Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) und der Forschungsförderungsprogramm &quot;Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) des Landes Hessen, Forschungszentrum für Translationale Medizin und Pharmakologie TMP und der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS), Graduiertenkolleg Translationale Forschung Innovation - Pharma (TRIP).

1. EAE Induktion in SJL / J-Mäuse <ol><li> Mäuse <ol><li> Verwenden Sie 11-Wochen alte weibliche SJL / J-Mäuse und es ihnen ermöglichen, für ca. 7 Tage zur experimentellen Raum zu gewöhnen. Verwenden Sie n = 10 Mäuse pro Gruppe. </li><li> Für die Beurteilung der Arzneimittelwirkungen, die Verwaltung der Drogen-und Placebo für die Kontrollgruppe kontinuierlich über das Trinkwasser oder über Futterpellets beginnend 3 oder 5 Tage nach der Immunisierung (n = 10 pro Gruppe). Während der Höhepunkt der Krankheit, Medikamente verabreichen oder Placebo mit Milch oder 3% Zucker mit Wasser getränkten Maisflocken. </li></ol></li><li> Immunization Material <ol><li> Verwenden ein EAE Induktions Kit, bestehend aus Antigen (Peptid von Proteolipidprotein, PLP 139-151, 1 mg / ml Emulsion) in einer Emulsion mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA, Hitze abgetötete Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) und 2 Ampullen (jeweils 5 ug) lyophilisierter Pertussistoxin (PTX). </li><li> Man löst den PTX (2 ug / ml) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; dh &lt;/ Em&gt; 1,5 ml PBS in jedes PTX Rohr, fügen Sie gut mischen, entfernen Sie mit der gleichen Pipettenspitze, und zu 1 ml PBS in einem 50-ml-Röhrchen hinzufügen); gut mischen. </li></ol></li><li> Immunisierung <ol><li> Injizieren PLP / CFA subkutan in 2 Portionen, die jeweils 100 &amp; mgr; l, die beide an der Basis des Schwanzes. Nicht in die Rückseite des Halses zu injizieren, da alle Immunreaktionen in der Haut im oberen Rücken oder Nacken-Bildgebung des Kopfes und des Rückenmarks stören. </li><li> Injizieren von 100 &amp; mgr; l PTX intraperitoneal (ip) zweimal pro Maus, wobei der erste 1 bis 2 h nach der Immunisierung und die zweite bei 24 h. </li><li> Für die Kontrollmäuse, injizieren CFA ohne PLP (2 Portionen von 100 &amp; mgr; l) und PTX ohne PLP. </li></ol></li><li> Maus - Handling nach der Immunisierung <ol><li> Wiegen Sie die Mäuse jeden zweiten Tag bis zum Tag 7, und sie dann täglich wiegen. HINWEIS: Die Mäuse verlieren etwa 1 bis 2 g Körpergewicht während der EAE. Der Rückgang markiert den Beginn der EAE. </li><li> Beurteilen der klinischen Symptome täglich von Tag 7 according zu den Standard - Scoring - Systeme (dh Ergebnis 0: keine offensichtlichen Veränderungen in der Motorik; Score 0,5: distale Lähmung des Schwanzes; erzielt 1: komplette Schwanz Lähmung; Note 1.5: leichte Parese eines oder beider Hinterbeine; Stand 2: schwere Parese der Hinterbeine; Note 2.5: vollständige Lähmung eines Hinterbein; Stand 3: vollständige Lähmung beider Hinterbeine; 3.5 punkten. völlige Lähmung der Hinterbeine und Lähmung eines Vorderbein Euthanize Mäuse mit Noten von 3,5 oder höher für &gt; 12 h. </li></ol></li><li> EAE Kurs und Zeit der Bildgebung <ol><li> Führen Sie die erste Abbildungs ​​beim Einsetzen der Krankheit, wenn die Mäuse Scores erreichen&gt; 1, die etwa 10 Tage auftreten - 12 nach der Immunisierung. </li><li> Führen Sie die zweite Bildgebung an der Spitze, die 1 oder 2 Tagen erreicht wird, nachdem die ersten Symptome entwickeln und wird für 1 dauern - 3 Tage. HINWEIS: Anschließend wird die Mäuse vollständig innerhalb von 7 bis 10 Tagen genesen. Imaging während der Intervalle können noch vaskuläre Undichtigkeiten aufweisen,aber Entzündung Indikatoren negativ sein sollte. </li></ol></li></ol> 2. Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung <ol><li> Setup des Abbildungssystems <ol><li> Führen in vivo - Bildgebung mit der Ausrüstung, die für die Analyse der Biolumineszenz und nahen infraroten Signalen ermöglicht. </li><li> Halten Mäuse unter 2-2,5% Isofluran-Narkose bei allen bildgebenden Verfahren. </li><li> Position eins oder zwei Mäuse nebeneinander in der Vorrichtung die mittleren Gasversorgung verwendet wird. Positionieren Sie den oberen Wirbelsäule in der Mitte. </li><li> Verwenden Sie zwei Mäuse gleichzeitig, eine pro Gruppe, für die Bewertung von Medikamenten Effekte Paare zu vergleichen. Dies ist wichtig für Biolumineszenz-Bildgebung. </li><li> Abschirmen Stelle der Immunisierung mit schwarzem Tuch und nehmen ein Foto und Ausgangsbild die richtige Positionierung der Maus / Mäuse zu bewerten. Verwenden, um die B-Fokus mit einem 6,5-cm Abstand zur Kamera für alle Bilder. </li></ol></li><li> Injektion und Bildgebung von Biolumineszenz Entzündung Sonde <ol><li> Verwenden Sie die in - vivo - Bildgebung Systemeinstellungen: Epi-BLI, Em Filter geöffnet, Ex - Filterblock, fstop 1, Binning 8, konzentrieren sich B = 6,5 cm, Anzeigenpräsenz 120 s; nehmen ein Grundbild. </li><li> Inject 100 ul ip der ready-to-use Chemilumineszenzmittellösung (40 mg / ml). Gut mischen, bevor die Spritze zu füllen. </li><li> Erfassen Biolumineszenz Bilder 5, 10 und 15 min nach der Injektion. Der Zeitverlauf der biolumineszenten peak unterscheidet zwischen Tieren. HINWEIS: Die Spitze 5 auftreten - 10 Minuten nach der Injektion; ein Rückgang bei 15 min zeigt an, dass keine weiteren Bilder erforderlich sind. Mit der Maus Paare von Kontroll- und Behandlungsgruppen geringfügige Verzerrungen zu beseitigen, wegen der unterschiedlichen Zeitkurse. </li><li> Füllen Sie Beschreibungen relevant für das Experiment. Beachten Sie ein Dialogfenster öffnet sich automatisch; es enthält Informationen, wie zum Beispiel Maus - Stamm, Geschlecht, Zeitpunkt, Zeitpunkt der Sonde Injektion, Gruppe usw. Speichern Sie die Dateien alle in one-Ordner; sie werden Zeit-Tags und alle Beschreibungen haben. </li></ol></li><li> Injektion und Bildgebung von Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Nanopartikel für BBB - Integrität <ol><li> Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der pegylierten fluoreszierende Nanopartikel sind 675/690 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 2-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen. </li><li> Injizieren 70 &amp; mgr; l von pegyliertem fluoreszierenden Infrarot-Nanopartikel iv durch die Schwanzvene und stellen Sie sich die Mäuse 3 h und 24 h nach der Injektion die obigen Einstellungen. Mischen Sie die Lösung gut, bevor die Spritze zu füllen. </li><li> Injizieren 0,9% Natriumchlorid in Kontrollmäusen, die benötigt wird, um die Spezifität des Signals zu bewerten. </li></ol></li><li> Injektion und Abbildung des nahen Infrarot fluoreszierende Sonde für MMP - Aktivität <ol><li> Shave oder enthaaren den Kopf und upper Rückenbereich vorsichtig einen Tag vor dem Ausgangsbild nehmen. Die Haut darf nicht verletzt werden. </li><li> Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der MMP aktivierbare Sonde sind 680/700 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 1-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen. </li><li> Mit 