Name: non-invasive in vivo fluorescence optical imaging of inflammatory mmp activity using an activatable fluorescent imaging agent
Uploaded: 2017-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
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Wir danken Daniel Bukala, Natalie Altmeyer und Funda Cay für einen ausgezeichneten technischen Support. Wir danken Jonathan Cotton, Greg Bowden und Paul Soubiran das Manuskript für die Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung und der Medizinischen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen ( ‚‘ Promotions ‚‘) und von der DFG durch den CRC 156 (Projekt C3) unterstützt.

Alle Verfahren in diesem Papier beschrieben, folgten die Richtlinien und internationale Standards der Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der lokalen Tierschutz und Tierethikkommission des Land Kommission Tübingen, Deutschland zugelassen. 8 bis 12 Wochen alt BALB / c und C57BL / 6-Mäuse gehalten wurden auf einem 12 h: 12 h Licht: Dunkel-Zyklus und wurden in IVCs und standardisierten Umweltbedingungen bei 22 ± 1 ° C in Gruppen von 2 untergebracht - 5 mit Wasser und Lebensmittel Zugang ad libitum. 1. Material Vorbereitung <ol><li> Verdünne die OI-Farbstoff für Nah-Infrarot-Fluoreszenzabbildung entsprechend dem jeweiligen Datenblatt unmittelbar vor der Injektion. Der aktivierbare OI Farbstoff (Handel Sonde mit einer Anregung bei 680 nm) MMPs in vivo zu messen , ist bereit , in einer Konzentration von 20 nmol in 1,5 ml 1x PBS zu verwenden. Vorsichtig schütteln oder die Lösung vor der Verwendung vortexen. für bis zu 6 Monate 8 ° C unter Lichtschutz - OI Farbstoff kann bei 2 gespeichert werden. </liAufrechtzuerhalten <li> Für intravenöse ( iv ) Injektionen bereiten wir einen venösen Katheter vor. Verwenden Sie eine 20 U (0,5 ml) Insulinspritze, gefüllt mit 0,9% Kochsalzlösung (mit 10 Injektionseinheiten von Heparin in 50 ml) und einer 30-Gauge-Nadel, die an einem Polyethylen-Katheter befestigt ist. Injektion der empfohlenen Dosis von 2 nmol pro Maus des OI-Farbstoffs. </li></ol> 2. Induktion von rheumatoider Arthritis und chronischer Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion <ol><li> Rheumatoide Arthritis: <ol><li> Verdünnen Sie 100 μl Serum (gewonnen aus K / BxN-Mäusen 10 ), die Antikörper (AB) gegen Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) 1: 1 mit 1x PBS (200 μL) enthalten, um RA zu induzieren. Das verdünnte Serum bei -80 ° C aufbewahren. Detaillierte Verfahren zur Induktion von RA werden von Monach et al. 8 </li><li> Um RA zu induzieren, heben Sie jede Maus sanft an den Schwanz und injizieren 200 μl des verdünnten Serums intraperitoneal ( ip ) am Tag 0 von tEr experimentiert. Nach der Injektion die Maus direkt zurück in den Käfig bringen. </li><li> Wahlweise messen Sie die Knöchel-Durchmesser jedes Knöchels, vor AB-Injektionen und definieren eine &quot;arthritische Punktzahl&quot; (Abbildung 1A ). Fortsetzung der Messung der Knöchelschwellung täglich bis zum Tag 6 nach GPI-Serum mit einem mechanischen Messgerät (Mikrometer). </li><li> Injizieren Sie den aktivierbaren OI-Farbstoff (Schritt 1.1 - 1.2), um die vivo- MMP-Aktivität iv in die Schwanzvene von RA-Mäusen zu messen Am Tag 5 nach GPI-Serum-Injektion und in die Schwanzvene von Kontrollmäusen. Führen Sie optische Bilderzeugungsexperimente 24 h nach der Schwanzveneninjektion durch. </li></ol></li><li> Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion: <ol><li> Zur Sensibilisierung von C57BL / 6-Mäusen wird eine 5% ige TNCB-Lösung, gelöst in einer 4: 1-Mischung aus Aceton / Öl, hergestellt. </li><li> Anaesthetize C57BL / 6 Mäuse mit 1,5% Isofluran verdampft in 100% Sauerstoff (1,5 l / min). Sobald die Mäuse anästhesiert sind, legen Sie sie in eine Selbstverrückte<html> E-Nase-Konus (eine geschnittene 5 ml Polyethylen-Spritze, die mit dem 1,5 Vol .-% Isofluran-Rohr verbunden ist) und die Anästhesie aufrecht zu erhalten. Tragen Sie Tierarzneimittel auf anästhesierte Tiere auf, um die Trockenheit der Augen zu verhindern, während sie anästhesiert werden. </li><li> Rasieren Sie den Bauch vorsichtig (2 x 2 cm) mit einem kleinen Tierhaarschneider. Vermeiden Sie es, die Haut zu verletzen, da dies zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Tier führen kann und die Ergebnisse der Studie beeinflussen kann. </li><li> 80 μl der 5% TNCB-Lösung langsam auf den rasierten Abdomenbereich mit einer 100 μl Pipette auftragen, um das Tier zu sensibilisieren. Legen Sie die Maus sanft wieder in den Käfig, wobei darauf geachtet wird, dass die Augen der Maus nicht mit den Bettwaren in Berührung kommen, um Hornhautverletzungen zu vermeiden und niedrige Körpertemperaturen während der Erholungsphase zu vermeiden. </li><li> Sechs Tage nach der Sensibilisierung wird eine 1% ige TNCB-Lösung (gelöst in einer 9: 1-Mischung aus Aceton / Öl) hergestellt und 20 μl am rechten Ohr mit einer Pipette aufgetragen, um akute und chronische CHSR hervorzurufen.„&gt; 1 <ol><li> Beginnen Sie mit der 1. Herausforderung auf beiden Seiten des rechten Ohrs mit 20 &amp; mgr; l von 1% TNCB Lösung einer 100 &amp; mgr; l - Pipette und wiederholen Sie die Herausforderung jeden zweiten Tag bis zu fünf Mal (Tag 15 nach der Sensibilisierung) zu entlocken CHR (1B) . Messen Sie Ohrdicke täglich, mit einem Mikrometer Messgerät. </li></ol></li><li> Injizieren Sie den aktivierbare OI Farbstoff (ein handelsübliches Sonde mit einer Anregung bei 680 nm) (Schritt 1,1-1,2) MMP - Aktivität in vivo in Mäusen CHR 12 h nach der Herausforderung zu messen. Führen optische Abbildungs Experimente 24 h nach Injektion in die Schwanzvene (iv). </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung der Tiere für Optical Imaging <ol><li> Schalter Mäusefutter (mindestens 3 Tage vor imaging) zu gering oder nicht fluoreszenzFutter (zB Mangan frei) , um die Interferenz von Auto-Fluoreszenz zu vermeiden (um 700 nm) mit dem Fluoreszenzsignal der verwendeten OI Mittel. </li><li> Legen Sie das Tier inZu einer Anästhesiebox und betäubt mit 1,5 Vol .