Wir danken Daniel Veit für technische Hilfe und Pedro Gouveia am Electricidade Em Po (electricidadeempo.net) für die Anpassung der Tracking-Software für unsere Anforderungen. Wir danken auch Tom Retzke für die Unterstützung während der Dreharbeiten. Diese Studie wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.

Der Aufbau und die technischen Details der Flywalk habe an anderer Stelle 26 (im Falle von Problemen der Gründung dieser Einrichtung, weitere Informationen erhalten Sie von MK erhalten werden) beschrieben worden. Hier konzentrieren wir uns auf detaillierte Anweisungen für den Umgang mit dem Paradigma, das hilft, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten wird. 1. Fly Handhabung <ol><li> Rück fliegt in niedriger bis mittlerer Dichte Kulturen auf Nahrungsmedium 27 unter einem 12 Stunden: 12 Stunden Licht: dark-Regime bei 23-25 ​​° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit. Zu diesem Zweck lassen 20-30 neu entstandenen erwachsenen Fliegen in einem großen Lebensmittelfläschchen für 1 Woche zu reproduzieren und wirf dann erwachsenen Fliegen und warten Nachkommen entstehen. </li><li> Sammeln Sie 30 bis 40 neu entstandenen (Alter &lt;24 h) erwachsenen Fliegen und Alter sie auf in neue ein Gefäß Nahrungsmedium 27 für 3-5 Tage. </li><li> Vierundzwanzig Stunden vor dem Start des Verhaltensexperiment: Übertragen Sie alle 30-40 zuvor gesammelten 3-5 d alt (siehe 2.2) fliegt zu einem neuen vial, die eine feuchte Schaumgummi-Stecker oder ein feuchtes Tissue-Papier unter Verwendung eines Gebläses. HINWEIS: betäuben Nicht Fliegen mit CO 2. </li></ol> 2. Herstellung des Flywalk Einrichtungs <ol><li> Verwenden Sie 250 ml Flaschen als Luftbefeuchter. Füllen Luftbefeuchter mit 100 ml destilliertem Wasser. </li><li> Bereiten Geruchsdurchstechflaschen. <ol><li> Vorzubereiten 500 ul 10 -3 Verdünnungen der reinen Geruchs Ethylacetat, Ethylbutyrat, Isopentylacetat und 2,3-Butandion in dem Lösungsmittel Mineralöl. </li><li> Befestigen Sie zwei Kugelventile pro Geruch Fläschchen. Beachten Sie, dass Rückschlagventile erlauben nur unidirektionale Luftstrom. Daher verbinden Rückschlagventile in der Weise, dass Luft in das Fläschchen auf einer Seite eingeben und lassen Sie es auf der anderen Seite. </li><li> Entfernen Sie den Deckel von einem 200 &amp; mgr; l PCR-Reaktionsgefäß. Je 100 &amp; mgr; l von jedem Geruch Verdünnung in einem separaten Reaktionsrohr und legen Sie die Röhrchen in getrennte Geruchsdurchstechflaschen. Auch bereiten einen Geruch Ampulle, die nur das Lösungsmittel mineral oil. </li><li> Dicht verschließen Geruch Fläschchen durch Schließen sie mit Edelstahl-Steckern und Gummidichtungen. </li><li> Schließen Sie die 5 Geruchsfläschchen (4 enthält, Gerüche und 1, die Mineralöl), um den Geruch Delivery-System. Achten Sie darauf, sie in die richtige Durchflussrichtung zu verbinden. Ein Falschanschluss wird nicht nur beeinträchtigen die geplanten Experiment, aber es kann auch verunreinigen das Liefersystem. </li></ol></li><li> Dichtheit prüfen durch Abdichten der Auslass der Mischkammer des Stimulus-Gerät. Stellen Sie sicher, dass alle Luftströme vor dem Stimulus-Gerät nun schrittweise bis auf Null sinken. Wenn nicht, auf Dichtheit prüfen, die nun durch die zischendes Geräusch von Luft, die aus dem System identifiziert werden können. </li><li> Sorgfältig über 15 Einzel Fliegen zu 15 einzelnen Glasröhrchen unter Verwendung eines Gebläses und in der Nähe Glasröhren auf beiden Seiten mit den entsprechenden Adaptern. Hinweis: Da das System muss hermetisch für erfolgreiche Experimente abgedichtet werden, sicherzustellen, dass Adapter passen Glasröhrchen festund beachten Sie, dass Glasröhrchen können bei diesem Schritt zu brechen. Achten Sie darauf, um Verletzungen von Schutzhandschuhen und Schutzbrillen tragen zu vermeiden. </li><li> Schließen Sie die Glasrohre an den Flywalk und Setup, von hier aus, warten Sie mindestens 15 Minuten vor dem Start des Experiments, damit Fliegen um an die neue Umgebung zu gewöhnen. </li><li> Nach dem Anbringen Glasröhren: überprüfen Sie das Auslesen der nachgeschalteten digitalen Durchflussmesser auf dem Computer 1, wenn die Luftströme 16, nachdem die Glasröhren summieren sich zu dem Luftstrom in das System gelangen. Sie können auch auf Computer 1, wenn die Luftfeuchtigkeit zwischen 60% und 80%. </li><li> Design Stimulusprotokoll Steuern der Reihenfolge und den Zeitpunkt von Geruchsreize den Fliegen dargestellt. Um beispielsweise den beschriebenen, vorliegenden 4 Gerüche und der Steuerung (Mineralöl) einzeln und alle möglichen ternären und quaternären Mischungen der Gerüche gleichzeitig 40mal jeweils erhalten. Stellen Impulsdauer auf 500 ms bei einem Interstimulusintervall von 90 sec und randomisieren Reizfolge. </li><li> Schalten Sie den light