200 &amp; mgr; l 1x PBS auf das 1,5-ml-Röhrchen der ready-to-use-Lösung (20 nmol / 1,5 ml in 1x PBS), so dass es für 10 Mäuse ausreichend sein wird; gut mischen, bevor die Spritze zu füllen. HINWEIS: Die bereitgestellten Volumen nimmt nicht berücksichtigt, dass einige Volumen während Spritzenfüllanlage und Injektion verloren. </li><li> Inject 150 ul der Sonde iv durch die Schwanzvene 24 h vor der Bildgebung. Injizieren PBS nur in Kontrolltieren die Spezifität des Signals zu bewerten. </li><li> Bei 24 Stunden nach der Injektion, nehmen Epi-FL Bilder zumindest bei zwei Wellenlängen, Ex640 / Em700 und Ex 675 / EM720, mit den Einstellungen oben erläutert (1-s Belichtung, Fokus B, Binning 8 und fstop 2). HINWEIS: Die Verwendung von zwei Wellenlängen ermöglicht Entmischung durch die unspezifische Signal subtrahiert wird. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalysen <ol><li> Biolumineszenz - Analyse (BLI) <ol><li> Doppelklicken Sie auf die Software, um es zu öffnen. </li><li> In der oberen Menüleiste, klicken Sie auf den Datei - Browser - Symbol, gehen Sie in das Verzeichnis des Ordners des Experiments, und wählen Sie sie aus ; Dadurch werden alle Dateien im Ordner in einer Tabelle öffnen. </li><li> Konfigurieren Sie die Spalten die Beschreibungen relevant für das Experiment zeigt. </li><li> Für die Qualitätskontrolle, doppelklicken Sie auf eine Datei von einem Non-Responder-Maus ohne Symptome von EAE und / oder einem naiven Maus, um die Spezifität der EAE-Signale zu überprüfen. HINWEIS: Es sollte in Non-Responder-Mäuse kein Signal in naiven Mäusen und minimale Signal sein. <ol><li> Überprüfen Sie die Basislinienbild vor dem Einspritzen des Prowerden für jede Maus als weitere Kontrolle der Spezifität des Signals; es sollte negativ sein. </li></ol></li><li> Um ein Bild zu wählen, doppelklicken Sie auf die erste Datei des ersten EAE Maus und überprüfen Sie die Biolumineszenz-Intensität (LUT Bar-Bereich) und Lokalisierung. Überprüfen Sie alle Bilder nacheinander. Schließen Sie die Datei mit der niedrigsten Intensität für jede Maus (dh halten 2 von 3 Bildern pro Maus). </li><li> Bildeinstellung und Ausfuhr <ol><li> Doppelklicken Sie auf die erste Datei zu quantifizieren. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Unter &quot;Optionen&quot; (oberes Menü), passen Sie die Etiketten in jedem Bild angezeigt werden soll. </li><li> In der rechten Werkzeugpalette, gehen Sie zu &quot;Bildeinstellung.&quot; Standardmäßig werden die minimalen und maximalen Intensitäten auf &quot;auto&quot; und in den Regenbogenpseudo angezeigt. Wählen Sie &quot;Manuell&quot;, um die Einstellungen zu ändern, falls erforderlich. HINWEIS: Zum Beispiel werden alle exportierten Bilder können gleich LUT Bars haben (identische Minima und Maxima) zu sein, leicht vergleichbar.Die Einstellung der Minima und Maxima hat keine Auswirkungen auf die quantitativen Ergebnisse. </li><li> Klicken Sie auf das Bild zu exportieren, wählen png, das Verzeichnis, und ein Bild, Namen </li></ol></li><li> Die Quantifizierung der Regions of Interest (ROI) <ol><li> Gehen Sie auf die &quot;ROI&quot; Werkzeug in der Werkzeugpalette. Wählen Sie den ROI-Methode (Kreis, Rechteck, Auto, oder frei Hand) und die Anzahl der ROIs. Beachten Sie die ROI-Fenster im Bildfenster Pop. </li><li> Mit der Maus, passen Sie die Größe und Position. Verwenden Sie identische ROI Schwellenwerte für alle Bilder, wenn die Auto-ROI-Tool verwendet wird. Verwenden Sie identische Bereiche für alle Bilder , wenn ROI Größen und Positionen manuell definiert werden (zB Kreis ROIs). </li><li> Klicken Sie auf &quot;messen RO.I. