Wir danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon und Rose Hedreen für die frühe Arbeit bei der Prüfung und Etablierung dieser Methodik und Kammermusik. Wir danken Kelly Tellez und Graham Buchan für das Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Wir danken Andrew Seeds und Julie Simpson für ihre Pionierarbeit und ihre Beratung und Unterstützung bei der Vorgabe der Verwendung von Brilliant Yellow Dye (Sigma). Diese Arbeit wird zum Teil von der Mary E. Groff Chirurgischen und medizinischen Forschung und Bildung Charitable Trust, dem Bronfman Science Center und dem Hellman Fellows Programm unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie einen Aspirator für das Bewegen von lebenden Drosophila aus einer Kulturfläschchen in die Putzkammer vor. Aspiratoren erlauben den Transfer von bewussten Tieren in die Verhaltenskammern, um sicherzustellen, dass die Anästhesie die nachfolgende Verhaltensbeobachtung nicht beeinträchtigt. <ol><li> Mit Schere schneiden 1.5 Meter von Tygon-Schlauch ID ⅛ &quot;, OD ¼&quot; .Schneiden Sie mindestens 1 Zoll von der Spitze einer 1 mL Einweg-Mikropipettenspitze. Halten Sie ein 1 cm großes Quadratnetz (Öffnung 0,196 Zoll) über die geschnittene Spitze. ANMERKUNG: Die meisten 1mL Spitzen haben eine Abstufungslinie, in der die Spitze in der Verpackungskasten sitzt, die normalerweise zu dieser Linie geschnitten wird. </li><li> Lege eine frische 1-ml-Mikropipettenspitze über die Mesh / Cut-Spitze legen. Beobachten Sie die Maschenform eine feste Barriere zwischen den beiden Spitzen. Das Innere der neuen Spitze schafft eine Haltekammer für Fliegen. </li><li> Schneiden Sie die extreme Spitze der neuen Mikropipettenspitze, um die Öffnung zu erweitern, um den Durchgang einer einzelnen Fliege zu ermöglichen. Das holE entspricht etwa der Öffnung der Putzkammer (ca. 1,5-2 mm im Durchmesser). </li><li> Legen Sie die verschachtelten Spitzen bequem auf das Ende des Tygonschlauches. Schieben Sie die Spitzen in das Rohr, um eine feste Passung zu gewährleisten, um Vakuumdruck zu ermöglichen. </li><li> Am anderen Ende des Schlauches, schneiden Sie die Spitze einer 200 μl Mikropipettenspitze und passen Sie das schmale Schnittende in den Schlauch. Dies ist die &quot;Mund&quot; -Seite des Aspirators. </li></ol></li><li> Staub-Aliquot-Rohre vorbereiten. Wiegen Sie etwa 5 mg brillanten gelben Farbstoff auf tariertem Wägepapier. Den Staub in ein 0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben und die Kappe fest schließen. HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Nitrilhandschuhen während der Aliquotvorbereitung, da einige Latexhandschuhe für den Farbstoff durchlässig sind. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2) für alle Proben im Experiment (eine für jede Fliege in jeder Kammer). </li><li> Ethanol (EtOH) -Röhrchen vorbereiten: 1 ml 100% EtOH in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Etikettenröhrchen für Genotypen oder Bedingungen/ Li&gt; <li> Wiederholen Sie Schritt 1.4) für alle Proben im Experiment (eine für jede Fliege in jeder Kammer). Cap und rette die EtOH-Röhrchen für die Fertigstellung des Grooming-Assays. Dazu gehören auch mindestens eine &quot;Blank&quot; -Probe, die nur 1 mL EtOH ohne Fliege für Negativkontrollen sein wird. </li><li> Montieren Sie jede Putzkammer, indem Sie die Schiebeplatte (mit den kleineren Löchern) verschrauben, aber die Bodenplatte (mit den größeren Löchern) entfernt werden, um Staub zu entfernen. </li><li> Legen Sie jede notwendige Grooming-Kammer flach auf einen Tisch mit der Oberseite nach unten. Fliege Eintrittsseite ist verdeckt. </li><li> Laden Sie 5 mg brillantes gelbes Farbstoffaliquot in jede Kammer, indem Sie das Röhrchen gegen die Oberfläche der Kammer über dem gewünschten Brunnen klopfen. Klopfen Sie die Kammer gegen den Tisch, um sicherzustellen, dass der gesamte Staub durch das Netz auf die obere Platte fällt. </li><li> Schrauben Sie die Bodenplatte auf jede Kammer, so dass die breiteren Enden der konischen Öffnungen nach außen weisen und die Löcher nicht über den Brunnen ruhen. Sichern Sie den BotTom Platte fest, so dass es nicht gleiten und freisetzen Farbstoff. </li><li> Klappen Sie die Kammer um und klopfen Sie es ein paar Mal gegen einen Tisch, so dass der Staub durch das Netz fällt, um auf der Bodenplatte zu ruhen. </li><li> Schieben Sie die obere Platte der Kammer in die &quot;offene