Quelle (LED-Cluster; λ = 630). Achten Sie darauf, genügend Licht für ein effizientes Tracking ohne Erhöhung der Temperatur im Inneren der Glasröhren bereitzustellen. </li><li> Einen interessierenden Bereich des Verfolgungssystems durch Ziehen eines Rahmens über die Fläche in einer solchen Weise, dass alle 15 Glasrohre enthalten überwacht und etwa 5 mm von den Kanten der Rohre sind ausgeschlossen eingestellt. </li><li> Bis 14 parallele Trennlinien zwischen den einzelnen Rohren in dem Verfolgungssystem durch Änderung der Y-Position in der dazugehörigen Skript einzelne Halten gesetzt fliegt während des gesamten Versuchs erkennbar. Achten Sie darauf, um sie so zu positionieren, dass es immer ein Glasrohr zwischen zwei solchen Trennlinien, da nur eine Fliege zwischen jedem Satz von zwei Linien verfolgt werden. </li><li> Achten Sie darauf, Kameraparameter in einer Weise, die zuverlässig in den Glasröhren Verfolgt werden fliegt gesetzt. Wenn Fliegen werden an den Rändern der Region von Interesse verloren, erhöhen die Helligkeit oder die Verstärkung des Tracking-software. Vermeidung von mechanischen Schwingungen des Verfolgungssystems. Verfolgen Sie mit Hilfe kommerzieller Software nach Herstellerprotokoll. </li><li> Starten Experiment durch Starten des Stimulus-Protokoll. Nehmen flies&#39; XY-Koordinaten bei 20 fps (Bilder pro Sekunde) und melden Sie sich in Verbindung mit dem Geruch Ventilstatus in Textdateien. </li></ol> 3. Datenanalyse Hinweis: die folgenden Schritte in der Datenanalyse werden automatisiert mit speziell geschriebenen Routinen in R. programmiert Da diese Schritte sind entscheidend, um aussagekräftige Ergebnisse der Analyse wird jedoch in einer Schritt-für-Schritt-Weise präsentiert zu bekommen. Die Rohdaten für die Analyse sind CSV-Dateien, die synchronisiert Informationen zu Geruchsventilstatus, Impulszahl in dem Experiment und 15 fly x-Positionen in cm auf einer gemeinsamen Zeitachse für einen Geruchsstimulationszyklus. Benutzerdefinierten Code für die Datenanalyse können auf Anfrage bereitgestellt werden. <ol><li> Offene .csv-Datei zu finden Zeitpunkt der Ventilöffnung durch einen cha bezeichnetnge in der Spalte, die die Ventilstatus. </li><li> Berechnung der linearen Funktion der Geruchs Position der Form f (t) = s * t + i wobei t die Zeit in der Stimulationszyklus, s die Windgeschwindigkeit (hier 20 cm / sec) und der Schnittpunkt i kann unter Verwendung der Zeit-Punkt der Geruch an der Position 0 (Ventilöffnung sowie Delay) tritt in die Rohre berechnet werden. </li><li> Finden Sie den Zeitpunkt, an dem Geruch und Fliegen x-Position schneiden für jeden fliegen und setzen Sie diesen Zeitpunkt auf 0. Hinweis: Auf diese Weise fly Positionen werden zu jedem individual&#39;s ausgerichtet Begegnung mit dem Geruch. </li><li> Fliegen sitzen an den sehr Ränder der Region von Interesse auszuschließen. </li><li> Berechnen Geschwindigkeit von X-Positionen durch Dividieren Verschiebung entlang der x-Achse durch das Zeitintervall (100 ms) und Prozedur für jedes Stimulationszyklus. </li><li> Um die Geschwindigkeit der Zeit-Kurse wie in 2E gezeigt, zu erhalten berechnen mittlere Geschwindigkeit der Zeitverlauf für jede Fliege und Geruch und von denen die mittlere Zeit-Kurs für einen bestimmten Geruch. </li><li> Netto Verschiebung, wie in 3C gezeigt, zu erhalten berechnen die Nettoverschiebung innerhalb von 4 Sekunden nach der Geruchsimpuls für jeden Tracking-Ereignis und anschließend die mittlere Nettoverschiebung pro Fliege und Geruch. </li></ol> 4. Reinigungsverfahren <ol><li> Saubere Glas-Tubes <ol><li> Fliegen und Adapter Remove von Glasröhren und genießen Glasröhren in Reinigungsmittel. </li><li> Glasröhrchen unter fließendem destilliertem Wasser und trocknen Sie sie mit Druckluft. </li><li> Wärmeglasröhrchen bei 200 ° C für 8 h. </li></ol></li><li> Saubere Geruch Delivery System <ol><li> Entfernen Sie alle Geruchs Fläschchen und Schläuche von der zentralen Mischkammer. </li><li> Entfernen Schlauch-Adapter aus der Mischkammer. </li><li> Sauberen Mischkammer durch Spülung mit Laborreinigungslösung und Lösungsmittel (zB Ethanol, Aceton). Führen Sie diese Schritte unter dem Laborabzug. </li><li> Trockenmischkammer mit Druckluft und erhitzen auf 200 ° C für 8 h. </li></ol></li><li> Saubere Geruch Vials und Rückschlagventile <ol><li> Entfernen Stahlstecker (Discard Gummidichtung) und Rückschlagventile aus Phiolen Geruch und genießen Sie alle Komponenten im Laborreinigungslösung. </li><li> Beschallen Komponenten in einem Ultraschallbad und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser. </li><li> Reinigen Sie alle Komponenten außer Rückschlagventile mit Ethanol und Aceton. Führen Sie diese Schritte unter dem Laborabzug. </li><li> Trockenen Komponenten unter Verwendung von Druckluft und erhitzen