-% Isofluran, verdampft mit Sauerstoff (1,5 l / min) (Sauerstoff kann durch Luft ersetzt werden, muss aber innerhalb eines Experiments standardisiert werden). </li><li> Wenn die Maus sichtbar anästhesiert wird, legen Sie sie in einen selbstgemachten Nasenkonus (bauen Sie durch eine geschnittene 5 ml Polyethylenspritze, die mit dem 1,5 Vol .-% Isofluranrohr verbunden ist) und pflegt die Anästhesie. </li><li> Rasiere das Tier vorsichtig auf dem Zielort (2 cm x 2 cm) mit einem kleinen Tierhaarschneider. Vermeiden Sie es, die Haut zu verletzen, da dies zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Tier führen kann und die Ergebnisse der Studie beeinflussen kann. HINWEIS: Haare können das Fluoreszenzsignal während OI (abhängig vom Mausstamm, mehr oder weniger Absorption beobachtet) abhängig von der Region von Interesse (ROI) absorbieren. </li><li> Für iv Injektion, legen Sie den Schwanz der Maus in erwärmtes Wasser, um Vasodilatation zu induzieren, reinigen Sie sanft die Haut an der Injektionsstelle mit Alkohol und beginnen Sie mit dem Platzieren des KathetersDie distale Stelle des Schwanzes Legen Sie die &quot;Schnitt&quot; -Kante der Nadel in einem Winkel von 20 ° in die Schwanzvene und testen Sie die korrekte Platzierung des Katheters durch erneutes Aufhängen der Spritze. </li><li> Wenn der Katheter korrekt platziert ist, ersetzen Sie die Spritze und injizieren Sie die OI-Sonde (2 nmol). Nach der Injektion die Spritze austauschen und 25 μl 0,9% Kochsalzlösung einspritzen, um das Totvolumen des Polyethylenrohres vollständig zu löschen. HINWEIS: Die Gewebe-Halbwertszeit des verwendeten OI-Farbstoffs (eine kommerzielle Sonde mit Anregung bei 680 nm) zur Messung der MMP-Aktivität in vivo beträgt 72 h. Um einen vollständigen Abstand zu gewährleisten, wird eine Wiederinjektion des Farbstoffes nicht früher als 7 Tage nach einer vorherigen Injektion empfohlen. </li></ol> 4. Optische Bildgebung <ol><li> Legen Sie ein schwarzes Plastik- oder Papierblatt in die schwarze Schachtel des OI-Scanners in die Mitte des Gesichtsfeldes (FOV). </li><li> Stellen Sie ein Messprotokoll ein und wählen Sie die richtige Wellenlänge (Anregung: 680 ± 10 nm und eAuftrag: 700 ± 10 nm) und Abbildungsparameter. HINWEIS: In einigen Systemen OI, das Setup für mehrere Bildfarbstoffe ist vordefiniert. </li><li> Um das richtige Protokoll für Fluoreszenz-Imaging zu wählen, öffnen Sie die Imaging-Software (vom Hersteller zur Verfügung gestellt) und das System initialisieren. Die meisten CCD-Kameras benötigen, um ihre Arbeitstemperatur abzukühlen, und diese 10 Minuten dauern kann. Für zuverlässige Ergebnisse, warten, bis das System bereit ist. </li><li> Beachten Sie die in vivo - Bildgebungssystem Erfassungs - Steuertafel Pop - up und jedes Filterpaar ausgewählt wird repräsentiert ein Bild in der Sequenz. In diesem Fall erwirbt ein Bild mit den Filterpaaren für die kommerzielle Farbstoff mit und eine Anregungs- und Emissionswellenlänge von 680 ± 10 nm und 700 ± 10 nm, bzw., und startet die Messung (Press „Acquire sequence“). Weitere detaillierte Anweisungen finden Sie in der Betriebsanleitung des Herstellers zu sehen. </li><li> Beschriften Sie die Bilder in geeigneter Weise und speichert die Informationen in dem „Bild bearbeitenLabels &quot;, die nach der&quot; Acquire sequence &quot;auftauchen wird. </li><li> Nehmen Sie einen Baseline-Scan von jedem Tier vor der Injektion des OI-Farbstoffs, oder verwenden Sie naive Kontrolltiere, um das Hintergrundsignal zu unterscheiden. </li><li> H nach der Schwanzveneninjektion des OI-Farbstoffs die Tiere in die Mitte des FOV stellen, in einer Position, um das höchste Signal im OI-System zu messen und die Messungen zu starten. HINWEIS: Wichtig: Hypothermie kann die Verteilung der bildgebenden Mittel signifikant beeinflussen. Stellen Sie sicher, dass die Bühne auf 37 ° C erwärmt wird, um eine Unterkühlung des Tieres zu vermeiden. Die Bildgebung kann gleichzeitig mit Tieren in Gruppen von 1 bis 5 Mäusen durchgeführt werden. Wählen Sie die Größe der FOV abhängig von der Anzahl der Tiere zur Messung zur gleichen Zeit. Sie können ein helles Feldbild aufnehmen, um zu prüfen, ob jede Maus sichtbar ist. </li></ol> 5. Datenanalyse HINWEIS: Führen Sie die Datenanalyse mit der folgenden Bildsoftware durchHerstellerprotokoll <ol><li> Für Messungen von RA, verwenden Sie die kalibrierte Einheit der Photonenemission, wie in Abbildung 2 gezeigt , während chronische CHSR als Signalintensität in Prozent (Effizienz) dargestellt werden. </li><li> Um die ROIs manuell zu zeichnen, verwenden Sie die Werkzeugplatte. Für die Analyse der RA-Bilder verwenden Sie einen standardisierten Kreis, der um das höchste Signal in allen Knöcheln und Pfoten eines jeden Tieres platziert ist. Um die CHSR zu analysieren, platziere die ROIs um das ganze rechte und linke Ohr nach dem hellen Feldbild. </li><li> Um die Photonenemission oder die Signalintensitätswerte im geplanten ROI zu messen, drücken Sie &quot;measure&quot;. Das System liefert Werte in den gezeichneten ROI für die deskriptive statistische Analyse. </li></ol>