Position&quot;, so dass die kleinen Löcher mit den fünfzehn Brunnen übereinstimmen, so dass die Einführung von Fliegen in einzelne Brunnen. </li></ol> 2. Fliegen-Staub und Pflege <ol><li> Laden Sie eine Fliege in den Mund Aspirator durch sanft saugen durch ein Ende des Aspirators, als ob mit einem Stroh. Setzen Sie die Fliegen durch leichtes Blasen und richten Sie die Öffnung zum Ziel. </li><li> Aspirieren Sie eine Fliege in jeden Brunnen für das Experiment verwendet. Nach dem Laden eines Brunnens schieben Sie die obere Platte so, dass die Fliege in der Kammer eingefangen wird, und legen Sie das Band über die Öffnung dieses Brunnens während des Ladens der gesamten Kammer, um zu verhindern, dass die Flucht entweicht, während andere Brunnen geladen wird. Wenn mehrere Fliegen in ein sing. Aspiriert werdenE gut, lassen Sie diese Öffnung aufgedeckt, bis nur eine Fliege bleibt. </li><li> Nachdem alle notwendigen Brunnen mit Fliegen gefüllt sind, klappen Sie die Kammer so, dass die Bodenplatte nach oben ist, so dass der Staub das Potenzial hat, die Fliegen zu beschichten, indem er durch das Netz fällt. </li><li> Die obere und untere Platte fest anziehen, indem sie die Schrauben anziehen und die Kammer vorwischen, um die Fliegen für 4 s zu stauben. </li><li> Klopfe die Kammer (obere Platte nach unten) gegen einen Tisch zweimal, so dass der Farbstoff auf die andere Seite fällt. Dann umdrehen Sie die Kammer über (obere Platte nach oben) und klopfen Sie die Kammer zweimal, um sicherzustellen, dass sich der Farbstoff auf dem Boden der unteren Kammer abseits der in der oberen Kammer gehaltenen Fliege absetzt. </li><li> Für Kontrollfliegen, die nicht gepflegt werden sollen, fahren wir sofort mit Schritt 3 des Protokolls fort. Für Fliegen, die den Assay abschließen, fahren Sie mit Schritt 2.7 fort. </li><li> Legen Sie die Kammer flach auf einen Tisch oder Arbeitsplatte mit der oberen Platte nach oben für dreißig Minuten, damit die Fliegen zu bräunen. Legen Sie die SohleEr in einem geräusch- und vibrationsfreien Raum, um Ihre Umgebung für alle Grooming-Experimente (Beleuchtungsstärke, Feuchtigkeit und Temperatur) konstant zu halten. Ein Tisch-Inkubator bei RT oder 25 ° C mit Feuchtigkeitskontrollen ist ideal. </li></ol> 3. Vorbereitung der Proben und Absorptionsanalyse <ol><li> Halten Sie das Kammerniveau mit der oberen Platte nach oben, schrauben Sie die Bodenplatte vorsichtig ab und entfernen Sie es aus der Kammer, wobei darauf zu achten ist, dass kein Farbstoff verloren geht. </li><li> Legen Sie die Kammer auf eine Fly CO 2 -Platte mit niedrigem Luftstrom, bis die Fliegen anästhesiert sind. </li><li> Schrauben Sie die obere Platte aus der Kammer heraus. Verwenden Sie sorgfältig eine Pinzette, um ein Bein zu packen und eine abgestaubte Fliege aus jeder Kammer zu bewegen und sie in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zu legen, das EtOH enthält. Die Übertragungszeit für 15 Kammern, die jeweils eine Fliege enthält, beträgt ca. 3-5 min. Experimentatoren sollten in Übertragungszeiten Faktor, wenn / wenn Staffelung Experimente mit mehreren Kammern, um eine effiziente Inszenierung von Experimenten zu gewährleisten. </Li&gt; <li> Sobald jedes Mikrozentrifugenröhrchen 1 Fliege enthält, schließen Sie die Kappe und umdrehen die Röhre dreimal, um zu rühren und die Lösung von Farbstoff und Ethanol zu mischen. </li><li> Inkubation von Röhrchen, die Ethanol enthalten, und fliegt 5 h bei RT, um eine vollständige Entfernung des Farbstoffs aus der Fliege in Lösung zu gewährleisten. Nach den 5 h, verwirren Sie jedes Röhrchen (2 s) kurz, um die Freisetzung des Farbstoffs von den Fliegen zu gewährleisten. </li><li> Aliquotieren Sie 50 &amp; mgr; l des experimentellen 1,5 ml-Röhrchens in eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen, falls verfügbar, wobei die Lage der einzelnen Proben auf der Platte beachtet wird. Füge 200 μl EtOH hinzu, um die Probe 5x zu verdünnen. Die Verdünnung vermeidet Deckeneffekte von stark abgestaubten Fliegen oder großen Grooming Defekten. </li><li> Verwenden Sie einen Plattenleser, um jede Probe bei 397 nm zu analysieren. Alternativ kann die Extinktion für einzelne Proben und Zuschnitte auf einem Standard-Spektrophotometer im sichtbaren Spektrum gemessen werden, wenn ein Plattenleser nicht verfügbar ist. </li><li> Lesen und Aufzeichnen der Probe durch den Plattenleser und speichern Sie