auf 200 ° C für 8 h. </li><li> Sauber Rückschlagventile auf der Innenseite durch Spülen sie mit Ethanol und Aceton mit einer Spritze (berücksichtigen Flussrichtung). Führen Sie diese Schritte unter dem Laborabzug tragen Laborschutzbrille tragen. Da Aceton greift Gummiteile, sofort trocken Rückschlagventile durch Spülen sie mit Druckluft. </li><li> Rückstände von Gerüchen durch Pulsen Luft durch Rückschlagventile für mehrere Tage. Verwenden Sie einen Brutschrank bei 60 ° C und einer 1 sec Luft auf / 1 Sekunde Luft off-Regimes für diese Reinigungsschritt. </li></ol&gt; </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Obwohl die Flywalk System auf den ersten Blick eher anspruchsvoll erscheint, einmal eingerichtet und es läuft ist einfach zu bedienen und erzeugt sehr robuste Ergebnisse. Um die Konsistenz der Ergebnisse mit der Biotest produziert betonen, kann man sagen, dass die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse wurden fast 2 Jahren, nachdem einige der in einer früheren Studie 29 mit einem modifizierten Setup mit einer neuen Tracking-Software und Lichtquelle gezeigten Ergebnisse erhalten werden. Dennoch sind die Lockmittel Antworten - trotz leicht höheren Antwortamplituden - ähnlich den bereits veröffentlichten hinsichtlich ihrer Dynamik. Es gibt einige kritische Aspekte, die insbesondere, um qualitativ hochwertige Ergebnisse mit Flywalk erhalten berücksichtigt werden sollten. Wichtig ist, dass Feuchtigkeit nicht weniger als 60% im Verlauf eines Experiments sinken. Eine typische experimentelle Sitzung dauert ca. 8 Stunden. Vernünftigerweise große weibliche CS Wildtyp-Fliegen für 24 Stunden ausgehungert vor dem Ex-Experiment leicht für mindestens 12 h in der Versuchsanordnung vorgesehen Feuchtigkeit überleben hoch genug ist. Um Probleme im Zusammenhang mit der Feuchtigkeit ist es ratsam, einen Feuchtigkeitssensor in einem leeren Glasrohr (1B) zu installieren und zu vermeiden, dass Durchflussregler im Luftstrom überall zwischen Luftbefeuchter und Glasrohren zu vermeiden. Es ist auch für die Qualität der Daten, die das System hermetisch verschlossen ist unbedingt erforderlich. Die Luftströme das System verlassen, nachdem die Glasrohre sollten zusammenfassen, um den Luftstrom in das System gelangen. Ensten Experimente zu Undichtigkeiten im System und große Sorgfalt geboten, bevor der Beginn des Experiments, um sicherzustellen, dass das System luftdicht sein, zugeschrieben werden. Schließlich wird, wie mit jedem Setup in der Geruchsforschung verwendet wird, ist eines der wichtigsten Alltagsfragen, um eine Kontamination zu vermeiden. Die meisten der Teile in Kontakt mit den Gerüchen aus Glas, Stahl, Teflon oder PEEK gefertigt und kann daher bis zu mindestens 200 ° C, die ausreicht, um die meisten O zu entfernen, ist erwärmendendors ausgenommen solche mit besonders hohen Siedepunkten wie langkettige Pheromone. Weil Rückschlagventile enthalten, Gummiteile können sie nicht so hoch erhitzt werden und sind daher die Hauptquelle der Verunreinigung, weshalb eine bestimmte Reinigungsprotokoll wurde für sie ausgedacht. Dennoch ist es ratsam, den Überblick über die Gerüche eine bestimmte Rückschlagventil ist in Kontakt kommen zu halten. In Zweifelsfällen über seine Sauberkeit zu ersetzen. Als Kompromiß zwischen tethered Assays und Kohorten Experimenten hat Flywalk natürlich auch einige Nachteile im Vergleich zu anderen Methoden. Das Paradigma ist sehr effizient, wenn das Verhalten gegenüber einer Vielzahl unterschiedlicher Reize wurde bewertet und verglichen werden. Bemerkenswert ist, weil die Reaktionszeit-Kurs mit 15 Personen, nur einen Impuls von einem bestimmten Geruch erinnert stark Antwortzeit-Kurse in einem vollen Datensatz erhalten (dh 30 Fliegen und 40 Präsentationen jeweils; Figuren 2D, 2E </strOng&gt;), kann es möglich sein, die Anzahl der verschiedenen Stimuli in einem gegebenen Experiment stellte weiter steigern durch die Verwendung verschiedener Stimulationsmethoden, wie beispielsweise dem Verbinden der Anlage mit einem Gaschromatographen. Wegen der Dauer der experimentellen Sitzung nur ein Experiment ist jedoch möglich, pro Tag und einem gegebenen Experiment sollte mindestens einmal wiederholt, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Daher Trap-Assay oder T-Labyrinth sind effizienter, wenn zB die hedonischen Wertigkeit von nur einem Geruch geprüft werden muss. Außerdem ist die zeitliche Auflösung von visuellen Verfolgungssysteme häufig niedriger als die des am schnellsten Biotests wie Fesselflug oder Laufband. Die kürzeste Reaktions Verzögerungen bei Drosophila geruchs geführte Verhalten berichtet, liegen deutlich unter 100 ms nach dem Geruch Begegnung in tethered Paradigmen 20,23 und damit innerhalb eines Zeitfensters, die nicht bei der Analyse der Daten bei 10 