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	<li>Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+psoriasis+and+psoriatic+arthritis.">Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis.</a> Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).</li><li>Harris, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheumatoid+arthritis.+Pathophysiology+and+implications+for+therapy.">Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy.</a> N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).</li><li>Lee, D. M., Weinblatt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheumatoid+arthritis.">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).</li><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).</li><li>Pap, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+pattern+of+membrane-type+matrix+metalloproteinases+in+rheumatoid+arthritis.">Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).</li><li>Firestein, G. S., Paine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromelysin+and+tissue+inhibitor+of+metalloproteinases+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium.</a> Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).</li><li>Schwenck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+detects+acute+and+chronic+contact+hypersensitivity+reactions+and+enables+monitoring+of+the+antiinflammatory+effects+of+N-acetylcysteine.">In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine.</a> Mol Imaging. 13, (2014).</li><li>Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+K/BxN+arthritis+model.">The K/BxN arthritis model.</a> Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).</li><li>Zelmer, A., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+fluorescence+imaging+of+small+animals.">Noninvasive fluorescence imaging of small animals.</a> J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).</li><li>Kouskoff, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+disease+provoked+by+systemic+autoimmunity.">Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity.</a> Cell. 87 (5), 811-822 (1996).</li><li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cell+proliferation+enables+the+detection+of+the+extent+of+experimental+rheumatoid+arthritis+by+3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine+and+small-animal+PET.">In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET.</a> J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).</li><li>Schwenck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Cerenkov+luminescence+imaging.+Applications+in+small+animal+research.">Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research.</a> Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).</li><li>Mahling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+pO2+Probe+and+[18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside+([18F]FAZA)+PET+Study+Reveals+Anesthesia-Induced+Impairment+of+Oxygenation+and+Perfusion+in+Tumor+and+Muscle.">A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle.</a> PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).</li><li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+breathing+affects+3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine+uptake+in+mouse+models+of+arthritis+and+cancer.">Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer.</a> J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).</li><li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthetics+on+3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine+([18F]FLT)+uptake+in+animal+models+of+cancer+and+inflammation.">Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation.</a> Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).</li><li>Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+imaging+for+evaluating+the+efficacy+of+edaravone+after+transient+cerebral+ischemia+in+mice.">In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice.</a> Brain Res. 1397, 66-75 (2011).</li><li>Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+molecular+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+abdominal+aortic+aneurysms+correlates+with+treatment+effects+on+growth+rate.">In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate.</a> Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+fluorescent+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+after+myocardial+infarction.">Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction.</a> Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).</li><li>Wallis de Vries, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Multispectral+near-infrared+fluorescence+molecular+imaging+of+matrix+metalloproteinases+in+a+human+carotid+plaque+using+a+matrix-degrading+metalloproteinase-sensitive+activatable+fluorescent+probe.">Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe.</a> Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).</li><li>Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumors+with+protease-activated+near-infrared+fluorescent+probes.">In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes.</a> Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).</li><li>Cortez-Retamozo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+assessment+of+inflammation+and+treatment+response+in+a+mouse+model+of+allergic+airway+inflammation.">Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation.</a> J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).</li><li>McIntyre, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+fluorogenic+proteolytic+beacon+for+in+vivo+detection+and+imaging+of+tumour-associated+matrix+metalloproteinase-7+activity.">Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity.</a> Biochem J. 377, 617-628 (2004).</li><li>Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+matrix+metalloproteinase-7+activity+in+vivo+using+a+proteolytic+nanobeacon).">Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon).</a> Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).</li><li>Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+activatable+cell+penetrating+peptides+for+targeting+protease+activity+in+cancer.">In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer.</a> Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).</li><li>Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+targeting+of+MMP-2/9+activatable+cell-penetrating+imaging+probes+is+caused+by+tumor-independent+activation).">Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation).</a> J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).</li><li>Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-metalloproteinases+as+imaging+targets+for+inflammatory+activity+in+atherosclerotic+plaques.">Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques.</a> J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+18F-labelled+derivative+of+the+MMP+inhibitor+CGS+27023A+for+PET:+radiosynthesis+and+initial+small-animal+PET+studies.">A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies.</a> Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).</li><li>Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+fluorescence-labeled+MMP+inhibitor+to+image+tumor+MMP+activity+in+vivo+in+comparison+to+an+MMP-activatable+probe.">Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe.</a> Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alarmin+S100A8/S100A9+as+a+biomarker+for+molecular+imaging+of+local+inflammatory+activity.">Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity.</a> Nat Commun. 5, 4593 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