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Passen Sie die Spalten (zB Dateiname, Tiernummer, Gruppe, Experiment, Fläche, insgesamt zählt, Durchschnitt zählt, SD zählt, min und max zählt, Fläche, Zeit Punkt, der Zeit der Sonde Injektion, etc.). speichern Sie die benutzerdefinierten Einstellungen. Wenn ReAdy, alle auswählen (Strg + A) und kopieren und die Tabelle in eine Tabelle einfügen. </li><li> Exportieren Sie das Bild als png mit den ROIs an Ort und Stelle. Speichern und schließen Sie die Bilddatei. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 3.1.6 - 3.1.7) für alle Bilddateien, die quantifiziert werden müssen. Kopieren Sie alle ROI Quantifizierungen in die Tabelle. HINWEIS: Hier können die Ergebnisse nach Gruppen, Zeitpunkt sortiert, usw. und statistisch ausgewertet. Verwenden Sie die Gesamtzahl der Biolumineszenz-Signale in der ROIs für statistische Auswertungen. </li></ol></li><li> Nah-Infrarot (NIR) Analyse von fluoreszierenden Nanopartikeln <ol><li> Verwenden der Bedienelemente in der Software, stellen Sie die Schwelle des Bildes. ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis. </li><li> Optisch vergleichen die bei Ex / Em aufgenommenen Bilder 675/720 und Ex / Em 640/700 die Spezifität des Signals zu bewerten. </li><li> Verwenden Sie die aufgenommenen Bilder bei Ex / Em 675/720 für die quantitative Analyse (Anregungsmaximum: 680 nm). Definieren ROIs, für die die automatische ROI Werkzeug verwendet werden kann. Stellen Sie die Auto-ROI Schwelle und verwenden Sie es für alle Bilder. Quantifizieren der Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs (siehe Schritt 3.1). </li></ol></li><li> Nah-Infrarot (NIR) Analyse von Protease-empfindliche Sonde <ol><li> Der Einsatz von Software steuert, stellen Sie die Schwelle des Bildes. ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis. Führen Entmischung der Autofluoreszenz. Die Entmischung Werkzeug in lebenden Bild umgesetzt. Die Auto-Entmischung verwendet die Ex / Em 640/700 als spezifische und 675/720 als Autofluoreszenzbild. </li><li> Wählen Sie das ungemischte Bild und definieren Sie die ROIs, wie oben beschrieben. Verwenden Sie die Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs für quantitative und statistische Analysen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die vorliegende Video zeigt Techniken zur Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Fluoreszenz in vivo Bildgebung von EAE in SJL / J - Mäusen. Wir zeigen, dass Biolumineszenz-Bildgebung eine entzündungs ​​empfindliche Sonde zeigt hauptsächlich optische Neuritis verwenden, und die Quantifizierung stimmt mit der klinischen Bewertung von EAE Schwere und die Auswirkungen von Medikamenten. Jedoch war die Biolumineszenz - Bildgebungsverfahren nicht in der Lage Entzündung des lumbalen Rückenmarks zu erkennen, die eine primäre Ort der EAE Manifestation 17 ist , wahrscheinlich , weil das Signal von der Wirbelsäule absorbiert wird. Die Nah-Infrarot-Bildgebung ist empfindlicher, aber auf Kosten der hohen Interferenz mit Auto-Fluoreszenz, die mit Biolumineszenz nicht auftritt. Die Belichtungszeit von NIR ist viel kürzer (1 - 2 s) zu BLI Vergleich (2 bis 5 min), die mit sich schnell ändernden Signalintensitäten für Zeitreihen NIR das bevorzugte Verfahren ist. Kritische Schritte mitim Protokoll und Grenzen der Technik Signale der Immunisierungsstelle interferieren