Hz aufgelöst werden kann sinken. Allerdings Lockstoff Antworten in Flywalk beginnen in der Regel innerhalb der ersten 100-300ms (3B), die auch im Einklang mit den in frei fliegende Fliegen 5 beobachtet upwind Stoß Verzögerungen ist. Es bleibt daher zu prüfen, ob dieser Unterschied in der Reaktion Verzögerungen bei angebundenen Paradigmen im Vergleich zu Windkanal und Flywalk wird durch Unterschiede in der räumlichen und / oder zeitlichen Auflösung in der visuellen Tracking Paradigmen oder durch eine höhere Erregungszustand von Fliegen in der Fessel Situation verursacht werden. Zusammenfassend ist Flywalk ein No-Wahl-Bioassay, der die stark kontrollierten Reizdarbietung angebundener Assays mit der Effizienz der Kohorte Experimenten regelmäßig in Drosophila Neuroethologie verwendet verbindet. Da der gleiche Satz von Einzelpersonen können mit einer Vielzahl von verschiedenen Stimuli in Frage gestellt werden, liegt seine besondere Stärke in der statistischen Power bei einem Vergleich die Reaktionen gegenüber verschiedenen Reizen. Darüber hinaus nutzt es die Tatsache, dass Überspannungs fliegt gegen den Wind auf Begegnung eines attraktiven Geruch und auf diese Weise entkoppelt GeruchsbewertungGeruchsquelle Lokalisierung ohne die Notwendigkeit eines Gradienten als Richt Stichwort. Es sollte daher ideal geeignet, um die optogenetische Toolbox in Drosophila zu nutzen.

Das übergeordnete Ziel einer jeden neuroethologischen Forschung ist es, einen ursächlichen Zusammenhang zwischen den Aktivitätszuständen einzelner Neuronen oder neuronalen Schaltkreisen und dem Verhalten eines Organismus etablieren. Um dieses Ziel zu erreichen, die neuronale Aktivität und Verhalten sollte unter identischen Reizbedingungen überwacht werden und diese Reizbedingungen sollten idealerweise ähnlich denen das Nervensystem auf dem Prüfstand entwickelt, um Sinn zu machen. Besonders, wenn es um Verhaltens Biotests kommt, haben diese Anforderungen historisch in Drosophila melanogaster als recht anspruchs olfaktorischen Neuroethologie. Einmal von der Quelle freigesetzt, Geruchswolken rasch zerfallen in dünne Filamente mit turbulente Diffusion durch Luftbewegung ist der wichtigste Faktor für die Geruchsverteilung 1 verursacht. Als Ergebnis wurde ein Insekten Navigieren zu einer Geruchsquelle erfährt intermittierende Stimulation mit Geruchs Paketen mit variablen Abständen von Reinluft durchsetzt. BeideFuß und fliegenden Insekten - einschließlich Drosophila - wurde gezeigt, dass diese intermittierende Stimulationsregime für die Navigation durch die nach plume Begegnung wogenden gegen den Wind und vor allem bewegte Seitenwind in der Abwesenheit von Gerüchen 2 nutzen - 5. Der Erwägung, dass die Stimulation Verfahren in physiologischen Experimenten weitgehend imitieren die ein Insekt kann in seiner natürlichen Umgebung entweder durch Bereitstellung von einzelnen Zügen von Gerüchen mit längerer saubere Luft oder dynamische Stimulationssequenzen 6 durchsetzt erleben - 11, viele Verhaltens Biotests in Drosophila Neuroethologie verwendet wie Trap-Assay , Open-field-Arenen oder T-Labyrinth verlassen sich auf geruchs Gradienten 12-15. Da jedoch Geruchs Gradienten definitions sind variabel in Konzentration in Abhängigkeit vom Abstand von der Geruchsquelle, ein bestimmtes Verhalten nicht auf eine genaue Geruchskonzentration unter Verwendung dieser Paradigmen zurückzuführen. Darüber hinaus ist die Steigung derein Geruch Gradienten kritisch, hängt von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Geruchsstoff. Ein Gradient von einem sehr volatilen Verbindung wird flacher als die von einer weniger flüchtigen Verbindung und damit auch schwieriger für einen Organismus unter Berufung auf Messen Konzentrationsunterschiede im Raum als das einzige Mittel der Navigation 16 zu verfolgen - 20, was zu einer Fehlinterpretationen führen kann der Geruchspräferenzen insbesondere in Wahl-Assays. Dieser Effekt ist auch sehr nachteilig bei der Untersuchung von Verhalten gegenüber Geruchsmischungen, da sie zu unterschiedlichen Mischungskomponente Verhältnisse an jedem Punkt im Raum und damit wieder schließt eine klare Korrelation zwischen Physiologie und Verhalten. Während Fruchtfliegen sind in der Regel auf gärenden Früchten aggregieren, sind sie einsam in ihrer Navigation in Richtung Nahrungsquellen und Eiablage Websites. Dennoch in Drosophila neuroetholo verwendet, anstatt die Prüfung einzelner Tiere viele Verhaltensparadigmengy prüft die Art der Duft Verhalten Kohorten von Fliegen und Anziehung als die Fraktion von Fliegen Wahl der Geruch über einen Steuer Stimulus erzielt. Diese Kohorte Experimente haben wesentlich zum Verständnis der Fliege Neuroethologie beigetragen und viele der Beobachtungen durch Verwendung von diesen hergestellt könnte in Einzel fly