die Kalkulationstabelle mit dem RecordeD Proben auf dem Teller. </li></ol> 4. Quantifizierung der Ergebnisse <ol><li> Kompilieren Sie Ergebnisse für alle Proben und messen Sie die Varianz für jeden Genotyp oder Zustand. ANMERKUNG: Die Farbstoffansammlung zum Zeitpunkt 0 min und zum Zeitpunkt 30 min wird als separate Bedingungen unter Verwendung statistischer Analysen durch Einweg-ANOVA- und Bonferroni-Korrektur oder andere Korrekturen für mehrere parallele Vergleiche betrachtet. </li><li> Berechnen Sie die Grooming-Prozentsatzdifferenz für jeden Genotyp / Zustand unter Verwendung der folgenden Gleichung: [(Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 0 &#39;- Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 30&#39;) / Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 0] x 100. </li><li> Express den Prozentsatz für jeden Genotyp und Bedingung in Bar-Plots und vergleichen über Genotypen und Bedingungen. </li></ol>

<ol>
	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster.">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Organization+and+Postural+Facilitation+-+Rules+for+Grooming+in+Flies.">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951 (2014).</li><li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila.">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li><li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100 (2011).</li><li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders.">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine.">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li><li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila.">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li><li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMB,+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies.">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li><li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines.">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li><li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+D1+family+dopamine+receptor,+DopR,+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila.">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li><li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Der Grooming-Assay ist relativ einfach, aber wir würden den Experimentatoren vorsichtig sein, den folgenden Problemen besondere Aufmerksamkeit zu widmen. Eine dichte Abdichtung durch Anziehen der Schrauben an der Ober- und Unterseite nach dem Einführen von Fliegen und Farbstoff ist für reproduzierbare Ergebnisse unerlässlich. Der brillante gelbe Farbstoff ist sehr fein und lose Gelenke werden Verluste an Farbstoff aus den Kanten der Kammer ermöglichen. Die Unregelmäßigkeit des Farbstoffgehalts für jede Vertiefung könnte leicht die Grooming-Quantifizierung als ungleichförmiges Staubwurf abwerfen, um die Varianz und die falsch-positiven Raten für die Putzereignisse zu erhöhen. Darüber hinaus ermutigen wir die Experimentatoren, sich der Umgebung bewusst zu sein, in der sie sich entscheiden, die Putzkammer während der 30-minütigen Putzzeit zu halten. Umgebungskonstanz für Temperatur, Beleuchtung, Tageszeit und Feuchtigkeit sind für eine konsistente Leistung für Drosophila- Verhaltensassays unerlässlich. Halten Sie die Grooming-Kammern in einem kleinen Inkubator, um ablenkendes o zu minimierenR variable Laborumgebungen ist ideal für maximale Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, aber auch andere räumliche Anordnungen können erfolgreich sein. In Bezug auf Farbstoff-Akkumulationsmessungen haben wir festgestellt, dass der Farbstoff für Latex-Handschuhe durchlässig ist, so dass Nitril-Handschuhe für die Handhabung und das Wiegen von Staub vorzuziehen sind. Achten Sie darauf, den Staub nicht weit über die Laboroberflächen zu verbreiten, da er leicht Kleidung anziehen und möglicherweise Oberflächen oder Geräte verunreinigen kann. Die Isolierung eines Bereichs und eines Fliegenstation / CO 2 -Pads für Experimente ist bevorzugt, um eine Farbstoffbelichtung zu enthalten. Wir ermutigen auch Experimentatoren, sicher UV-transparente 96-Well-Platten zu verwenden. Der 397 nm-Absorptionspeak für brillanten gelben Farbstoff liegt in der Nähe des UV-Spektrums, und Standard-96-Well-Platten können schwache oder ungenaue Maßnahmen für Farbstoffverdünnungen ergeben. Der Farbstoff ist auch in Wasser als Alternative zu