mit Rückenmarks Bildgebung in EAE, aber dies kann durch Anordnen beide Injektionsstellen an der Basis des Schwanzes umgangen werden, die nicht schlechter als die empfohlene Injektionsstellen (Hals und der Basis des Schwanzes) war. Dennoch ist es notwendig, die Injektionsstellen mit schwarzem Tuch abzuschirmen. Für Biolumineszenz-Bildgebung ist es wichtig, eine Zeitreihe von Bildern zu erfassen, weil die Kinetik zwischen Tieren unterscheiden. Zu vermeiden , indem die Kinetik verursacht Verzerrungen, Abbilden von Paaren von Steuer (zB Fahrzeug oder Wildtyp) und verum (beispielsweise Arzneimittel oder transgenes) -Mäuse vorteilhaft. Nach Angaben des Herstellers sollte das Signal für 30 min stabil sein. Doch in EAE beobachteten wir schneller und transiente Kinetik, mit Spitzenwerten bei 5 auftretenden - 10 min und einem deutlichen Rückgang bei 15 min. Für Nah-Infrarot-Bildgebung, die manufacturer empfiehlt die Ex / Em Einstellung für eine bestimmte Sonde. Trotzdem war es sinnvoll, eine Filterserie zunächst und immer erfassen Bilder an mindestens zwei Anregungs- / Emissions-Kombinationen zu laufen, die eng an die Ex / Em Maxima berichtet entsprechen und kann später für Entmischung unspezifischer Signale verwendet werden. Es ist wichtig, weiße Mäuse zu verwenden, wie SJL / J, weil Licht und Fluoreszenz von schwarzem Fell hoch absorbiert werden. Schwarze Mäuse müssen auf den Kopf und wieder einen Tag vor der Bildgebung vorsichtig rasiert werden. Die Hautveränderungen müssen vermieden werden, weil sie als entzündliche Flecken erscheinen und stören die Bildgebung des Gehirns oder des Rückenmarks. Für NIR-Bildgebung, empfiehlt der Hersteller die Enthaarung aller Mäuse, auch weiße Mäuse. Auch nach der Rasur, waren die Kopf- und Rücken Ergebnisse in schwarzen Mäuse weniger überzeugend als mit weißen Mäusen (nicht dargestellt). Für die primäre progressive EAE-Modell in C57BL6 Mäuse, weiß C57BL6 Mäuse, die im Handel erhältlich sind, können ein Alter seinheimisch. Hairless, sind immunokompetente SKH1 Mäuse nützlich für die Nah-Infrarot-Bildgebung, aber nicht EAE, da diese Mäuse einen Albino-genetischen Hintergrund haben und nicht zuverlässig entwickeln EAE (maximale Punktzahl: 0,5-1). Biolumineszenz-Bildgebung die Entzündung Sonde in diesen Mäusen zeigte mehrere Entzündungsstellen in der Haut (nicht gezeigt), wo die Haarfollikel verloren werden. NIR-Bildgebung der Protease-Aktivität zeigte, Hirn- und Rückenmarksentzündung, sondern Signale, die durch Autofluoreszenz überlagert wurden, erfordern Entmischung vor quantitative Analyse. Daher war NIR-Bildgebung weniger robust als Biolumineszenz-Bildgebung und war teurer. die Verwendung von Protease-aktivierbare Sonden können für die Beurteilung von Arzneimitteln ist jedoch nützlich, die spezifisch Matrixmetalloproteinasen Ziel. Vorteile und Nachteile Die verschiedenen Bildgebungstechniken sind kostenlos und richten spezielle Fragen. Die Vorteile der Bioluminzier Bildgebung sind Erschwinglichkeit (ca. 20 Euro / Maus); ein Mangel an auto-Biolumineszenz, die das Signal stören würden; hohe Spezifität; bequem ip-Injektion und Bildanalyse; und Robustheit und Zuverlässigkeit. Nachteile sind lange Belichtungszeiten und Signalaufnahme durch schwarzes Fell und Knochen. Vorteile der NIR sind die breitere Verfügbarkeit von NIR-markierten Sonden, die einfache kundenspezifische NIR Etikettierung, kurze Belichtungszeit und eine hohe Empfindlichkeit. Nachteile sind hohe Kosten (50 bis 100 Euro / Maus), Absorption durch Fell, starke