Experimenten bestätigt werden. Allerdings hat sich gezeigt, daß sich gegen other&#39;s Entscheidung 21 beeinflussen und im Extremfall die Auswertung eines Geruchs aus Gleichgültigkeit wechseln je nach Bevölkerungsdichte 22 bis Vermeidung fliegt. Zusätzlich ergibt sich aus dieser Art von Experimenten bieten oft nur den Endpunkt einer Abfolge von Verhaltensentscheidungen anstatt zu beobachten, was die Flug tut, während sie es tut, was wünschenswert wäre, wenn versucht wird, das Verhalten, die mit neuronaler Aktivität korrelieren. Diese eher niedriger Auflösung Kohorten Experimente werden durch hochauflösende Single-fly Methoden wie Fesselflug Arenen und Laufbänder, die erlauben, gegenübergestelltfür eine direkte Beobachtung der Verhaltensreaktion zum Zeitpunkt der dargeboten wird, 20,23,24. Dennoch sind Kohorten Versuche immer noch beliebt, denn sie sind sehr effizient und bieten robuste Ergebnisse auch bei vergleichsweise geringen Stichprobengrößen, weil interindividuelle und interTestVariabilität sind teilweise sich durch die Beobachtung von Populationen über einen längeren Zeitraum gemittelt. Während Fesselflug und Laufband wahrscheinlich bieten die Goldstandard zur Reizdarbietung und zeitlicher Auflösung, die verwendeten Arenen für Einzeltiere konzipiert und daher zeitaufwändig, zu erhalten Probengrößen, die für eine statistische Analyse ist. Mehrere andere Ansätze wurden kürzlich entwickelt, dass eine effiziente Übernahme von hochauflösenden Verhaltensdaten in Kombination mit einem gut definierten Stimulus-Regime zu ermöglichen. Dazu gehören unbeaufsichtigt 3D-Verfolgung mehrerer Fruchtfliegen in einem Windkanal in Kombination mit einer genauen 3D-Modell der Geruchsfahne 5 </sup&gt;, Verfolgung mehrerer Einzel Fliegen in Wahl Kammern mit Luftströmen von beiden Seiten 25 und der Flywalk Paradigmen 26 zugeführt. In Flywalk werden 15 einzelne Fliegen in Glasröhrchen entfernt und kontinuierlich von einem Overhead-Kamera unter Rotlichtbedingungen überwacht. Gerüche zu einem kontinuierlichen Luftstrom von 20 cm / s aufgenommen und wandern durch den Glasrohren mit einer konstanten Geschwindigkeit. Der Luftstrom wird durch Hindurchleiten durch 250 ml-Flaschen vor dem Eintritt in den Geruch Abgabesystem destilliertem Wasser (Befeuchter) enthält befeuchtet. Die flies&#39; Positionen innerhalb eines quadratischen Bereichs von Interesse (ROI) umfassende Großteil der Länge der Geruchsrohre (aber ohne die Außenränder der Rohre (etwa 5 mm auf jeder Seite), wobei die Fliegen nicht weiter aufwärts bewegen oder aufgezeichneten Windrichtung) um die Zeit der Geruch Präsentation (1A, B). Fliegen Identitäten werden durch das Trackingsystem t konstant gehalten wirdberall das Experiment auf der Grundlage der Y-Positionen (dh ihre Glasrohr Grenzen). Geruchsstimulation unter Verwendung eines Mehrkomponenten-Reizeinrichtung, welche die Darstellung von bis zu 8 Einzel Gerüche und alle möglichen Mischungen davon 26,29 (1B) können erreicht werden. Der Verlauf eines Experiments wird von einem Computer zur Regelung der Geruchsabgabesystems und zur Temperatur und Feuchtigkeitsinformation (Computer 1, 1C) gesteuert werden. Dieser Computer steuert auch einen Datenlogger (Aufnahme starten / stoppen) auf einem zweiten Computer, der kontinuierlich verfolgt fly Positionen bei 20 Frames pro Sekunde (Computer 2). Fliegen Positionen, Geruch Ventilstatus (dh Zeitpunkt der Ventilöffnung), Geruch ID, Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Umgebung von Geruchsstimulationszyklen auf Computer 2. Auf diese Weise Informationen über Geruchsloggt und fliegen Positionen synchronisiert und als .csv-Dateien exportiert die weiter verarbeitet werden und mit Hilfe speziell geschriebenen Analyseroutinen analysiert. weildas ganze System computergesteuert ist, ist keine menschliche Intervention während einer experimentellen Sitzung notwendig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="866">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flywalk setup</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:207px;">details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stimulus device</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED cluster</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HD Pro Webcam C920</td>
			<td style="width:325px;">Logitech, Lausanne, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 Computers</td>
			<td style="width:325px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Flywalk Reloaded v1.0 software</td>
			<td style="width:325px;">Electricidade Em P&#243; (electricidadeempo.net)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labview 11.0 software</td>