EtOH löslich. Allerdings saugen Drosophila nicht ohne weiteres in Wasser ohne signifikante Verwirbelung und kleine Luftblasen aloDer Körper der gefärbten Tiere zeigt eine geringere Konsistenz und Löslichkeit des Farbstoffs. Ethanol zeigt konsequent bessere Ergebnisse und geringere Varianz bei direkten Vergleichen. Unser Assay kann für ergänzende Techniken und weiter verfeinerte Studien, wie z. B. die Sezierung des Fliegenkörpers nach der Assay, leicht modifiziert werden ( Abbildung 4 ). Solche Ergänzungen können notwendig sein, um zu verstehen, welche Grooming-Schritte betroffen sind, da die Farbstoff-Akkumulation nur weitgehend auf Verhaltensverschiebungen hinweist, ohne direkt auf die grundlegende biologische oder neuronale Ursache zu reagieren. Sobald Unterschiede beobachtet werden, sind parallele Experimente mit Videoaufzeichnung oder Direktbeobachtungsmethoden für das Verständnis der Verhaltenswurzel von jeglichen Unterschieden in der Grooming-Effizienz unerlässlich. Dies kann durch visuelle Quantifizierung der Staubpartikelansammlung auf bestimmten Körperteilen unter Verwendung von Pixelintensitätsmaßnahmen durch das NIH ImageJ-Softwareprogramm sowie die direkte Verfolgung von Vorder- und Hinterbein weiter untersucht werdenVerhaltensweisen durch das Aufnehmen von Videomaterial. In Bezug auf alternative Methoden zur visuellen Quantifizierung von fluoreszierendem Staub nutzten frühe Experimente im Labor ein fluoreszierendes Farbpigment, das aus alkalischem Seltenerdmetall-Silikat-Aluminat-Oxid Europium stammte. Nach dem Abstauben der Fliegen mit dem fluoreszierenden Farbpigment und der Betäubung oder Entkapselung der Tiere nach dem Grooming können die Körper durch digitale Mikroskopie unter Verwendung eines Standard-Fluoreszenzfilters für GFP auf einem Sektionsbereich ( Supplemental Data ) aufgezeichnet und analysiert werden. Während dieses Verfahren eine genaue Quantifizierung der Pixelintensität ermöglicht, die mit den mit dem brillanten gelben Farbstoff beobachteten Ergebnissen übereinstimmt, haben wir festgestellt, daß der Durchsatz dieses Verfahrens relativ langsam ist und die Pigmentteilchen leicht variabel sind und weniger gleichförmig sind als die für Brilliant beobachtete Beschichtung Gelber Farbstoff Allerdings ist für einige experimentelle Anwendungen diese alternative Methode angemessen, und es gibt erhebliche Vielfalt in verfügbaren FluoReszente Farben, die für Drosophila- und Nondrosophila- Anwendungen oder iterative Staubversuche nützlich sein könnten, wo die Quantifizierung von separaten Ereignissen wesentlich ist. Es ist anzumerken, dass das Farbpigment selbst wasserlöslich ist, aber schnell seine Fluoreszenz in Wasser verliert und die Nützlichkeit dieses Pigments für Standardabsorptionsmaßnahmen stark beeinträchtigt. Diese Arten von Methoden, die auf bestimmte Vorder- oder Hinterbein-Grooming-Ereignisse abzielen, sind für das Verständnis der genauen Natur eines Phänotyps unerlässlich und können potenzielle neuronale Schaltungen oder Bewegungsapparate hervorheben, um weiter zu untersuchen. Darüber hinaus ist es für parallele Kontrollexperimente unerlässlich, potenzielle unspezifische Verhaltensgründe auszuschließen, aus denen die Pflege hervorgehen könnte. Wenn Tiere breite motorische Defizite oder Anomalien aufweisen, ist es möglich, dass Grooming-Defizite sekundär zu den breiten Bewegungs-Phänotypen sind. Einfache Video-Tracking von WT-Tieren gegen die Mutante oder CirCuit manipulierte Bedingungen können leicht unterscheiden zwischen großen Verschiebungen der Geschwindigkeit oder Gesamtstrecke zurückgelegt, unabhängig von Grooming Defizite. Der Grooming-Assay ist ein vielseitiges Verfahren, das sowohl für kleine als auch für große Studien dieses komplexen mehrstufigen Lokomotivprogramms geeignet ist. Die Konstruktionen sind leicht modifiziert, um die Kammerdimension oder die Nummer 15 zu vergrößern. Die Methode liefert robuste quantitative Daten, die ideal für eine vergleichende Bewertung der Fütterungsfähigkeit sind. Die Herstellung der Kammern ist kostengünstig und kann in Abhängigkeit von den verfügbaren Ressourcen mit vielen verschiedenen Maschinen (3D-Drucker, Laserschneider, CNC-Mühlen) hergestellt werden. Die Technik ermöglicht einen mittleren Durchsatz von einzelnen Proben, die leicht für genetische Bildschirme und funktionelle Schaltkreis-Mapping-Studien erweitert werden können.

Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) ist ein robustes angeborenes Verhalten, das die Koordination mehrerer unabhängiger motorischer Programme beinhaltet 1 . Fruchtfliegen reinigen ihre Körper von Staub, Mikroben und anderen Krankheitserregern, die die normale physiologische Funktion wie Seh- und Flucht behindern oder zu erheblichen Immun-Herausforderungen führen können. Beim Erfassen und Beantworten sowohl der mechanischen 2 als auch der immunen Aktivierung 3 reiben Fliegen wiederholt ihre Beine zusammen oder auf eine gezielte Körperregion, bis sie ausreichend sauber ist und das Grooming zu einem anderen Teil des Körpers fortschreitet. Fliegen führen Putzbewegungen in deutlichen Kämpfen durch, die weitgehend in stereotypen Mustern 1 , 4 auftreten . Eine Verhaltenshierarchie wird deutlich, wenn Putzsignale priorisiert werden. Schaltungen und Wirkungsmuster wurden in der Unterstützung identifiziert oFa-Modell, dass Grooming-Programme an der Spitze der Hierarchie auftreten zuerst und unterdrücken parallele Signale aus Bereichen des Körpers, die nachher gepflegt werden 5 . Höchste Priorität wird dem Kopf gegeben, dann dem Bauch, den Flügeln und schließlich dem Thorax 5 . Das Grooming-Programm in D. melanogaster ist ein ideales System für das Studium von neuronalen Schaltungen, modulatorischen molekularen Signalen und Neurotransmittern. Zum Beispiel verursachen Kompromisse der Neurofibromin-Funktion 6 , der Verlust des Drosophila- zerbrechlichen X-mentalen Retardierungsproteins ( dfmr1 ) 7 und die Exposition gegenüber Bisphenol A (BPA) 8 alle ein übermäßiges Putzen und andere Verhaltensweisen, die analog zu diskreten menschlichen Symptomen der Neurofibromatose, zerbrechlichen X sind Syndrom und Aspekte von Autismus-Spektrum-Störungen und Attention-Deficit Hyperaktivitätsstörung (ADHS). Grooming Verhalten kann auch habitua seinTed unterschiedlich über Mutantenstämme 2 , die dieses Motorprogramm für Studien der Verhaltenskraft verleihen. Die Breite der neurologischen Phänomene, die von Drosophila modelliert werden kann, verlangt einen neuartigen Vergleichsansatz, um die Fähigkeit der Fliegen zu messen, sich selbst zu pflegen. Die kombinierte Wirkung von vesikulären Monoamin-Transportern und die relative Häufigkeit von Dopamin und anderen biogenen Aminen im Körper wurde gezeigt, um das Fruchtfliegen-Groomverhalten 9 , 10 zu vermitteln. Octopamin und Dopamin stimulieren vergleichbare Hindleg-Grooming-Aktivität in enthaupteten Fliegen, während Tyramin, der Vorläufer des Octopamins, auch das Grooming in geringerem Maße auslöst 7 . Vier Dopaminrezeptoren wurden in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 identifiziert </supAufgaben Durch die Verwendung des in diesem Protokoll beschriebenen Grooming-Assay-Verfahrens haben wir eine Rolle für die Typ-I-Familie Dopamin Rezeptor DopR ( DopR, dDA1, dumm ) im Hindleg- Grooming-Verhalten 15 . Grooming kann indirekt quantifiziert werden, indem man das Ausmaß der Sauberkeit betrachtet, mit dem ein Tier nach dem Abstauben des ganzen Körpers mit einem Markerfarbstoff oder einem fluoreszierenden Staub 5 , 16 vollständig pflegen kann. Der Rest des Staubes, der auf dem Körper verbleibt, kann als relativer Marker für das Gesamtverhalten verwendet werden. Staubige Fliegen, nachdem sie genügend Zeit zum Bräutigam gegeben haben, können ein spezifisches Defizit im Putzverhalten manifestieren. Da die Grooming-Untersuchungen umfangreicher geworden sind, haben Protokolle solche Praktiken als Enthauptung integriert, um pharmakologische Behandlungen auf die Nacken-Binde-Nerven 10 hinzuzufügen, taktile Stimulation von Borsten, um die Grooming-Antwort 2 hervorzurufen,Und Videoaufzeichnung des Verhaltens 15 . Die direkte Beobachtung der Pflege kann leicht durch die visuelle Beobachtung und manuelle Aufzeichnung der Häufigkeit und Dauer der spezifischen Grooming-Ereignisse 4 untersucht werden . Wir haben eine Fünfzehn-Brunnen-Grooming-Kammer entworfen, die mit einem 3D-Drucker oder einem Laser-Cutter konstruiert werden kann und die Blaupause-Designs zur Reproduktion zur Verfügung stehen 15 . Die Konstruktion verwendet zwei miteinander verbundene Mittelplatten mit Öffnungen, die durch Mesh und zwei zusätzliche Gleit- und Bodenplatten, von denen Fliegen und / oder Farbstoff beladen werden, abgetrennt und getrennt sind. Nachdem wir dem Staub gesträubt