Interferenzen mit Autofluoreszenz und die Notwendigkeit für Entmischung und Bildverarbeitung vor der Analyse. Eine Anzahl von Sonden zur Verfügung, die Entzündungsstellen erkennen , da sie durch proinflammatorische Enzyme aktiviert werden , die an Entzündungsstellen (beispielsweise Peroxidasen oder Metalloproteinasen) aufgrund der Infiltration von Immunzellen hochreguliert werden. Einige dieser Sonden werden auch cance erkennenrs zeigt Immunzellinfiltration in der Tumor - Mikroumgebung oder die Freisetzung von Enzymen , durch den Tumor selbst (zB MMPs). Sonden, die im Gewebe infolge Kapillarwirkung Leckage ansammeln erkennt Störungen in der BBB, sondern auch an anderen Stellen der Entzündung und Krebs. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden Die Kombination von &quot;imaging und klinischen Wunden&quot; überlegen war &quot;Noten&quot; Für die Bewertung des Krankheitsstatus und den Nachweis von Medikamentenwirkungen. Das Biolumineszenz - Signal um die Augen stimmt auch mit früheren Studien histopathologischen Zerstörung des Myelins und Immunzellen infiltriert im Sehnerven 5 zeigt. Etwa 2/3 der MS-Patienten entwickeln Episoden von Neuritis. Bisher gibt es keine zuverlässigen, nicht-invasive Methoden Neuritis zu quantifizieren bei Mäusen außer Diffusion der Magnetresonanztomographie (MRT) und op lebentischen Kohärenztomographie (OCT), die 18 technisch anspruchsvoll sind. Oktober wurde als eine Methode zeigt , Netzhautveränderungen und Atrophie bei EAE, was auf eine Autoimmunreaktion in dem Sehnerv 19 in EAE eingeführt. Im Vergleich zu dem Verfahren in diesem Manuskript beschrieben ist, ist OCT höheren Stressor für die Mäuse, weil sie tiefer Anästhesie erfordert. Die Anzeige ist nicht eine direkte Visualisierung des Sehnervs 19. Nah-Infrarot-Bildgebung von fluoreszierenden Nanopartikeln war nützlich, um die Störung der BHS zu visualisieren, die ein weiteres Merkmal der EAE und MS ist. Neben MRI 20, 21, gibt es keine nicht-invasive Methode zur in vivo Überwachung der Integrität BBB. Dies würde sehr nützlich sein, weil experimentelle Drogen und Phyto-Medikamente speziell wirken , indem sie die Barriere 22 Anziehen </sup&gt; 23, die normalerweise übermäßige Lymphozyten Rekrutierung in das ZNS 24 behindert. Verhindern von Leukozyten - Befestigung oder Transmigrations durch die BBB und seine leakiness zu reduzieren , ist eine wirksame Strategie in der MS - Behandlung 25 und Nanopartikel - Bildgebung kann die Wirksamkeit von Arzneimittelkandidaten zu bewerten helfen. Bisher sind die Partikel teuer. Intravitalmikroskopie ist eine andere Technik verwendet , um BBB - Integrität 26 sichtbar zu machen, aber es erfordert in der Regel lang anhaltende, tiefe Narkose (zB mit Ketamin und Xylazin) wegen der Kraniotomie und nicht zulässt , Wiedererweckung die Mäuse, daher verhindert Zeitverlauf analysiert. Jedoch liefert Intravitalmikroskopie hochauflösende Bilder auf zellulärer auf subzellulärer Ebene, die nicht erreichbar mit in vivo - Bildgebung ist. Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach der Technik Mastering Zusammenfassend ist die Abbildungs ​​techniques in der vorliegenden Video-Hilfe stellte die einzelnen Kurse der Krankheit zu bewerten und die Wirkung von Medikamenten, die teilweise waren nicht von klinischen Scores zeigte, allein zu überwachen. Die Techniken, stimmen mit den drei &quot;R&quot; Grundsätze der Vermeidung, Verminderung und Verfeinerung in Tierversuchen und sind nützliche Add-on-Tools in der Arzneimittelforschung.