			<td style="width:325px;">National Instruments, Austin, TX</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly food</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">aspirator</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mineral oil</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">odors</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">200 &#181;l PCR reaction tubes</td>
			<td style="width:325px;">Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution quantification of odor-guided behavior in drosophila melanogaster using the flywalk paradigm

In ihrer natürlichen Umgebung, Insekten wie der Essig Drosophila melanogaster sind mit einer riesigen Menge an chemisch verschiedenen Geruchsstoffen bombardiert. Um die Sache noch weiter zu komplizieren, die von der Insektennervensystems erkannt Gerüche in der Regel nicht einzelne Verbindungen, sondern Gemische, deren Zusammensetzung und Konzentrationsverhältnisse variieren. Dies führt zu einer nahezu unbegrenzten Anzahl unterschiedlicher olfaktorischer Stimuli, die durch das Nervensystem untersucht werden müssen. Zu verstehen, welche Aspekte eines Geruchsreiz bestimmen dessen Auswertung durch die Fliege, ist es daher wünschenswert, geruchs geführt Verhalten gegenüber vielen Riechstoffe und Geruchsmischungen effizient überprüft werden. Um Verhalten neuronaler Aktivität direkt korrelieren, sollte das Verhalten in einem vergleichbaren Zeitrahmen und unter identischen Stimulus Bedingungen wie in neurophysiologischen Experimenten quantifiziert werden. Viele derzeit verwendete Geruchs Biotests in Drosophila Neuroethologie sind jedoch eher specialized entweder in Richtung Effizienz oder zur Auflösung. Flywalk, ein automatisiertes Geruchs Lieferung und Tracking-System, schließt die Lücke zwischen Effizienz und Auflösung. Es ermöglicht die Bestimmung, wann genau ein Geruch Paket stimuliert ein frei herumlaufenden Fliege und die animal&#39;s bestimmen dynamische Verhaltensreaktion.

Wegen entfernt sind erlaubt, sich frei in ihrem Glasröhrchen zwischen Geruchsimpulse und der Geruch Impuls wandert durch den Glasrohren verteilen mit einer konstanten Geschwindigkeit fliegt begegnen, den Geruch zu unterschiedlichen Zeitpunkten je nach ihrer x-Position zum Zeitpunkt der Stimulation. Als Ergebnis werden die Onsets der Aufwind Trajektorien durch eine 500 ms Impuls von einem attraktiven 10 -3 Verdünnung Ethylacetat hervorgerufen werden, indem etwa 1 sec für Fliegen an der Lee Ende der Glasrohre im Vergleich zu denen von Fliegen sitzt näher verzögert die gegen den Wind Ende bei einer Windgeschwindigkeit von 20 cm / s und 20 cm Glasrohrlänge (Abbildung 2A). Korrektur der zeitlichen Differenz des Geruchs Begegnung für jedes Individuum auf der Grundlage seiner x-Position bei der Geruchs Darstellung zeigt, dass die Reaktion verzögert gegen Ethylacetat konsistent Individuen (2B) sind. Entsprechend ist die durchschnittliche Flugbahn gegen den Wind, ohne Korrektur für odor Reise um ca. 0,5 s verzögert im Vergleich zur durchschnittlichen Trajektorie mit Korrektur (2C, beachten Sie, dass die Korrektur für die Zeit der Geruch muss die Aufwind Ende der Glasrohre wurde für beide Bahnen durchgeführt geben). Darüber hinaus ist die korrigierte mittlere Flugbahn gegen den Wind für einen einzigen Geruchsimpuls zeigt auch eine steilere Neigung (dh eine höhere Laufgeschwindigkeit) als die nicht korrigierten einer (2D). Ähnlich wie bei den Beobachtungen für einen einzigen Geruchsimpuls, Weglassen der Korrektur für Geruchs Reise führt zu einer erhöhten Verzögerung und geringere Antwortamplitude in einem kompletten Datensatz aus zwei experimentellen Sessions (dh 30 entfernt) mit 40 Präsentationen von Geruchsimpulse jeweils (2E) . Wiederholte Stimulierung mit 500 ms Impulsen attraktiver 10 -3 Verdünnungen von Ethylbutyrat (ETB), Isopentylacetat (IAA), Ethylacetat (ETA) und 2,3-Butandion (bedn) auslöst upwind Stöße auf ododer Begegnung in verhungert weibliche Fliegen, während der Stimulation mit dem Lösungsmittel Mineralöl (MOL) evoziert keine oder nur schwache Reaktionen. Mechanische Stimulation allein wurde bereits gezeigt, eine erhöhte Bewegung in ähnlicher Paradigma 28 induzieren. Da jedoch Geruchsstimulation im Flywalk Paradigma hat Gesamtluftstrom nicht verändern und erhöhte Bewegung ist vor allem in der Kontrollsituation mit MOL nicht vorhanden, diese gegen den Wind Stöße reflektieren wahre Geruchsantworten. Mittlere Antwortzeit-Kurse werden für Einzelpersonen (3A) und geruchsspezifischen in-Latenz stereotype, Amplitude und Dauer (3A, B). Responses to Ethylacetat zeigen einen scharfen Angriff, hoher Amplitude und kurzer Dauer. Im Gegensatz dazu Antworten auf 2,3-Butan zeigen typischerweise einen etwas späteren Beginn, eine geringere Amplitude und eine längere Dauer. Ethylbutyrat und Isopentylacetat hervorrufen ähnliche zeitliche Dynamik wie Ethylacetat, sondern Reaktionen niedriger