Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH (NS059120 F32 per RLM e R01NS25217 e P30NS048154 a ABR).

Gli autori dichiarano alcun interesse finanziario in competizione.

I metodi qui descritti consentono la caratterizzazione elettrica e morfologica dei neuroni sensoriali e motori di embrioni zebrafish dopo minima dissezione del midollo spinale. Neuroni restano sani per almeno 1 h, il limite di tempo imposto su queste registrazioni. I neuroni sono stati registrati utilizzando la configurazione a cellula intera serie, così come da patch nucleate; quest&#39;ultimo metodo minimizza problemi di spazio-clamp che può precludere uno studio biofisico dettagliato delle correnti ioniche 9. Una sfida importante è ottenere il fermo attaccamento dell&#39;embrione o larva alla camera al fine di rimuovere la pelle e per eseguire la dissezione limitate richieste per fornire l&#39;accesso ai neuroni di interesse. La preparazione ha anche bisogno di essere adeguatamente fissato alla camera di registrazione per le cellule intere metodi patch-clamp. Un metodo che risponde a questa sfida mediante l&#39;uso di colla veterinario sutura per fissare l&#39;embrione o larva dila camera di dissezione / registrazione viene qui descritto, un approccio che è stata usata per la dissezione di altri organismi modello (ad esempio, Drosophila) 63. Dalla nostra esperienza di formazione altri, troviamo che la fase più critica per padroneggiare è la consegna controllata e precisa di piccole quantità di colla. Qui, un dispositivo erogatore di collante che consente all&#39;utente di applicare pressione negativa e positiva per caricare colla in o espellerla dalla punta di una micropipetta è discusso. Utilizzando la colla sutura, embrioni e larve possono essere saldamente fissati alla camera ed orientati entrambi dorsale rivolta verso l&#39;alto o lateralmente. In questo modo, diverse opzioni di accesso per una varietà di neuroni sono disponibili. Inoltre, lo strato di elastomero siliconico sul fondo della camera può essere ancora più sottile di 1 mm qui specificati, forniscono vantaggi potenziali ottici. Un altro metodo, più comunemente usato per fissare la preparazione di una camera di registrazione, prevede l&#39;utilizzo di perni di tungsteno sottili 1 &lt;sup&gt;, 2, 3, 4, 5. Mentre che i metodi sono diversi, entrambi permettono l&#39;accesso elettrofisiologico ai neuroni spinali zebrafish, offrendo i ricercatori con le opzioni che possono essere selezionati in base agli obiettivi e le sfide dell&#39;esperimento. La preparazione zebrafish qui descritto permette di studiare elettrica e morfologico dei neuroni spinali in situ durante le prime fasi di differenziazione. Registrando dai neuroni spinali utilizzando questi metodi, abbiamo acquisito conoscenza sugli effetti cellulari di diverse mutazioni, anche prima della identificazione del gene lesionata 6, 64, 65.