OI ist ein sehr nützliches, schnelles und kostengünstiges Werkzeug für die nicht-invasive in vivo molekulare Bildgebung in der präklinischen Forschung. Eine besondere Stärke von OI ist die Fähigkeit, hochdynamische Prozesse wie entzündliche Reaktionen zu überwachen. Darüber hinaus erlaubt OI, den Kurs einer Krankheit für einen längeren Zeitraum zu verfolgen, von Tagen bis Wochen. OI hat mehrere Vorteile gegenüber anderen in vivo -Bildgebungsmodalitäten wie Positronenemissionstomographie (PET) oder Magnetresonanztomographie (MRT), da es sehr zeit- und kostengünstig ist. Eine Hochdurchsatzanalyse mit bis zu fünf Tieren pro Akquisition ist möglich. Darüber hinaus stehen eine Vielzahl von Sonden zur Verfügung, die auf viele verschiedene biologische Prozesse abzielen. 12 Um weitere anatomische Informationen bereitzustellen, kann OI mit anderen bildgebenden Verfahren wie MRT oder Röntgenstrahl kombiniert werden. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Gewebeeindringungstiefe im Vergleich zu fUngewöhnliche PET-Bildgebung. Darüber hinaus steht eine große Anzahl von Sonden zur Verfügung, die auf viele verschiedene biologische Ziele abzielen. 12 Effekte der Anästhesie sollten in der In-vivo- Bildgebung nicht unterschätzt werden. Während spezifische Effekte der Anästhesie auf OI-Ergebnisse nicht gut charakterisiert sind, hat unsere Gruppe in mehreren Studien den Einfluss der Anästhesie auf PET-Imaging-Ergebnisse gezeigt. 13 , 14 , 15 Zum Beispiel haben Fuchs et al. Analysierte Blutparameter wie pCO 2 , pH und Laktat vor und nach PET-Scans unter Verwendung unterschiedlicher Atem- und Anästhesieprotokolle. Es wurde gezeigt, dass signifikante Veränderungen in pCO 2 und Laktatspiegel im betäubten im Vergleich zu bewussten Sauerstoff- oder Luftatmungsmäusen zu signifikanten Veränderungen der PET-Ergebnisse führten. 14 Sie schließen, dass dieser Effekt hauptsächlich durch Sauerstoffatmung und Subsequenz verursacht wirdt zu respiratorischer Azidose bei Tieren, um die verschiedenen Ergebnisse in der PET-Bildgebung führt. Die Standardisierung der Anästhesie Parameter, wie O 2 -Konzentrationen und Dosen von Anästhetika, sowie Vermeidung von Hypothermie Hilfe systematische Fehler zu vermeiden. Natürlich ist OI 9 durch physikalische Eigenschaften wie zB Lichtstreuung, Gewebeautofluoreszenz und Lichtdämpfung begrenzt. Mehrere Gruppen , diese Probleme ansprechen , indem sie mit anderen Techniken wie in vivo Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie die makroskopischen Ergebnisse von OI kombiniert. In - vivo - Bildgebung der MMP - Aktivität von MMP-spezifisch aktivierbare fluoreszierenden Sonden wurde in mehreren experimentellen Modellen der Entzündung wie CHS, 7 , sondern auch bei Erkrankungen wie cerebrale Ischämie, 16 Aortenaneurysmen, 17 Myokardinfarkt 18Und atherosklerotische Plaques 19 sowie verschiedene Tumormodelle. 20 Zum Beispiel haben Cortez-Retamozo et al. Untersuchte die in vivo- Aktivität von MMPs in einem Modell einer allergischen Atemwegsentzündung durch Injektion einer MMP-aktivierbaren Sonde, 24 h nach intranasaler Applikation von Ovalbumin in zuvor sensibilisierten Mäusen. 21 Um die Position der MMP-Aktivität weiter zu identifizieren, kombinierte diese Gruppe die tomographische OI, die NIR-Faseroptik-Bronchoskopie und die intravitale Mikroskopie, um den Verlauf der Erkrankung und die Behandlungsreaktion genauer zu überwachen. 21 Andere Ansätze zur Messung der in vivo- MMP-Aktivität verwenden überwiegend Inhibitoren von MMP, die an die aktive Stelle von MMPs binden. McIntyre et al. Beschrieben eine in vivo- Tumor-assoziierte MMP-7-Detektion unter Verwendung eines &quot;polymerbasierten fluorogenen Substrats&quot;, das als ein &quot;Proteolyt&quot; wirktIC-Beacon &quot;für MMPs in einem Maus-Xenotransplantat-Modell 22 Sie zeigen, dass die Aktivität von MMP-7 selektiv durch optische Bildgebung nachgewiesen werden konnte. 23 Ferner untersuchten Olson et al. &quot; Aktivierbare zellpenetrierende Peptide &quot;(ACPPs), die in der Lage sind Ziel viele Xenotransplantat-Tumormodelle, kann aber nicht in die Zelle adsorbieren, bis der Linker proteolytiert ist. Sie untersuchten ACPPs, die selektiv für MMP-2 und MMP-9 sind Die Markierung von MMP-Inhibitoren mit radioaktiven Isotopen für die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) oder die PET-Bildgebung wurde verwendet, um die MMP-Expression in der Atherosklerose 26 und Krebs 27 zu untersuchen. In einer neueren Studie wurde ein fluoreszenzmarkierter MMP-Inhibitor mit einer MMP-aktivierbaren Sonde verglichen. 28 Der fluoreszenzmarkierte MMP-Inhibitor zeigte ein geringeres Signal zum RauschenVerhältnis im Vergleich zu einer aktivierbaren Sonde, erforderte jedoch eine kürzere Aufnahmezeit. Neue Biomarker zur Beurteilung der Schlüsselmerkmale der Pathophysiologie können von OI genutzt und validiert werden. Zum Beispiel ist die Antwort auf gefährheitsbezogene molekulare Muster (DAMPs) ein frühes Ereignis während einer entzündlichen Reaktion. Vogl et al. Verwendet einen Cy5.5-markierten Antikörper gegen Alarmin S100A9 bei Modellen der akuten Ohrhautdermatitis, Kollagen-induzierter Arthritis und Infektion mit Leishmania major , um empfindliche Biomarker für frühe Anzeichen einer Entzündung zu entwickeln. 29 Abschließend stellt OI eine schnelle und effiziente Methode für die präklinische Forschung dar, die in der Lage ist, neue Mechanismen von Krankheiten in vivo aufzudecken, neuartige molekulare Ziele zu charakterisieren und therapeutische Effekte zu überwachen . Trotzdem könnte ein nachfolgender Validierungsprozess mit quantitativeren Techniken wie PET erforderlich sein.

Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis (RA) oder Psoriasis vulgaris werden als verzögerte Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) eingestuft. 1 RA ist eine gemeinsame Autoimmunerkrankung, die durch erosive Synovitis und Gelenkzerstörung gekennzeichnet ist. 2 Inflamed arthritische Gelenke zeigen Infiltration und Proliferation von entzündlichen Zellen, eine erhöhte Expression von entzündungshemmenden Zellen, die zu Pannusbildung, Knorpel und Knochenzerstörungen führen. 3 , 4 Die Spaltung von extrazellulären Matrixmolekülen wie Kollagen durch Matrixmetalloproteinasen (MMPs) ist für die Gewebeumwandlung und Angiogenese essentiell und verursacht Gewebezerstörungen. 5 , 6 Kontaktüberempfindlichkeitsreaktionen (CHR) zeichnen sich durch Aggregation von Neutrophilen aus, die zu einem oxidativen Burst führen. 7 Ähnlich wie bei RA sind MMPs in CHR involviertved in Gewebeumwandlung, Zellmigration und Angiogenese, um eine chronische Entzündung zu etablieren. Um zu untersuchen, RA, die Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) -Serum Injektionsmausmodell verwendet wurde. 8 Serum aus transgenen K / B × N - Mäuse - Antikörpern gegen GPI enthält, wurde in naiven BALB / c - Mäuse injiziert , nach der rheumatischen Entzündungen innerhalb von 24 h mit maximal Knöchelschwellung am Tag 6 nach der GPI-Seruminjektion (siehe 1.1) zu entwickeln begann. chronischen CHR, C57BL / 6-Mäuse wurden mit Trinitrochlorbenzol (TNCB) sensibilisiert auf dem Bauch zu analysieren. Das rechte Ohr wurde auf 5 mal beginnend 1 Woche nach der Sensibilisierung in Frage gestellt (siehe auch 1.1 und 1.2). Noninvasive Kleintier OI ist eine Technik , basierend auf die in - vivo - Untersuchung von Fluoreszenz-, chemiluminescent- und Biolumineszenz-Signalen, die in der präklinischen Forschung hauptsächlich verwendet werden. Die erworbenen semi-quantitativen Daten geben Einblicke in die molecular Mechanismen in den Organen und Geweben von gesunden als auch erkrankten experimentellen Tiermodellen und Längs ermöglicht Messungen verfolgen (zB therapeutische Reaktion Profile in vivo zu bewerten). Ein großer Vorteil der Langzeitstudien ist die Verringerung der Anzahl der Tiere, wie die gleichen Tiere können in Folgestudien zu mehreren Zeitpunkten anstelle der Verwendung von verschiedenen Mäusen pro Zeitpunkt gemessen werden. Die Auflösung von OI ermöglicht eine detaillierte funktionelle Bildgebung von Organen und sogar kleinere Gewebestrukturen bei Versuchstieren. Die Verwendung spezieller Anregungs- und Emissionsfilter mit einem schmalen Transmissionsspektrum, ein Schutz gegen Streulicht durch eine lichtundurchlässigen „Dunkelkammer“ sowie ein sensitiver Charged-Coupled Device (CCD) -Kamera, die in vielen Geräten bis -70 ° C abgekühlt wird, ermöglicht hochspezifische und empfindliche Messungen von Fluoreszenzsignalen. Durch die Verwendung von Fluoreszenzmitteln mit Anregungs- undEmissionsspektren im Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster (650 - 950 nm) können Signal-Rausch-Verhältnisse deutlich verbessert werden. Das Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster zeichnet sich durch eine relativ geringe Absorption des Signals durch Hämoglobin und Wasser sowie eine niedrige Hintergrund-Auto-Fluoreszenz aus. 9 Dies ermöglicht eine Eindringtiefe von bis zu 2 cm im Gewebe von kleinen Tieren. OI-Sonden können direkt ein Ziel adressieren ( zB durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper) oder im Zielgewebe ( zB durch Proteasen) aktiviert werden. Aktivierbare OI-Sonden sind aufgrund ihrer Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) in ihrer inaktivierten Form optisch schweigend zu einer Quench-Einheit, die die Anregungsenergie im Molekül in eine andere Domäne überträgt. Wenn der Farbstoff gespalten wird (z. B. durch eine Protease), wird die Energie nicht mehr innerhalb des Moleküls übertragen und ein Fluoreszenzsignal kann von OI detektiert werden. Dies ermöglicht die Konstruktion von OI-Sonden mit hohem spezifischemY für unterschiedliche biologische Prozesse und ausgezeichnete Signal-Rausch-Verhältnisse. Das folgende Protokoll erläutert im Detail die Vorbereitung der Tiere, die OI-Messungen unter Verwendung einer aktivierbaren OI-Sonde zur Abbildung der MMP-2, -3, -9 und -13-Aktivität in vivo und zwei experimentelle Modelle der Entzündung (RA, CHR).