Amplitude. Entspresprechend, alle 4 Gerüche zu entlocken eine höhere upwind Verschiebung innerhalb von 4 Sekunden nach Geruch Begegnung als das Lösungsmittel und Negativkontrolle Mineralöl (3C). Unter Verwendung der gleichen 4 Lockstoffen, wurde bereits gezeigt, dass binäre Mischungen von Lockstoffe sind mindestens so attraktiv wie die Attraktivität Mischungsbestandteil 29. Hier wird diese Beobachtung durch die Prüfung aller möglichen ternären Gemischen und die vollständige Mischung aus allen 4 Lockstoffe erweitert. Ähnlich wie bei der vorherigen Beobachtung mit binären Mischungen, alle diese komplexer Mischungen sind mindestens so attraktiv wie der attraktivsten Einzelverbindung (4A). Die attraktivsten Gemische sind jene, die sowohl Ethylacetat und 2,3-Butandion. Antworten auf diese 3-Mischungen unterscheiden sich nicht wesentlich voneinander und auch die Antwort Kinetik auffallend ähnlich (4A, B). Demgegenüber Weglassen Ethylacetat aus dem vollen blend führt zu einer Abnahme der maximalen Aufwindgeschwindigkeit unter Weglassung 2,3-Butan verkürzt die Reaktions (4C). Weil Ethylacetat entlockt kurzen Hochamplitudengänge der Erwägung, dass 2,3-Butan entlockt Antworten der niedrigeren Amplitude, aber längerer Dauer (3B, 4D), sind diese Beobachtungen erinnert an unsere frühere Feststellung, dass die Antworten der Zeit-Kurse in Richtung Mischungen von Lockstoffen neigen dazu, folgen eine optimale Reaktionszeit-Kurs von Blend Bestandantwortzeit-Kursen 29 erstellt. In diesem Datensatz die optimale aller 4 Lockstoffe können auf der Grundlage der Antwortzeit-Gänge Richtung Ethylacetat und 2,3-Butan konstruiert werden. Ethylbutyrat und / oder Isopentylacetat sind zusätzlich notwendig, die in den Antworten auf die vollständige Mischung (4D) beobachtete maximale Schrittgeschwindigkeit zu erreichen. Daher ist die Erhöhung der Komplexität Mischung 2-3 oder 4-Komponenten erhöht die Attraktivität des Gemisches Even weiter als das, was von der vorherigen Beobachtung zu erwarten, dass die Antworten in Richtung Mischungen von Lockstoffen stellen ein Optimum der Antworten gegenMischungsBestandTeile. Dennoch bleibt die allgemeine Schlussfolgerung, dass Bestandteil Valenz Geruchsmischungen erhalten für diese komplexere Mischungen 29 gültig. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53394/53394fig1.jpg" /> Abbildung 1. Prinzip und das Layout der Flywalk Setup. (A) Schematische Darstellung des Prinzips. Gelbes Quadrat: Geruchsreiz Bewegen durch das Rohr und was gegen den Wind Bewegung der Fliege; schwarzes Objekt: Kamera auf Verhaltensreaktionen zu verfolgen. (B) Schematische Darstellung des Luftstroms durch den Aufbau mit Holzkohle-gefilterte Luft wird befeuchtet und zu insgesamt 8 Kanäle, vor dem Eintritt in den Geruch Liefersystem 26,30. Aufblasverhältnis Fig: 1, drei-Wege-Magnetventil Pass<html> ing den Luftstrom entweder durch ein leeres Fläschchen (c; Ausgleichsstrom) oder über ein Fläschchen mit dem Geruchsquelle (o; Geruchsfluss); 2, Kugelrückschlagventile den Luftstrom in eine Richtung zu beschränken und Verunreinigungen im System zu vermeiden; Mischkammer: custom-built-Box, dass die Luft aus allen Magnetventilen und Übertragungen sammelt zu spalten-up Bord, wo die Luft für 15 Glasröhrchen mit individuellen Fliegen und 1 Tube mit Temperatur- und Feuchtigkeitssensoren ausgestattet geladen aufgeteilt. Hinweis: Stromregler und Durchflussmesser nach dem Glasröhren garantieren identische Fluss in alle Röhrchen. Blaue Quadrat zeigt den Bereich von Interesse (ROI) des Trackingsystems. (C) Schematische Darstellung des Informationsflusses zwischen den Tracking-Kamera, Tracking-Computer, und Geruchsabgabesystem. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53394/53394fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> oad / 53.394 / 53394fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Verfahren der und Gründe für die Datenanalyse. (A) Einzel fliegt die Begegnung mit dem Geruch an verschiedenen Positionen und daher unterschiedlichen Zeiten. Linkes Bild: Schematische Darstellung der möglichen Flugpositionen zum Zeitpunkt der Geruch Ventilschaltung. Rechts: Rohdaten x-Positionen 15 Fliegen um die Präsentation eines 500 ms Impuls von 10 -3 Verdünnung Ethylacetat. Hinweis gegen den Wind geht einzelner Fliegen zu unterschiedlichen Zeitpunkten in Abhängigkeit von ihrer x-Positionen. Linke gestrichelte Linie: Zeit von Geruchs Ventilschaltung. Geruch Begegnung der einzelnen Fliegen wird durch ein System-Eigenverzögerung verschoben für den Geruch, um die Glasrohre (d) und die Windgeschwindigkeit (w) zu erreichen. Daher wird Geruch Begegnung individuell für jeden fly basierend auf seiner x-Position berechnet. Unten rechts: ausgerichteten x-Positionen der 15 Fliegen (grau) und bedeuten, x-Position (fett