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord1. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors4 but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.
The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans5. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice. 
The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments6, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods7, all requiring euthanized mice at specific time points. 
A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)8, and cathepsins9 or cyclooxygenase2. These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE11. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration12, suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals. 
In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination13. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination14. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers5. 
An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin5, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.
In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1287">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">AngioSpark-680</td>
			<td style="width:267px;">Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td>
			<td style="width:119px;">NEV10149</td>
			<td style="width:636px;">Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMP-sense 680</td>
			<td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td>
			<td>NEV10126</td>
			<td>Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoLight RediJect Inflammation Probe</td>
			<td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td>
			<td>760535</td>
			<td>Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLP139-151/CFA emulsion&#160;</td>
			<td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td>
			<td>EK-0123</td>
			<td>EAE induction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pertussis Toxin</td>
			<td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td>
			<td>EK-0123</td>
			<td>EAE induction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVIS Lumina Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bioluminescence and Infrared Imaging System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LivingImage 4.5 software&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>IVIS analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:267px;">Abbott Labs, Illinois, USA</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td>Anaesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and brain inflammation in the eae model of multiple sclerosis in mice

Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) in SJL / J-Mäusen ist ein Modell für rezidivierend-remittierender Multipler Sklerose (RRMS). Klinische EAE Scores Motorik Defizite beschreiben, sind Grund Auslesungen der immunvermittelte Entzündung des Rückenmarks. Allerdings Gewicht Scores und Körper nicht erlauben , für eine in vivo Beurteilung der Entzündung des Gehirns und Neuritis. Letzteres ist eine frühe und häufige Erscheinung in etwa 2/3 MS-Patienten. Hier zeigen wir Methoden für die Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Live - Bildgebung zur Beurteilung EAE Neuritis hervorgerufen, Gehirnentzündung und Blut-Hirn - Schranke (BHS) Störung in lebenden Mäusen unter Verwendung eines in vivo - Bildgebungssystem. Ein Biolumineszenz-Substrat aktiviert durch Oxidasen zeigte in erster Linie optische Neuritis. Das Signal war spezifisch und erlaubt die Visualisierung von Arzneimittelwirkungen und Krankheitszeitkurse, die die klinischen Bewertungen einher. Pegyliertem fluoreszierende Nanopartikel, die innerhalb der vasculatur bliebe für längere Zeiträume verwendet wurden, die BBB Integrität zu beurteilen. Nah-Infrarot-Bildgebung ergab einen BBB-Leck auf dem Höhepunkt der Krankheit. Das Signal war das stärkste um die Augen. Ein Nahinfrarot-Substrat für Matrixmetalloproteinasen wurde verwendet EAE-evozierte Entzündung zu beurteilen. Auto-Fluoreszenz mischte sich mit dem Signal, erfordern Entmischung zur Quantifizierung. Insgesamt war Biolumineszenz-Bildgebung eine zuverlässige Methode EAE-assoziierte optische Neuritis und Medikamente Effekte und war besser als die Nah-Infrarot-Techniken in Bezug auf Signal Spezifität, Robustheit, einfache Quantifizierung und Kosten zu bewerten.