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>ophthalmic ointment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td><td>isoflurane</td></tr><tr><td>U40 insulin syringe</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61&amp;nbsp;mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 30 G</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co. Ltd.</td><td>305106</td><td>30 G injection cannula</td></tr><tr><td>RTA-0011 isoflurane vaporizer</td><td>Vetland Medical Sales and Services LLC</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Artagain drawing paper</td><td>Strathmore Artist Paper</td><td>446-8</td><td>coal black</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Optical imaging system</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 25 G</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>fluorescent imaging dye</td></tr><tr><td>Oditest&amp;nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>mechanical measurment</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td><td>SASOL</td><td>-</td><td>Oil</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BALB/C, C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mice used for experiements</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>For dilution of the RA serum&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td></td><td>Used for TNCB application&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>shaver&amp;nbsp;</td><td>Wahl&amp;nbsp;</td><td>9962</td><td>Animal hair trimmer</td></tr><tr><td>Living Image&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td></td><td>Imaging software to measure OI</td></tr></tbody></table>

non-invasive in vivo fluorescence optical imaging of inflammatory mmp activity using an activatable fluorescent imaging agent

Dieses Papier beschreibt ein nicht-invasives Verfahren zur Abbildung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -Aktivität durch eine aktivierbare Fluoreszenzsonde über in vivo Fluoreszenz-optische Bildgebung (OI) in zwei verschiedenen Mausmodellen der Entzündung: eine rheumatoide Arthritis (RA) und einen Kontakt Hypersensitivitätsreaktion (CHR) Modell. Licht mit einer Wellenlänge im nahen Infrarot (NIR) Fenster (650 - 950 nm) ermöglicht eine tiefere Gewebepenetration und minimale Signalabsorption im Vergleich zu Wellenlängen unter 650 nm. Die großen Vorteile mit Fluoreszenz OI ist, dass es billig, schnell und einfach in verschiedenen Tiermodellen zu implementieren ist. Aktivierbare Fluoreszenzsonden sind in ihren inaktivierten Zuständen optisch leise, werden aber bei der Aktivierung durch eine Protease stark fluoreszierend. Aktivierte MMPs führen zur Gewebezerstörung und spielen eine wichtige Rolle für die Progression von Krankheiten bei verzögerten Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) wie RA und CHR. Darüber hinaus sind MMPsDer Schlüssel Proteasen für Knorpel- und Knochenabbau und wird von Makrophagen, Fibroblasten und Chondrozyten in Reaktion auf proinflammatorische Cytokine induziert. Hier verwenden wir eine Sonde, die durch die Schlüssel MMPs wie MMP-2 aktiviert wird, -3, -9 und -13, und ein Bildgebungsprotokoll für Nah-Infrarot-Fluoreszenz OI der MMP-Aktivität in RA und Kontroll-Mäuse 6 Tage nach der Krankheitsinduktion beschreiben und wie bei Mäusen mit akuter (1x Herausforderung) und chronische (5x Herausforderung) CHR am rechten Ohr im Vergleich zu gesunden Ohren.