<html> George Streisinger aperto la strada all&#39;uso di Danio rerio, comunemente noto come pesce zebra, come sistema modello per l&#39;analisi genetica di sviluppo dei vertebrati 10. Il modello offre diversi vantaggi tra cui: (1) relativamente semplice e poco costoso zootecnia; (2) fecondazione esterna, consente un facile accesso alle embrioni dalle prime fasi di sviluppo; e (3) un embrione trasparente, permettendo osservazioni dirette e ripetute di cellule, tessuti e organi in quanto costituiscono. Nel corso dei decenni successivi, numerosi miglioramenti aumentato ulteriormente la potenza del modello di zebrafish. In particolare, gli schermi genetici avanti e sforzi sequenziamento dell&#39;intero genoma giocato un ruolo chiave nella identificazione di mutazioni e geni critici per molti processi di sviluppo 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, 16 metodi di clonazione. Gateway hanno permesso l&#39;applicazione di routine di transgenico si avvicina a 17, 18. I recenti progressi nella modifica del genoma, esemplificato dalla trascrizione attivatore-simile (Talens) e cluster regolarmente intervallati ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) -Cas9 nucleasi, consentire l&#39;introduzione mirata di mutazioni, così come knock-out e knock-in si avvicina 19, 20, 21, 22. combinata, questi metodi fanno zebrafish un potente modello per lo studio dei meccanismi genetici sottostanti specifici comportamenti e diverse malattie umane 23, 24, 25, 26, 27. Questo lavoro si concentra su svilupporegolazione mentale e il ruolo dell&#39;attività elettrica nello sviluppo neuronale. L&#39;attenzione è sul midollo spinale, per cui il modello zebrafish fornisce diversi vantaggi. In primo luogo, è relativamente facile accedere zebrafish nelle fasi embrionali e larvali; Pertanto, si può studiare la funzione del midollo spinale durante fasi di sviluppo che hanno meno neuroni e semplice circuiteria 28, 29. Inoltre, il midollo spinale zebrafish ha un diverso insieme di neuroni, simile ad altri vertebrati, come dimostrato dai modelli caratteristici e distintivi di fattori di trascrizione 30, 31, 32, 33, 34, 35. La maggior parte degli studi in zebrafish che mirano a scoprire i meccanismi che stanno alla base del funzionamento dei circuiti del midollo spinale, specialmentequelli che supportano locomozione, sono comprensibilmente focalizzati su stadi larvali 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Tuttavia, molti dei neuroni che formano le reti locomotiva spinali iniziato la loro differenziazione nelle fasi embrionali, ~ 9-10 ore dopo la fecondazione (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. In considerazione di ciò, comprendere come le proprietà morfologiche ed elettriche dei neuroni spinali sorgono e cambiamento tra gli stadi embrionali e larvali è importante per un overall comprensione della formazione circuito motorio e funzione. I metodi di dissezione qui descritti permettono registrazioni di patch clamp da neuroni spinali e sono stati applicati con successo nelle fasi embrionali (~ 17-48 HPF) e stadi larvali (~ 3-7 giorni dopo la fecondazione [dpf]). Questo approccio limita la quantità di dissezione necessaria per fornire l&#39;accesso ai neuroni di interesse. Il protocollo differisce dalla maggior parte degli altri metodi pubblicati per la registrazione da neuroni spinali zebrafish a che la colla veterinario sutura viene utilizzata, anziché un perno di tungsteno fine, per fissare l&#39;embrione o larva alla camera di registrazione. La disponibilità di due approcci differenti (cioè, colla sutura rispetto al perno tungsteno) per il montaggio delle zebrafish embrioni o larve per l&#39;analisi elettrofisiologica fornisce ai ricercatori opzioni alternative per raggiungere i loro obiettivi sperimentali specifiche. In primo luogo, le procedure per l&#39;accesso e la registrazione da un pop<html> ulation di neuroni sensoriali primarie, cellule ROHON-barba, sono descritti. I corpi