifizierung des Gens läsionierten 6, 64, 65.

<html> George Streisinger Pionier bei der Verwendung von Danio rerio, das gemeinhin als Zebrabärbling bekannt, als Modellsystem für die genetische Analyse von Wirbel Entwicklung 10. Das Modell bietet mehrere Vorteile, einschließlich: (1) relativ einfach und kostengünstig Tierhaltung; (2) externe Befruchtung, die einen leichten Zugang zu Embryonen von den frühesten Entwicklungsstadien; und (3) ein transparentes Embryo ermöglicht direkte und wiederholte Beobachtungen von Zellen, Geweben und Organen, wie sie bilden. In den folgenden Jahrzehnten stiegen einige Fortschritte weiter die Leistung des Zebrabärbling-Modells. Insbesondere Vorwärts genetischen Screens und Sequenzierung des gesamten Genoms Bemühungen kritischen Schlüsselrollen bei der Identifizierung von Mutationen und Gene gespielt zu vielen Entwicklungsprozesse 11, 12, 13, 14,„&gt; 15, 16. Gateway - Klonierungsverfahren die Routineanwendung von transgenen erlaubt haben Ansätze 17, 18. Die jüngsten Fortschritte in der Genombearbeitung, beispielhaft dargestellt durch Transkriptionsaktivator-like (TALENS) und gruppierten regelmäßig voneinander beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -Cas9 Nukleasen, ermöglicht die gezielte Einführung von Mutationen sowie Knock-out und knock-in Ansätzen 19, 20, 21, 22. Combined, diese Methoden Zebrabärbling machen ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der genetischen Mechanismen , bestimmte Verhaltensweisen und mehrere menschliche Krankheiten zugrunde liegen 23, 24, 25, 26, 27. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung vonpsychische Regulierung und die Rolle der elektrischen Aktivität in neuronalen Entwicklung. Der Schwerpunkt liegt auf dem Rückenmark, für die das Modell Zebrabärbling mehr Vorteile bietet. Erstens ist es relativ einfach, Zebrabärbling an embryonalen und Larvenstadien zuzugreifen; Daher kann eine Rückenmarksfunktion während der Entwicklungsstadien untersuchen , die weniger Neuronen und einfachere Schaltungsanordnung 28, 29 haben. Darüber hinaus hat die Zebrabärbling Rückenmark eine vielfältige Gruppe von Neuronen, ähnlich wie bei anderen Wirbeltieren, als Faktoren , 30, 31, 32, 33, 34, 35 und durch charakteristische Unterscheidungsmuster der Transkription nachgewiesen. Die meisten Studien in Zebrabärbling, das die Mechanismen aufzudecken darauf abzielen, die die Funktion von Rückenmarksschaltungen zugrunde liegen, vor allemdiejenigen , die Fortbewegung, sind verständlicherweise konzentrieren sich auf Larvenstadien 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 unterstützen. Allerdings sind viele der Neuronen, die das Rücken Lokomotive Netzwerken initiieren ihre Differenzierung in frühen Embryonalstadium, ~ 9-10 h nach der Befruchtung (hpf) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 bilden. Im Hinblick darauf, das Verständnis, wie die morphologischen und elektrischen Eigenschaften von spinalen Neuronen entstehen und Wechsel zwischen den embryonalen und Larvenstadien ist wichtig für eine Marktpreisefürll Verständnis der lokomotorischen Schaltungsbildung und -funktion. Die Dissektion hier beschriebenen Methoden erlauben Patch-Clamp-Aufnahmen von spinalen Neuronen und haben an embryonalen Stadien (~ 17-48 HPF) und Larvenstadien (~ 3-7 Tage nach der Befruchtung [dpf]) erfolgreich angewandt worden. Dieser Ansatz begrenzt die Menge der Dissektion erforderlich, um Zugang zu den Neuronen von Interesse bereitzustellen. Das Protokoll unterscheidet mich von der Mehrzahl der anderen veröffentlichten Verfahren für in Tierarzt dieses Naht Leim aus Zebrabärbling spinalen Neuronen Aufzeichnung verwendet wird, sondern als ein feiner Wolframstift, den Embryo oder Larve auf die Aufzeichnungskammer zu befestigen. Die Verfügbarkeit von zwei unterschiedlichen Ansätzen (dh Naht Klebstoff gegenüber dem Wolframstift) für die Zebrabärblingembryonen oder Larven für elektrophysiologische Analyse Montage bietet Forscher mit alternativen Optionen ihre spezifischen experimentellen Ziele zu erreichen. Als erstes Verfahren für den Zugriff auf und die Aufnahme von einem Pop<html> ulation von primären sensorischen Neuronen, Rohon Beard-Zellen, beschrieben. Die Zellkörper