Rheumatoide Arthritis (RA) in naiven BALB / c - Mäusen zu induzieren, Tiere wurden ip mit Auto-Antikörper injizieren (1: 1 - Verdünnung mit 1 x PBS) gegen GPI am Tag 0. Die maximale Entzündung (Schwellung Knöchel) in diesem GPI-Serum induzierten RA - Modell ist am Tag 6 nach der Injektion 11. Daher 2 nmol des aktivierbaren OI Farbstoff wurde hergestellt und injiziert iv in die Schwanzvene von arthritischen Mäusen und gesunden Kontrolltieren am Tag 5 24 h nach der Injektion (Tag 6), wurden die Mäuse anästhesiert und wie beschrieben in Abschnitt in 3 abgebildet ( Abbildung 1a). Zu induzieren CHR, C57BL / 6-Mäuse wurden mit 5% TNCB am Tag sensibilisierten 0 am rasierten Bauch. Am 7. Tag nach Sensibilisierung der 1. Herausforderung am rechten Ohr mit 1% TNCB gestartet. Bis zu fünf Herausforderungen (Tag 15) wurden durchgeführt, eine chronische Entzündung zu induzieren. 7 12 h nach dem the letzte Herausforderung, 20 nmol des OI Farbstoff iv injiziert. Am Tag 15, 24 h nach der Injektion wurde OI oben (Abbildung 1B) , beschrieben , durchgeführt. Abbildung 2 zeigt ein deutlich verbessertes Fluoreszenzsignal in den Hinterpfoten, Knöchel und Vorderpfoten der RA - Maus am Tag 6 nach der Krankheitsinduktion, verglichen Knöcheln zu steuern (Figur 2A). Biodistribution Analyse der MMP-Aktivität in den Organen von RA Mäusen und gesunden Mäusen zeigte ein stark verbessertes Signal in den Hinterpfoten, Knöchel und Vorderpfoten ausschließlich in den Gelenken von RA-Mäusen. Interessanterweise stellten wir fest , ein erhöhte MMP - Signal in beiden Nieren aller gemessenen RA - Mäuse, wenn sie an die Nieren von gesunden Kontrollmäusen verglichen (2A, rechts). Darüber hinaus messen wir eine erhöhte MMP-Signal in der Leber und im Darm unabhängig davon, ob Mäuse, die von RA leiden. Keine Unterschiede zwischen RA und gesunden Mäusen wurden in t gefundenEr Pankreas, Lunge, Milz und Herz. Während der chronischen CHR (fünf TNCB-Herausforderungen am rechten Ohr) haben wir eine erhöhte MMP-Aktivität auf dem rechten entzündeten Ohr gemessen, verglichen mit dem gesunden linken Kontrollohr (Abbildung 2B ). So zeigen unsere Daten eine wichtige Rolle der MMP-Aktivität während der Krankheitsprogression bei beiden entzündlichen Erkrankungen. Toolsets für Biolumineszenz und Fluoreszenz erlauben die Quantifizierung von zB pmol von Fluorochrom oder die Anzahl der Zellen, die Fluoreszenz exprimieren. Die Daten können in 1. Zählungen angezeigt werden: Zeigt eine nicht kalibrierte Messung des auf die Kamera einfallenden Photonen an, 2. Radiance (Photonen): Zeigt eine kalibrierte Messung der Photonenemission in &quot;Photonen / Sekunde / cm 2 / Steradian&quot; an Empfohlen für die Lumineszenz-Bildgebung oder 3. R.Adiant Effizienz (Fluoreszenz): zeigt die Fluoreszenz-Emissionsstrahlung pro Ereignis-Erregungsleistung, empfohlen für Fluoreszenzmessungen. Ein großer Vorteil beim Arbeiten mit Strahlungseinheiten bei der Analyse von OI-Bildern ist, dass die Kameraeinstellungen während eines Experiments geändert werden können und dies hat keinen Einfluss auf die Bilder selbst oder die gemessenen ROI-Daten, was den Vergleich von Bildern aus verschiedenen IVIS-Systemen ermöglicht. Der interessierende Bereich (ROI) gibt den spezifischen Bereich des Interesses vom Benutzer in einem optischen Bild an. Die Symbolleiste ermöglicht es, 3 verschiedene ROIs zu zeichnen: Messung (misst die Signalintensität im ROI des Bildes), durchschnittlicher Hintergrund (misst die mittlere Signalintensität im benutzerdefinierten Bereich für den Hintergrund) oder Subjekt ROI (identifiziert ein Subjekttier in ein Bild). Wenn das Thema disspielt eine hohe unspezifische Hintergrundsignal selbst, der durch Subtrahieren des Hintergrundsignals (ROI) aus dem Ziel-ROI einen Hintergrund-korrigierte Messung ROI erhalten. Stellen Sie das Bild Minimum nahe Null, um die Autofluoreszenz zu bestimmen oder natürlich Hintergrund Lumineszenz im Bild auftreten. Verknüpfen des Bildes auf ein selbstdefinierten (benutzerspezifische) Hintergrundbild (ROI), die in erster Linie mit dem gemessenen spezifischen Bild gemessen wurden. Semi-quantitative Analysen der Bilder wurden in durch Ziehen standardisierte Regionen von Interesse (ROIs) durchgeführt sowohl arthritische und Knöchel steuern, sowie in entzündeten und gesunden Ohren Leben Bild-Software. Nur deskriptive statistische Analysen wurden in diesem Manuskript auf in - vivo - Daten durchgeführt wird , aufgrund einer unzureichenden Anzahl von Tieren. Analyse der Signalintensität von arthritischen und gesunden Fußgelenken oder Klauen zeigte eine 7-fach erhöhte MMP-Signalintensität in arthritischen gegen Knöcheln zu steuern.<html> Eine 3-fach höhere MMP-Signalintensität wurde in den vorderen Pfoten von arthritischen Mäusen im Vergleich zu denen der gesunden Tiere nachgewiesen (Abbildung 3A ). Die Analyse der Ohren mit akutem und chronischem CHR im Vergleich zum linken unangefochtenen Kontrollohr zeigte auch nach der ersten Herausforderung ein signifikant erhöhtes MMP-Signal, das nach dem 3. weiter anstieg und bis zur 5. Herausforderung auf dem gleichen Niveau blieb (Abbildung 3B ) . Als Folge der Kontamination mit dem Kontaktallergen auf dem linken Ohr aufgrund des Verkratzens der Mäuse wurde ein leicht erhöhtes MMP-Signal im linken (nicht TNCB herausgeforderten) Kontrollohr bestimmt. Die Ergebnisse zeigen eine wichtige Rolle von MMPs, die durch ein stark erhöhtes Fluoreszenzsignal bei GPI-Arthritis und chronischer Entzündung, gemessen durch OI, hervorgehoben wird. Last / 55180 / 55180fig1.jpg“/&gt; Abbildung 1: RA und CHR Modell, Zeitlicher Verlauf der Krankheitsinduktion und Zeitpunkt für OI. (A) Zeitlicher Verlauf der RA - Induktion in BALB / c - Mäusen (B) und chronischer CHR Induktion in C57BL / 6 - Mäusen. Überblick über die jeweiligen in - vivo - Bildgebung Zeitpunkt und zugehörige Einspritzzeitpunkte des OI Farbstoff zur Messung des MMP - Aktivität in beiden Modellen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55180/55180fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55180/55180fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55180/55180fig2.jpg" /> Abbildung 2: MMP OI in RA, CHR und Kontrolltieren. (A) Repräsentative Ergebnisse der gemessenen MMP - Aktivität in einer arthritischen Maus 6 Tage nach dem GPI-Arthritis - Induktion und eine gesunden Kontrollmaus (linke Seite). Signifikant höheres Signal (Strahldichte (p / s / cm 2 / sr)) intDie Sorgfalt wurde im arthritischen im Vergleich zur gesunden Maus beobachtet. Das Bild rechts zeigt die MMP-Aktivität in den Hinterpfoten und umfasst die Knöchel, Vorderpfoten, Pankreas, Lunge, Milz, Herz, Nieren, Leber und Darm einer geopften GPI-Arthritis-Maus nach OI-Farbstoff-Injektion. OI enthüllte ein hohes Signal in den Vorderpfoten, Knöcheln und Hinterpfoten von RA-Mäusen und Leber und Darm, unabhängig davon, ob die Mäuse mit GPI-Serum (RA-Mäuse) oder Kontrollserum (gesunde Kontrollmäuse) injiziert wurden. (B) MMP-Fluoreszenzsignal in Ohren mit chronischem CHR (links) und Kontrolltiere (rechts). Das entzündete rechte Ohr (herausgefordert 5 mal) zeigt ein stark verbessertes Signal im Vergleich zu Kontroll-Ohren. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55180/55180fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55180/55180fig3.jpg" /> &lt;Br /&gt; Abbildung 3: Semi-quantitative Analyse von entflammten und gesunden Klammern und Ohrengewebe mit OI. (A) Semiquantitative Analyse des Fluoreszenzsignals in RA und gesunde Tiere in den Vorderpfoten und Knöchelgelenken. Arthritische Frontpfoten und Knöchelgelenke zeigen ein signifikantes (** p &lt;0,05) (n = 3) höheres MMP-Signal im Vergleich zu gesunden Knöchelgelenken und Frontpfoten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. (B) Halbquantitative Analyse der linken und rechten (herausgeforderten) Ohren nach der 1. , 3. und 5. Herausforderung. Das MMP-Signal wird von der ersten bis zur 5. Challenge deutlich erhöht und zeigte bereits eine maximale Signalintensität im rechten herausgeforderten Ohr nach der 3. Herausforderung (** p &lt;0,05) (n = 3) (Kontrollohren sind teilweise mit TNCB verunreinigt Wegen der Mäuse kratzen.Dies produzierte ein verbessertes Signal, das nicht signifikant war). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt± SEM. Der t-Test des 2-tailed Students wurde verwendet, um Unterschiede zwischen Entzündungen (GPI-arthritische Knöchel, rechtsbehandelte Ohren) und Kontrolle (Kontrollknöchel, unbehandelte Ohren) für beide Modelle zu analysieren. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55180/55180fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Dieses Papier beschreibt die Anwendung von Fluoreszenz - Bildgebung einer aktivierbare optische Abbildungssonde mit der in vivo Aktivität von Schlüsseln Matrixmetalloproteinasen in zwei verschiedenen Versuchsmodellen der Entzündung zu visualisieren.