cellulari di questi neuroni si trovano all&#39;interno del midollo spinale dorsale. Cellule ROHON-barba esistono in numerose specie di vertebrati, differenziano prime fasi di sviluppo, e alla base la risposta al tocco embrionale 6, 44, 47, 48. In secondo luogo, le procedure per l&#39;accesso e la registrazione da motoneuroni spinali sono dettagliate. Zebrafish motoneuroni spinali sorgono durante due onde di neurogenesi. Motoneuroni primari precedenza nati sorgono a fine gastrulazione (~ 9-16 HPF), con solo 3-4 motoneuroni primari presenti per hemisegment 45, 46, 49. Al contrario, la popolazione più tardi-nato motoneuroni secondari è più numerose e si verifica durante un periodo prolungato, da ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. secondario motoneurone genesi segmenti metà tronco principalmente è completata da 51 HPF 50. motoneuroni secondari sono considerati la controparte dei motoneuroni del amnioti 46. È interessante notare che i neuroni sovraspinali, tramite dopamina, regolano locomozione la larva e motore secondario neurone genesi nell&#39;embrione e giovane larva 50, 51. motoneuroni primari e secondari comprendono ciascuno diversi sottotipi differenti. ogni motore primario progetti neurone sottotipo un assoni periferici che innerva un gruppo muscolare caratteristico, con un conseguente stereotipo, identificando traiettoria assonale. Generalmente, i motoneuroni secondari seguono percorsi assonale prestabiliti dalla motoneuroni primari. Pertanto, rispetto a traiettorie assoni, motoneuroni primari e secondari sono simili, con l&#39;eccezione che lo spessore assonale e somata dimensione are maggiore per motoneuroni primari 45. In terzo luogo, i metodi per la registrazione da alcuni tipi di interneuroni sono discussi. Tuttavia, in questi casi, è richiesta una quantità limitata di rimozione di altre cellule del midollo spinale, e quindi il midollo spinale è meno intatta che per registrazioni da cellule ROHON-barba o neuroni motori.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Zebrafish, introdotto come modello di sviluppo, hanno guadagnato popolarità in molti altri campi. La facilità di allevamento gran numero di organismi rapido sviluppo, combinata con la chiarezza ottica embrionale, servito come attributi convincenti iniziali di questo modello. Nel corso degli ultimi due decenni, il successo di questo modello è stato ulteriormente spinto dalla sua riconducibilità agli schermi di mutagenesi su larga scala e dalla facilità di transgenesi. Più di recente, gene-editing approcci hanno esteso la potenza del modello. Per gli studi neurologico, zebrafish e larva forniscono un modello a cui possono essere applicati diversi metodi. Qui, ci concentriamo sui metodi che consentono lo studio di una proprietà essenziale dei neuroni, eccitabilità elettrica. La nostra preparazione per lo studio elettrofisiologico dei neuroni spinali zebrafish implica l&#39;uso di colla veterinario sutura per fissare la preparazione ad una camera di registrazione. Metodi alternativi per la registrazioneda embrioni zebrafish e larve comportare l&#39;attacco della preparazione per la camera con un perno multa tungsteno 1, 2, 3, 4, 5. Un perno di tungsteno è più spesso utilizzato per montare il preparato in un orientamento laterale, anche se è stato utilizzato per montare larve dorsale rivolta verso l&#39;alto 4. La colla sutura è stato utilizzato per montare embrioni e larve in entrambi gli orientamenti. Utilizzando la colla, una dissezione minima può essere eseguita, consentendo l&#39;accesso ai neuroni spinali senza l&#39;uso di un trattamento enzimatico, evitando così ogni danno risultante. Tuttavia, per le larve, è necessario applicare un trattamento enzimatico breve per rimuovere il tessuto muscolare che circonda il midollo spinale. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare le proprietà elettriche intrinseche dei neuroni motori, interneuroni e neuroni sensoriali in diversi Sviluppo deil stadi 6, 7, 8, 9.