haben, legen wir sie in Ethanol ab, um den Farbstoff zu solubilisieren und die Absorption dieser Lösung bei der Wellenlänge des Farbstoffs zu messen. Ein Plattenleser kann für mehrere parallele Proben verwendet werden oder ein Einzellesenspektrophotometer kann für einzelne Proben verwendet werden. Diese Methode minimiert den durch Handhabung verursachten Fehler und alTiefs für Grooming-Assays, die auf einer kleineren, kostengünstigen Skala laufen. Dieses Verfahren wird abgeleitet und von den Methoden , die von Julie Simpson und Andrew Seeds Pionier modifiziert, die mit Heizelementen für temperaturempfindliche Schaltung Manipulationen 5 größere Grooming Kammern verwenden. Das folgende Protokoll zeigt die Quantifizierung des Groomens des ganzen Körpers sowie die alternativen Methoden zur Quantifizierung der Farbstoffansammlung an einzelnen Körperteilen. Wir zeigen auch Beispielvergleichsdaten zwischen WT- und DopR- Mutanten sowie Methoden zur Berechnung eines einfachen Leistungsindexes für das Groomverhalten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5229K54</td>
			<td>ID 1/8&#34;, OD 1/4&#34;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (1ml and 200ul)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-165, 24-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Screen, 2&#34; x 2.6&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9318T44</td>
			<td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Yellow Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201375-25G</td>
			<td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>set to &#34;touch&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>86-1282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10025-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20170-293</td>
			<td>tubes can be reused with successive assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>26014017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HTX Platereader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>need to download catalog to access product number</td>
			<td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; acrylic plastic</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8473K341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 nuts</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90257A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A199</td>
			<td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1/2&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A194</td>
			<td>the second plate from the top needs to be tapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-56 3/8&#34; flat head phillips machine screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91500A088</td>
			<td>these hold the two middle plates together</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.175&#34; ID, 1/4&#34; OD, 0.34&#34; aluminum pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92510A044</td>
			<td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&#160; These act as sheaths for the 1&#34; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of drosophila grooming behavior

Drosophila- Grooming-Verhalten ist ein komplexes, mehrstufiges Lokomotiv-Programm, das eine koordinierte Bewegung von Vorder- und Hinterbeinen erfordert. Hier stellen wir ein Grooming-Assay-Protokoll und ein neuartiges Kammerdesign vor, das kostengünstig und skalierbar ist für kleine oder große Studien der Drosophila- Pflege. Fliegen sind ganz über ihren Körper mit Brilliant Yellow Farbstoff und gegebene Zeit, um den Farbstoff aus ihren Körpern in der Kammer zu entfernen. Fliegen werden dann in einem eingestellten Volumen an Ethanol abgelagert, um den Farbstoff zu solubilisieren. Die relative spektrale Extinktion von Farbstoff-Ethanol-Proben für gepflegte und nicht geschliffene Tiere wird gemessen und aufgezeichnet. Das Protokoll liefert quantitative Daten der Farbstoffakkumulation für einzelne Fliegen, die leicht gemittelt und über Proben verglichen werden können. Dies ermöglicht es, dass experimentelle Entwürfe die Grooming-Fähigkeit für mutierte Tierversuche oder Schaltungsmanipulationen leicht auswerten können. Dieses effiziente Verfahren ist vielseitig und skalierbar. Wir zeigen wOrk-flow des Protokolls und Vergleichsdaten zwischen WT-Tieren und mutierten Tieren für den Drosophila Typ I Dopamin Rezeptor ( DopR ).