schwarz). (B) Gleiche Daten wie in A, aber für die Verzögerung und Windgeschwindigkeit korrigiert. Bottom: ausgerichteten x-Positionen der 15 Fliegen (grau) und bedeuten, X-Position (fett rot) nach der Korrektur. (C) Vergleich der Durchschnitts upwind Fortschritt der 15 Fliegen durch einen 500 ms Impuls von Ethylacetat mit und ohne Korrektur für Geruchsreise ausgelöst. Beachten Sie, dass die unkorrigierte (schwarz) Spur für die Verzögerung korrigiert, aber nicht für die Geruchs Reise. (D) Mittlere Aufwindgeschwindigkeit von 15 Fliegen von einem 500 ms Impuls von Ethylacetat mit und ohne Korrektur für die Geruchsreise ausgelöst. Gestrichelten Linien Geschwindigkeit aus gegen den Wind in C gezeigt Fortschritte Werten berechnet, fette Linien angezeigt Aufwindgeschwindigkeit nach dem Glätten mit einem 1. Ordnung 9-Punkt Savitzky-Golay-Filter. (E) Ungefilterte bedeuten, gegen den Wind Geschwindigkeit mit und ohne Korrektur für Geruchs Reise für 30 Fliegen und 40 Impulse Essigester (dh ein kompletter Datensatz). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53394/53394fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen</a>Abbildung. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53394/53394fig3.jpg" /> . Abbildung 3. Beispiel Antworten für 10 -3 Verdünnungen von 4 attraktive Gerüche (A) Farbkodierte mittlere Antwortzeit-Kurse von 30 einzelnen Fliegen zu 500 msec Pulse von 4 Lockstoffe und das Lösungsmittel Mineralöl (MOL; EtB: Ethylbutyrat; IAA: Isopentylacetat; EtA: Ethylacetat; bedn: 2,3-Butandion). Jede Zeile steht für die mittlere Antwortzeit-Verlauf einer einzelnen Fliege. Jede Fliege wurde mit jeder Geruch für 40-mal und präsentierte - weil Fliegen sind erlaubt, sich frei zu verteilen und kann den Bereich von Interesse des Tracking-System zu verlassen - mittlere Antwortzeit Kurse werden von allen vollständigen Trajektorien pro fly berechnet (n = 7-39 Trajektorien pro Fliege und Geruch). Gelbe Balken stellt die Geruchsimpuls. (B) Reaktionszeit-Kursen um 4 Lockstoffe und das Lösungsmittel Mineralöl (n = 30 entfernt; Mittelwert+/- SEM). (C) gegen den Wind Net Verschiebung innerhalb von 4 Sekunden nach Geruch Begegnung (dieselben Daten wie in (A) und (B), n = 30 entfernt). Gefüllte Kästchen zeigen statistisch signifikante upwind Bewegung im Vergleich zur Negativkontrolle Mineralöl (p &lt;0,05; Wilcoxon-Test). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53394/53394fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53394/53394fig4.jpg" /> Abbildung 4. Antworten Richtung ternären und quaternären Mischungen von Lockstoffen. (A) gegen den Wind Net Verschiebung für 4 Lockstoffe und allen ternären und quaternären Mischungen davon durch ihre mittlere Antwort sortiert. Unterschiedliche Buchstaben zeigen statistisch signifikante Unterschiede zwischen Reaktionen (p &lt;0,05; Kruskal-Wallis Rangsummentest und post hoc Wilcoxon-Test, n = 30fliegt). Unten schwarze Kästchen zeigt Mischungen, die Ethylacetat und 2,3butanedione. (B) Reaktionszeit-Kurse von Mischungen, enthaltend Ethylacetat und 2,3-Butandion (Mittelwert +/- SEM; n = 30 entfernt). Hinweis ähnliche Antwort-Kinetik. (C) Vergleich der Reaktionszeit-Kurse von Mischungen ohne Ethylacetat oder 2,3-Butandion und Antwort Kinetik durch die volle Mischung hervorgerufen (Mittelwert +/- SEM; n = 30 entfernt). Hinweis geringere Amplitude ohne Zulassung und kürzere Reaktions ohne bedn. (D) Vergleich der optimalen Zeitverlauf (gestrichelt) ETA (rot) und bedn (grün) aufgebaut und die vollständige Mischung. Schattierungen zeigen Teile der Zeitverlauf von verschiedenen Mischungsbestandteile erläutert. Man beachte, daß in einer früheren Untersuchung wurde gezeigt, dass die Reaktionen in Richtung binäre Mischungen von Lockstoffen kann von einem optimalen zeitlichen Verlauf auf der Basis der Mischungsbestand Zeit-Dauern 29 angelegt vorhergesagt werden. Diese optimale Zeitverlauf für die Zulassung und bedn ist als dargestelltgestrichelten Linie. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53394/53394fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Das automatisierte Nachführsystem Flywalk ist für hochauflösende Quantifizierung der Art der Duft Verhalten in Drosophila melanogaster verwendet.

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

high-resolution-quantification-odor-guided-behavior-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

9.2K Aufrufe.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  Das automatisierte Nachführsystem Flywalk ist für hochauflösende Quantifizierung der Art der Duft Verhalten in Drosophila melanogaster verwendet. 

Serie: High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Einfache Assay zur Quantifizierung von Sozialvermeidung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.