Noi abbiamo registrato con successo da neuroni ROHON-barba in 17 HPF embrioni a 7 dpf larve (Figura 5A e 5B). Quando sono stati registrati cellule ROHON-barba, la preparazione è stata montata dorsale rivolta verso l&#39;alto. Tale montaggio consente l&#39;identificazione univoca delle cellule ROHON-barba basati sulle loro posizioni dorsali superficiali e grandi dimensioni soma. L&#39;identificazione è ulteriormente confermata dal potenziale di membrana a riposo hyperpolarized stereotipo di questi neuroni (Figura 5, tavolo riquadro) 6, 54. Inoltre, come i neuroni sensoriali primari, i neuroni ROHON-barba mancano ingresso sinaptica. Pertanto, in assenza di stimolazione elettrica, variazioni nel potenziale di membrana dovrebbe verificarsi durante la registrazione in modalità current-clamp (Figura 5B&#39;). Poiché le registrazioni iniziali da cellule ROHON-barba in zebrafish sono stati eseguiti &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 6, varie linee transgeniche (per esempio, Tg (islet2b: GFP), Tg (NGN: GFP), e Tg (isletss: GFP)) sono stati generati che esprimono reporter fluorescente in questi neuroni, facilitare ulteriormente loro identificazione 55, 56, 57. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig5.jpg" /> Figura 5: Voltage- cellule intere e corrente-clamp registrazioni da neuroni ROHON-barba in 1 e 2 dpf embrioni e 7 dpf larve. (A) voltage-clamp di andata e correnti attivo sono stati ottenuti dai neuroni ROHON-barba 1- (sottile linea nera), 2- (spessa linea nera), e 7-dpf (linea grigia) embrioni / larve. Il potenziale possesso era -80 mV e correnti era suscitato da un passo depolarizzante a +20 mV. (B) potenziali d&#39;azione singole sono suscitato da breve (1 ms) Correnteiniezioni (~ 0,35 Na) ai neuroni ROHON-Beard di 1- (sottile linea nera), 2- (spessa linea nera), e 7-dpf (linea grigia) embrioni / larve. (B&#39;) In assenza di stimolazione elettrica, variazioni nel potenziale di membrana, come depolarizzazioni postsinaptici spontanee, si verificano nei neuroni ROHON-barba. La tabella inserto riassume i valori dei potenziali di membrana registrate da neuroni ROHON-barba di 1- (n = 21) e 2- (n = 9) dpf embrioni e 7- (n = 7) dpf larve riposo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> linee transgeniche che permettono l&#39;identificazione univoca di altri sottotipi di neuroni spinali sono anche disponibili. Tra questi, la linea mnx1 transgenici Tg (mnx1: GFP) esprime la proteina fluorescente verde (GFP) in un sottoinsieme dei motoneuroni spinali subito dopo la loro specifica (~ 14-16 HPF) &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 58, 59. A causa del posizionamento stereotipo dei motoneuroni primari all&#39;interno di ogni hemisegment (Figura 6A), insieme con l&#39;espressione di GFP nel transgenico mnx1, è possibile identificare i vari sottotipi motoneurone primaria (Figura 6B e 6C). Tra cui un colorante fluorescente nella soluzione elettrodo di registrazione permette la visualizzazione delle traiettorie degli assoni, fornendo ulteriori conferma dell&#39;identità motoneurone, come alcuni interneuroni esprimono anche GFP nel Tg (mnx1: GFP) linea. In alternativa, un&#39;altra linea transgenica che permette l&#39;identificazione dei motoneuroni è la linea ET2 60. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig6.jpg" /> Figura 6: tensione cellule intere e corrente-clamp registrazioni da motoneuroni 1 dpf zebrafish Embryos. (A) Un fumetto descrive le caratteristiche morfologiche delle principali sottotipi motoneurone presenti nel midollo spinale zebrafish. Motoneuroni primari sono identificati dalla posizione del loro soma all&#39;interno di un segmento (cioè rostrale [POR], mediale [MiP], o caudale [CaP]) 45. Inoltre, ogni sottotipo estende un assone verso la periferia attraverso un percorso distinto. L&#39;uso combinato della Tg (mnx1: GFP) e linea colorante etichettatura rivela il mozzo assonale stereotipo e l&#39;identità del sottotipo motoneurone durante una registrazione. Usando i metodi qui presentati, è possibile registrare sequenzialmente da tre diversi sottotipi primario motoneurone nella stessa hemisegment. (B) voltage-clamp sono mostrati che sono stati ottenuti da ROP, MiP, e CaP, tutto in una sola hemisegment. Un gradino di tensione di +20 mV è stato usato per indurre le correnti da un potenziale di -80 mV. (C) Durante corrente-clamp recordings da ROP MiP, e CaP, brevi (1 ms, ~ 0,4 nA) iniezioni di corrente sono stati applicati per innescare un potenziale d&#39;azione. Il potenziale di membrana è tenuto presso ~ -65 mV. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Una differenza principale tra neuroni motori primari e secondari è il più grande somata dei neuroni in precedenza nati. Tuttavia, secondarie sottotipi motoneurone non sono identificabili dalla dimensione soma o posizione. Per registrazioni specifiche motoneuroni secondari, due linee transgeniche, Tg (GATA2: GFP) e Tg (islet1: GFP), sono stati utilizzati per l&#39;identificazione dei motoneuroni secondari con assoni ventrale e dorsale sporgenti, rispettivamente 55, 61. Tuttavia, una terza secondaria sottotipo motoneuroni è presente nel midollo spinale zebrafish, con axons che dorsale del progetto e ventrale 62. Di conseguenza, tintura può essere utilizzato per riempire motoneuroni secondari durante la registrazione per identificare sottotipi sulla base della morfologia (figura 7A) 8, 9. Spesso, durante voltage-clamp (Figura 7B, asterischi) o registrazioni corrente-clamp (Figura 7C e 7C&#39;, frecce) da motoneuroni secondari, vengono registrati eventi spontanei o sinaptici. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig7.jpg" /> Figura 7: tensione cellule intere e corrente-clamp registrazioni da motoneuroni secondari di 2 DPF embrioni. (A) Nel Tg (GATA2: GFP) linea, due diversi sottotipi del motoneurone secondario esprimono GFP 62. Nel hemisegment sinistra, una ventrale motoneurone secondaria(Asterisco e la freccia indicano soma e assone, rispettivamente). Nel hemisegment vicina, a destra (caudale), v&#39;è una ventrale / dorsale motore secondario neurone (asterisco indica soma; frecce indicano i due assoni, uno sporgenti ventrale [freccia in basso] e l&#39;altra dorsalmente [freccia in alto]). Questi neuroni sono state marcate con un colorante fluorescente rosso durante le registrazioni. Per identificare ventrale / dorsale motoneuroni secondari, è fondamentale garantire che la dissezione non rimuove muscolare nel hemisegment caudale adiacente, così danneggiare o rimuovere l&#39;assone dorsale. Dopo la registrazione, il soma neurone rimane attaccato al micropipetta mentre viene tirata via dalla preparazione (a destra asterisco in alto). Quando si utilizza coloranti ad occupare neuroni durante le registrazioni, il colorante spesso perdite mentre l&#39;elettrodo è nel bagno, risultante in uno sfondo fluorescente rossa visibile nel midollo spinale e notochord (asterisco fondo in rostrale [sinistra] hemisegment &lt;<html> / Em&gt;). (B) voltage-clamp sono stati ottenuti da ventrale e ventrale / dorsale motoneuroni secondari. gradini di tensione (a -30, -10, +10, +30, +50, +70, +90, +110 mV) hanno suscitato verso l&#39;esterno e verso l&#39;interno correnti. Potenziali d&#39;azione di sbloccaggio / depolarizzazioni possono essere presenti nelle registrazioni (asterischi). (C) durante la registrazione corrente-clamp da neuroni motori secondari, brevi (1 ms) iniezioni di corrente di ampiezza crescente sono stati applicati ai neuroni per innescare un potenziale d&#39;azione (asterischi). (C&#39;) Esempi di potenziali di azione singoli innescati nei motoneuroni secondari da ~ 0,4-nA iniezioni correnti sono mostrati. In questa fase, potenziali d&#39;azione spontanei sono anche osservati (C e C&#39;, frecce). (D) prolungato (100 ms) iniezioni di corrente (~ 0,35 na) innescare la cottura ripetitiva dei potenziali d&#39;azione. Il potenziale di membrana è tenuto presso ~ -65 mV.carico / 55507 / 55507fig7large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

zebrafish-situ-spinal-cord-preparation-for-electrophysiological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

11.4K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC).  Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali. 

Video: Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neuroscienze

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...