Der Grooming-Assay liefert quantitative Daten, um die Verhaltensfähigkeit zu bewerten, basierend auf dem relativen Rest des angesammelten Farbstoffs, der auf den Körper der Fliegen nach einer festgelegten Zeit der Messung für das Grooming (30 min) zurückgelassen wurde. Probenbilder der Gleitpflegekammergestaltung und Hauptschritte des Assays sind in Fig. 1 hervorgehoben . Fliegen aggregieren eine signifikante Menge an Farbstoff aus der sofortigen Staubbildung durch Vortexen in Gegenwart von Farbstoff ( Abbildung 2d, 2e ). Die versunkenen Fliegen können einen Bereich der Farbstoffansammlung nach dem Assay beibehalten ( Abbildung 2f, 2g ). Die solubilisierende Farbstoffansammlung in EtOH und die Messung der Extinktion einzelner Proben liefert daher eine reproduzierbare und hochquantitative Beurteilung der Groomfähigkeit. In dieser Studie von DopR in der Regulierung der Hindleg Grooming, verglichen wir die pflegende Leistung eines starken Hypomorph ( <strong&gt; Fig. 3a, 3b) und Null- DopR- Mutante zu einem WT-Stamm ( Fig. 3c, 3d ). Die DopR- Mutanten behaupteten deutlich mehr Farbstoff als ihre WT oder gerettete Gegenstücke, was darauf hinweist, dass die DopR- Mutanten im Groomverhalten weniger effizient waren ( Abbildung 3a, 3c ). Um das Verständnis der Rolle des DopR zu verfeinern, führten wir ein Parallelversuch mit Rutabaga- Fliegen durch und führten eine starke hypomorphe Mutation der Calcium-abhängigen Adenylatcyclase durch, die stromabwärts von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Drosophila wirkt. Diese Mutanten zeigten höhere Farbstoffakkumulationsniveaus als DopR- Mutanten ( Abbildung 3e, 3f ). Die Daten deuten auf eine signifikante Rolle für das DopR im Grooming-Verhalten und einen möglichen Beitrag von anderen GPCRs hin, die parallel oder in verschiedenen Lokomotivprogrammen für Grooming-Verhaltensweisen arbeiten. Um die Unterschiede zu untersuchenWährend der Grooming-Fähigkeiten von foreleg vs Hindleg Grooming-Programme, wir direkt bewertet Farbstoff Akkumulation auf trennbare Körperteile während der Grooming ( Abbildung 4 ). Durch die Sezierung der Köpfe, Flügel oder &quot;Körper&quot; (Bauch / Thorax / Beine) der einzelnen Fliegen nach der Assay, konnten wir zuverlässig Unterschiede und Ähnlichkeiten zwischen Genotypen quantifizieren. Die Ergebnisse stützten sich auf eine Interpretation, bei der es keine Unterschiede gab, die für die Vorderpferdeprogramme nicht vorhanden waren, da keine signifikanten Unterschiede für die Köpfe der WT Vs beobachtet wurden . DopR-Mutanten. Allerdings wurden signifikante Unterschiede für die Flügel- und Körpermessungen zwischen Genotypen beobachtet. Diese ergänzende Technik, um den primären Assay auf Körperteile anstelle von ganzen Fliegen durchzuführen, erlaubt eine einfache Methode, anfänglich zu unterscheiden, Vorder-und Hindleg-Grooming-Programme. Diese Ergebnisse wurden weiter ausgedehnt und durch sorgfältige Verhaltensbeobachtungen und Videoaufnahmen oder Verfolgen einzelner Komponenten des Vorderbeins oder h unterstütztIndleg Verhaltensweisen. Alle Ergebnisse aus den Abbildungen 2-4 werden mit Genehmigung von Genes, Brain und Behavior 15 reproduziert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55231/55231fig1.jpg" /> Abbildung 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Dieses vereinfachte Flussdiagramm skizziert die wichtigsten Schritte im Grooming-Protokoll, wobei einige der notwendigen Materialien und Ausrüstung hervorgehoben werden. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55231/55231fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55231/55231fig2.jpg" /> Abbildung 2: Quantifizierung der Grooming-basierten Dye Accumulation. ( A ) pfalzkammer Einzelne Fliegen und Brilliant Yellow Dye werden in einzelne Brunnen (1 Fliege: 1 Well) platziert. MaßeUnd Blaupausen für die Produktion in ergänzenden Daten. ( B, d, f ) WT erwachsene männliche Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 erwachsene männliche Drosophila. ( B, c ) Fliegen vor dem Abstauben. ( D, e ) Fliegt unmittelbar nach dem Stauben durch Vortexen, vor dem Grooming (Zeit: 0 min). ( F, g ) Fliegen nach dem Grooming (Zeit: 30 min). Maßstab = 400 μm. Nachgedruckt mit Erlaubnis von Genes, Gehirn und Verhalten 15 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55231/55231fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55231/55231fig3.jpg" /> Abbildung 3: Dopamin-Rezeptor ( DopR / dDA1 / dumm ) ist für die Modulation des Grooming-Verhaltens erforderlich. ( A, c, e ) GroominG Wildtyp (blau) und