dieser Neuronen liegen im dorsalen Rückenmark. Rohon-Beard - Zellen existieren in zahlreichen Wirbeltierarten unterscheiden früh in der Entwicklung, und liegen unter der embryonalen Touch - Reaktion 6, 44, 47, 48. Zweitens Verfahren für den Zugriff auf und die Aufnahme von spinalen motorischen Neuronen sind detailliert. Zebrafisch-spinale motorische Neuronen entstehen während zwei Wellen des Neurogenese. Die früheren geborenen primären motorischen Neuronen entstehen am Ende der Gastrulation (~ 9-16 HPF), mit nur 3-4 primären motorischen Neuronen , die pro hemisegment 45, 46, 49. Im Gegensatz dazu ist die später geborene Bevölkerung von sekundären motorischen Neuronen zahlreicher und stellt sich während eines längeren Zeitraums, beginnend bei ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. Secondary Motoneuron Genese Mitte trunk Segmente meistens von 51 HPF 50. Secondary motorischen Neuronen sind als abgeschlossen ist das Gegenstück von Motoneuronen in amniotes 46 sein. Interessanterweise supraspinalen Neuronen über Dopamin, regulieren Lokomotion in der Larve und sekundären Motoneuron Genese im Embryo und junge 50 Larve, 51. primäre und sekundäre Motorneuronen umfassen , die jeweils mehrere verschiedene Subtypen. jeder primäre Motoneuron - Subtyps projiziert einen peripheren Axonen , die eine charakteristische Muskelgruppe innerviert, in einer stereotypen führt, axonalen Trajektorie identifiziert. im Allgemeinen sekundäre Motorneuronen die axonale Wege zuvor eingesetzten primären motorischen Neuronen folgen. Somit wird mit Bezug auf die axonale Trajektorien, primäre und sekundäre Motorneuronen sind ähnlich, mit der Ausnahme, dass axonale Dicke und Größe a somatawieder größer für die primären Motorneuronen 45. Drittens Methoden für die Aufzeichnung von einigen Arten von Inter diskutiert. In diesen Fällen ist jedoch eine begrenzte Menge an Entfernung anderer Rückenmarkszellen erforderlich ist, und damit das Rückenmark ist weniger intakt als bei Aufnahmen von Rohon Beard-Zellen oder motorischen Neuronen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Zebrafisch, zunächst als Entwicklungsmodell eingeführt hat an Popularität gewinnt in vielen anderen Bereichen. Die Leichtigkeit der Aufzucht einer großen Anzahl von sich rasch entwickelnden Organismen, mit der embryonalen optische Klarheit kombiniert, diente als Ausgangs zwingenden Attribute dieses Modells. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Erfolg dieses Modells weiter durch seine Ansprechbarkeit auf groß angelegte Mutagenese-Bildschirme und durch die Leichtigkeit der Transgene angetrieben worden. In jüngster Zeit haben Gen-Editing Ansätze, um die Leistung des Modells erweitert. Für Studien der neurologischen Entwicklung der Larve Zebrafischembryo und liefern ein Modell, an dem mehrere Methoden angewendet werden können. Hier konzentrieren wir uns auf Methoden, die die Studie einer wesentlichen Eigenschaft von Neuronen, elektrische Erregbarkeit ermöglichen. Unsere Vorbereitung für die elektrophysiologische Untersuchung von Zebrabärbling spinalen Neuronen beinhaltet die Verwendung von Tierarzt Naht Kleber, um die Vorbereitung auf eine Aufzeichnungskammer zu sichern. Alternative Methoden zur Aufzeichnungvon Zebrabärbling - Embryonen und Larven betreffen die Befestigung des Präparates an die Kammer eine feine Wolframstift 1, 2, 3, 4, 5 verwendet wird . Ein Wolframstift wird am häufigsten verwendet , um die Zubereitung in einer seitlichen Orientierung zu montieren, obwohl sie verwendet wurde Larve dorsale Seite nach oben 4 zu montieren. Der Naht Leim verwendet worden Embryonen und Larven in beiden Orientierungen zu montieren. Unter Verwendung des Klebers kann eine minimale Dissektion durchgeführt werden, die den Zugang zu spinalen Neuronen ohne die Verwendung einer enzymatischen Behandlung, um dadurch eventuelle Schäden zu vermeiden. Doch für die Larven, ist es notwendig, eine kurze Enzymbehandlung anzuwenden, um das Muskelgewebe rund um das Rückenmark zu entfernen. Die hier beschriebenen Methoden sind verwendet worden, die intrinsischen elektrischen Eigenschaften von Motorneuronen, Inter und sensorischen Neuronen an mehreren developmenta zu studierenl Stufen 6, 7, 8, 9.