Nicht-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

non-invasive-vivo-fluorescence-optical-imaging-inflammatory-mmp

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

8.7K Aufrufe.  Eberhard Karls University of Tübingen.  Dieses Papier beschreibt die Anwendung von Fluoreszenz - Bildgebung einer aktivierbare optische Abbildungssonde mit der in vivo Aktivität von Schlüsseln Matrixmetalloproteinasen in zwei verschiedenen Versuchsmodellen der Entzündung zu visualisieren. 

Serie: Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) intravaskuläre Molecular Imaging von entzündlichen Plaque, einen multimodalen Ansatz, um Imaging der Atherosklerose

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

Forschung

Medizin

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Biotechnik

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Immunologie und Infektion

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing motor function deficits are basic readouts of the immune-mediated inflammation of the spinal cord. However, scores and body weight do not allow for an in vivo assessment of brain inflammation and optic neuritis. The latter is an early and frequent manifestation in about 2/3 of MS patients. Here, we show methods for bioluminescence and near-infrared live imaging to assess EAE evoked optic neuritis, brain inflammation, and blood-brain barrier (BBB) disruption in living mice using an in vivo imaging system. A bioluminescent substrate activated by oxidases primarily showed optic neuritis. The signal was specific and allowed the visualization of medication effects and disease time courses, which paralleled the clinical scores. Pegylated fluorescent nanoparticles that remained within the vasculature for extended periods of time were used to assess the BBB integrity. Near-infrared imaging revealed a BBB leak at the peak of the disease. The signal was the strongest around the eyes. A near-infrared substrate for matrix metalloproteinases was used to assess EAE-evoked inflammation. Auto-fluorescence interfered with the signal, requiring spectral unmixing for quantification. Overall, bioluminescence imaging was a reliable method to assess EAE-associated optic neuritis and medication effects and was superior to the near-infrared techniques in terms of signal specificity, robustness, ease of quantification, and cost.

We show a technique for in vivo live bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and encephalitis in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model for multiple sclerosis in SJL/J mice.

Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Einfluss von nicht-invasiven ACL-Verletzungen und -Operationen auf die Proteaseaktivität bei Mäusen

Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within 10-20 years following injury. Understanding the early biological processes initiated by joint injuries (e.g., inflammation, matrix metalloproteinases (MMPs), cathepsin proteases, bone resorption) is crucial for understanding the etiology of PTOA. However, there are few options for in vivo measurement of these biological processes, and the early biological responses may be confounded if invasive surgical techniques or injections are used to initiate OA. In our studies of PTOA, we have used commercially available near-infrared protease activatable probes combined with fluorescence reflectance imaging (FRI) to quantify protease activity in vivo following non-invasive compression-induced ACL injury in mice. This non-invasive ACL injury method closely recapitulates clinically relevant injury conditions and is completely aseptic since it does not involve disrupting the skin or the joint capsule. The combination of these injury and imaging methods allows us to study the time course of protease activity at multiple time points following a traumatic joint injury.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung früher Ereignisse und langfristiger Auswirkungen von ACL-Verletzungen auf das Fortschreiten der Osteoarthritis

Non-invasive ACL injury is a reliable and clinically relevant method for initiating post-traumatic osteoarthritis (PTOA) in mice. This injury method also allows for in vivo quantification of protease activity in the joint at early time points post-injury using protease-activatable near infrared probes and fluorescence reflectance imaging.

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within ...

Nicht-invasiv

Zusammenfassung

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