Mutantenfliegen (rot / orange) gemessen bei 0 min oder 30 min nach dem Stauben. SEM wird für jeden Genotyp und Zustand gemessen. ( A, b ) n = 43 Fliegen pro Genotyp und Zustand. ( A ) WT und DopR f02676 Fliegen zeigen beide ein Groomverhalten (+/ + 30 &#39;im Vergleich zu + / + 0&#39; = p Wert &lt;0,0001, DopR f02676 30 &#39;im Vergleich zu DopR f02676 0&#39; = p Wert &lt;0,0001). DopR- Fliegen fehlt ebenso wie WT-Tiere ( DopR f02676 30 &#39;im Vergleich zu + / + 30&#39; = p-Wert &lt;0,001). Die akute Abstaubung jedes Genotyps bei 0 &#39;führt zu einer gleichwertigen Ansammlung von Staub (ns = nicht signifikant). ( B, d, f ) Für jeden Genotyp wird ein Grooming-Prozent-Unterschied berechnet (Farbstoff-Akkumulär bei 0 &#39;- Farbstoff bei 30&#39; / Farbstoff-Akkumulierung 0 &#39;x 100), was einen relativen Wert für den Vergleich von Groomverhalten bietet. ( C ) DopR attp / DopR <su<html> P&gt; attp nullfliegen zeigen ein Grooming Defizit (DopR Attp 30 &#39;im Vergleich zu + / + 30&#39; p Wert &lt;0,0001). ( D ) Grooming Prozent Unterschied für DopR attp null. ( C, d ) n = 45 fliegt für jeden Genotyp oder Zustand. E) Rut 1 homozygote Fliegen zeigen ein Grooming Defizit (Rut 1 30 &#39;im Vergleich zu + / + 30&#39;, p Wert = &lt;0,0001). F) Grooming Index für Rut 1 Fliegen. ( E, f ) n = 30 fliegt für jeden Genotyp oder Zustand. Statistische Analysen auf einfache Weise ANOVA und Bonferonni Korrektur. Nachgedruckt mit Erlaubnis von Genes, Gehirn und Verhalten 15 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55231/55231fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> G4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4: Dopamin-Rezeptor-Funktion Potentiates Hindleg Grooming. ( A ) Grooming der einzelnen Regionen von WT (blau) und DopR f02676 / DopR f02676 (rot) gemessen nach 30 min nach dem Stauben und anschließender Dissektion. P-Wert für Flügelpflegen = 0,0204. P-Wert für Körper = 0,0302. N = 33-35 fliegt für alle Bedingungen. SEM wird für jeden Genotyp und Zustand gemessen. Statistische Analyse durch Einweg-ANOVA und Bonferonni Korrektur. Nachgedruckt mit Erlaubnis von Genes, Gehirn und Verhalten 15 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55231/55231fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ergänzende Abbildung: Alternative Methode zur visuellen Quantifizierung des Grooming-Verhaltens mit NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualisierung von wilDtyp Drosophila unter Sezierbereich. Oval definiert dorsalen Abdomen als Bereich der Analyse für Pixel-Intensität. ( B ) Visualisierung des Dorsalabdoms nach dem Stauben mit Ultra Green V10 fluoreszierendem Pigment. Standardfilter für grüne Fluoreszenz fängt das blau-grüne Pigment ein. ( C ) WT-Tier nach dem Beschichten mit UGV10-Pigment (Vorgasse). ( E ) WT Tier nach dem Beschichten mit UGV10 Pigment (postgrooming). ( D ) DopRf02676 homozygote Mutante nach dem Beschichten mit UGV10-Pigment (Pregrooming). ( F ) DopRf02676 homozygote Mutante nach dem Beschichten mit UGV10-Pigment (Nach-Grooming). ( G ) Quantifizierung der Pixelintensität für alle Bedingungen. N = 15 fliegt für jeden Genotyp oder Zustand. Statistische Analysen auf einfache Weise ANOVA und Bonferonni Korrektur. Ns = nicht signifikanter Unterschied *** steht für p &lt;0,001. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55231/55231Supplemenal_Groom_JoVE.pdf">Pl</a>Klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Drosophila Grooming Behavior at JoVE.com

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare individuelle Grooming-Assay-Technik in Drosophila , die robuste, quantitative Daten liefert, um das Groomverhalten zu messen. Die Methode basiert auf dem Vergleich der Unterschied in der Farbstoff-Akkumulation auf die Körper von ungezügelten versus gepflegten Tiere über einen festgelegten Zeitraum.

Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

quantification-of-drosophila-grooming-behavior

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K Aufrufe.  Williams College.  Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare individuelle Grooming-Assay-Technik in Drosophila , die robuste, quantitative Daten liefert, um das Groomverhalten zu messen. Die Methode basiert auf dem Vergleich der Unterschied in der Farbstoff-Akkumulation auf die Körper von ungezügelten versus gepflegten Tiere über einen festgelegten Zeitraum. 

Serie: Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Einfache Assay zur Quantifizierung von Sozialvermeidung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...