Wir haben erfolgreich von Rohon Beard-Neuronen in 17 hpf Embryonen bis 7 dpf Larven (5A und 5B) aufgezeichnet. Wenn Rohon Beard-Zellen aufgenommen wurden, wurde die Zubereitung montiert dorsal-Seite nach oben. Eine solche Montage ermöglicht die eindeutige Identifizierung von Rohon-Beard auf ihrer oberflächlichen dorsalen Positionen und große Größen soma Zellen basieren. Die Identifizierung wird durch das stereotypisch hyperpolarisiertem Ruhemembranpotential dieser Neuronen (Figur 5, Tabelle Inset) 6, 54 zusätzlich bestätigt. Außerdem ist, wie primäre sensorische Neuronen fehlen Rohon-Beard Neuronen synaptischen Input. Daher wird in der Abwesenheit von elektrischer Stimulation, sollten keine Änderungen im Membranpotential auftreten , während in der Strom-Clamp - Modus (5B‘) aufgezeichnet wird . Da die ersten Aufnahmen von Rohon-Beard-Zellen in Zebrabärbling wurden durchgeführt &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 6, verschiedene transgene Linien (zB Tg (islet2b: gfp), Tg (NGN: gfp) und Tg (isletss: gfp)) erzeugt wurden , die fluoreszierenden Reportern in diesen Neuronen exprimieren, weiter zu erleichtern ihre Identifikation 55, 56, 57. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig5.jpg" /> Abbildung 5: Whole-cell Spannungs- und Strom-clamp - Aufnahmen aus Rohon Beard-Neuronen in 1 und 2 dpf Embryonen und 7 dpf Larven. (A) Voltage-Clamp - Aufnahmen von nach außen und nach innen gerichtete Ströme wurden von Rohon Beard-Neuronen in 1- (dünne schwarze Linie) erhalten, 2- (dicke schwarze Linie), und 7-dpf (graue Linie) Embryonen / Larven. Das Haltepotential betrug -80 mV und die Ströme wurden durch einen depolarisierenden Schritt auf +20 mV hervorgerufen. (B) Einzelaktionspotentiale werden durch kurzen (1 ms) Strom ausgelöstInjektionen (~ 0,35 nA) zu Rohon-Beard Neuronen von 1- (dünne schwarze Linie), 2- (dicke schwarze Linie), und 7-dpf (graue Linie) Embryonen / Larven. (B‘) in der Abwesenheit von elektrischer Stimulation, keine Änderungen im Membranpotential, wie beispielsweise spontan Depolarisationen postsynaptischen treten in Rohon Beard-Neuronen. Der Einschub Tabelle sind die Werte von Rohon Beard-Neuronen von 1- aufgezeichnet Membranpotentialen ruhend (n = 21) und 2- (n = 9) dpf Embryonen und 7- (n = 7) dpf Larven. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Transgene Linien, die eindeutige Identifizierung von anderen Subtypen spinal Neurons ermöglichen sind ebenfalls erhältlich. Unter diesen sind die mnx1 transgene Linie Tg: exprimiert (mnx1 gfp) grün fluoreszierendes Protein (GFP) in einer Untergruppe von spinalen motorischen Neuronen bald nach ihrer Spezifikation (~ 14-16 HPF) &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 58, 59. Aufgrund der Positionierung der stereotypisch primären motorischen Neuronen innerhalb jeder hemisegment (6A) zusammen mit der Expression von GFP in den mnx1 transgenen, ist es möglich , die verschiedenen primäre Motoneuron - Subtypen (6B und 6C) zu identifizieren. Einen fluoreszierenden Farbstoff in der Aufzeichnungselektrode Lösung einschließlich ermöglicht die Visualisierung von axonalen Trajektorien, zusätzliche Bestätigung der Motoneuron Identität bereitstellt, da einige Inter auch gfp in der Tg (mnx1: gfp) Eillinie. Alternativ kann eine weitere transgene Linie, die die Identifizierung von motorischen Neuronen ermöglicht , ist die Leitung 60 ET2. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig6.jpg" /> Abbildung 6: Whole-cell Spannung und Strom-Clamp - Aufnahmen von motorischen Neuronen von 1 dpf Zebrabärbling embryo. (A) Eine Karikatur zeigt die spezifischen morphologischen Merkmale der primären Motoneuron - Subtypen , die in der Zebrabärbling Rückenmark. Primären motorischen Neuronen werden durch die Position ihres Soma innerhalb eines Segments (dh rostral [RoP], medial [MiP] oder kaudalen [CaP]) 45 identifiziert. Darüber hinaus erstreckt sich jeder Subtyp ein Axon an die Peripherie über einen unterschiedlichen Weg. Die kombinierte Verwendung der Tg (mnx1: gfp) -Leitung und Farbstoffmarkierung zeigt die axonale stereotypisch Dorn und die Identität des Motoneuron - Subtyps während einer Aufnahme. Mit den hier vorgestellten Methoden ist es möglich, Datensatz aus drei verschiedenen Primärmotoneuron-Subtypen innerhalb desselben hemisegment, um sequentiell. (B) Voltage-clamp - Aufnahmen gezeigt , die aus ROP MiP erhalten wurden, und CaP, alle in einem einzigen hemisegment. Ein Spannungs Schritt auf +20 mV wurde verwendet, Strom von einem Haltepotential von -80 mV hervorzurufen. (C) Während der Strom-Clamp - recordings von ROP MiP und CaP, kurzem (1 ms, ~ 0,4 nA) wurden Strominjektionen angelegt, um ein Aktionspotential auslösen. Das Membranpotential wurde bei ~ -65 mV gehalten. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ein Hauptunterschied zwischen dem primären und sekundären Motoneuronen ist die größere somata der früheren geborene Neuronen. Jedoch sind sekundäre Motoneuron-Subtypen von Soma Größe oder Position nicht erkennbar. Für Aufnahmen von bestimmten sekundären Motoneuronen, zwei transgenen Linien, Tg (GATA2: gfp) und Tg (islet1: gfp), wurden zur Identifizierung von sekundären motorischen Neuronen mit ventral und dorsal Projizieren Axone bzw. 55, 61 verwendet. Jedoch ist ein drittes Sekundärmotoneuron-Subtyps in der Zebrabärbling Rückenmark, mit axons dieses Projekt dorsal und ventral 62. Dementsprechend kann Farbstoff verwendet werden , während der Aufnahmen sekundär Motorneuronen zu füllen Subtypen auf der Grundlage der Morphologie (7A) 8, 9 zu identifizieren. Oft werden während der Spannungsklemme (7B, Sternchen) oder Current-Clamp - Aufnahmen (7C und 7C‘, Pfeilspitzen) von sekundären motorischen Neuronen, spontan oder synaptischen Ereignisse aufgezeichnet. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig7.jpg" /> Abbildung 7: Whole-cell Spannung und Strom-Clamp - Aufnahmen von sekundären motorischen Neuronen von 2 dpf Embryonen. (A) In der Tg (GATA2: gfp) -Leitung, zwei verschiedene sekundären Motoneuron - Subtypen exprimieren gfp 62. In dem linken hemisegment eine ventrale sekundäre Motoneuron(Stern und Pfeil zeigen soma und Axon, respectively). In dem benachbarten hemisegment, auf dem rechten Seite (caudal), gibt es eine ventral / dorsal sekundäre Motoneuron (Stern zeigt soma; Pfeile zeigen die beiden Axone, eine vorstehenden ventral [unteren Pfeil] und die anderen dorsal [top Pfeil]). Diese Neuronen wurden mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff während der Aufnahmen versehen. Zur Identifizierung von ventral / dorsal sekundäre Motorneuronen, ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass die Dissektion entfernt nicht Muskel in dem benachbarten caudal hemisegment, wodurch eine Beschädigung oder Entfernung der dorsalen Axon. Nach der Aufzeichnung bleibt das Neuron Soma zu der Mikropipette befestigt , wie es von der Zubereitung (rechts oben Sternchen) gezogen wird. Wenn Farbstoffe verwendet Neuronen während der Aufnahmen zu füllen, leckt der Farbstoff oft während der Elektrode in dem Bad ist, in einem roten fluoreszierenden Hintergrund resultierenden sichtbar im Rückenmark und die Chorda dorsalis (unten Sternchen in rostral [Links] hemisegment &lt;<html> / Em&gt;). (B) Voltage-clamp - Aufnahmen wurden von ventral erhalten und ventral / dorsal sekundären Motorneuronen. Spannungsstufen (bis -30, -10, +10, +30, +50, +70, +90 und +110 mV) hervorgerufen äußeren und inneren Ströme. Geklemmten Aktionspotentiale / Depolarisationen können in den Aufnahmen (Sternchen) vorhanden sein. (C) Während der Strom-Clamp - Aufnahmen von sekundären motorischen Neuronen, kurzer (1 ms) Strominjektionen von steigender Amplitude an die Neuronen wurden angelegt , um ein Aktionspotential auslösen (Sternchen). (C‘) Beispiele für einzelne Aktionspotentiale in ausgelöst sekundären Motoneuronen durch ~ 0,4 nA-Strominjektionen sind gezeigt. In diesem Stadium sind spontane Aktionspotentiale beobachtet (C und C‘, Pfeilspitzen). (D) Längerer (100 ms) Strominjektionen (~ 0,35 nA) lösen die repetitiven Abfeuern von Aktionspotentialen. Das Membranpotential wurde bei ~ -65 mV gehalten.Last / 55507 / 55507fig7large.jpg“target =‚_ blank‘&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

11.4K Aufrufe.  University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC).  Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien. 

Serie: Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...