Zeitverlauf der Biolumineszenz von Neuritis Das Biolumineszenz-Signal der Entzündung Sonde war das stärkste um die Augen und trat ausschließlich in EAE Mäuse mit Optikusneuritis. Ein Signal, trat bei keiner der nicht-EAE Mäuse noch die Mäuse nicht mit der Entzündung Sonde injiziert. Das Signal verschwunden, wenn die Mäuse gewonnen. Daher ist das Signal für Optikusneuritis spezifisch und die Spitze des Signals Parallelen der Spitze der klinischen EAE-Scores. 1 zeigt zwei Beispiele von SJL / J - Mäusen am Tag 10 und 14 abgebildet , nachdem EAE - Induktion. Das Biolumineszenz-Signal war der höchste am Tag 10 und verschwand, als die Mäuse zu erholen begann. Die Zeitverläufe der klinischen Scores entsprach dem Verschwinden des Biolumineszenz-Signals (Beispiel-1) oder vorangestellt (Beispiel-2) den Rückgang der Punkte. Abbildung 1. Zeitlicher Verlauf der Neuritis und klinischen Scores in EAS-SJL / J - Mäuse. Biolumineszenz Bilder Optikusneuritis wurden 10 min nach der Injektion der Entzündungs Sonde (100 ul ip) während der 1. flare der Krankheit in zwei SJL / J - Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung eingefangen. Die Biolumineszenz-Bilder (links) wurden 10 und 14 Tage nach der Immunisierung gewonnen und werden als Regenbogen Pseudo Foto-Overlays dargestellt. Lut Bars reichen von blau (Nieder-) bis rot (High-Biolumineszenz). Maßstabsbalken: 1 cm. Das rechte Bild zeigt Balkendiagramme der einzelnen Gesamt Biolumineszenz zählt in ROIs (Mittelwert ± sd von 3 Bildern pro Stück) und die zeitlichen Verläufe der klinischen EAE-Scores. Die roten Pfeile markieren die Abbildungs ​​Tage. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig1large.jpg" target="_blank">um eine größere ve</a>rsion dieser Figur. Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung Die Entzündung Sonde Die Wirkungen der Medikamente (R-Flurbiprofen 5 mg / kg / d) 5 sind in Abbildung 2 dargestellt. Fünf Beispiele der biolumineszenten Bilder in jeder Gruppe dargestellt. Die Noten im Fahrzeug und Behandlungsgruppe waren heterogen, aber in allen Mäusen, die Biolumineszenz - Signal in der Augenentzündung im Sehnerven zeigt niedriger war in der Medikamentengruppe (2A). Die Quantifizierung der Gesamt Biolumineszenz - Zählungen in ROIs bestätigt signifikante Wirksamkeit der Behandlung (2B, mit Box - Plots der gesamten Biolumineszenz zählt, ungepaarten t-Test, p &lt;0,05 bis 2 tailed). Die Abbildungsergebnisse mit dem therapeutischen Effekt vereinbartens der Medikamente im Hinblick auf die klinischen Scores und histopathologischen Manifestationen von EAE im Rückenmark und Sehnerven 5. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55321/55321fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Wirksamkeit von Medikamenten in EAE-SJL / J - Mäuse Mit Biolumineszenz Imaging. SJL / J-Mäuse erhielten Vehikel oder Medikamente (R-Flurbiprofen 5 mg / kg / d) von Tag 5 nach der Immunisierung. Bilder wurden nach der Injektion der Entzündungs Sonde (100 ul ip) an der 1. EAE Peak erfasst, n = 10 pro Gruppe. EAE in 10.07 in beiden Gruppen entwickelt und EAE Non-Responder waren ohne Signal. A) Biolumineszenz Bilder in lebenden Mäusen gefangen 5 bis 15 Minuten nach der ip - Injektion von 100 &amp; mgr; l der Entzündung Sonde werden als Regenbogen Pseudo Foto - Overlays dargestellt. LUT Bars reichen von blau (Nieder-) bis rot (hoher Intensität). Maßstabsbalken: 1 cm. Die einzelnen Spitzender gesamten Biolumineszenz-Zählungen in ROIs wurde für die Quantifizierung verwendet. ROIs wurden auf den Kopf beschränkt. Die PLP Injektionsstellen wurden mit schwarzem Tuch abgeschirmt. B) Box - Plots die Quantifizierung der Gesamtzählungen in ROIs zeigt. Die Box stellt den Quartilabstand, die Linie ist die mittlere und die Whiskers zeigen das Minimum zum Maximum. Die Gesamtzahl unterschieden sich signifikant zwischen den Gruppen (2-seitig ungepaarten t-Test, p &lt;0,05), eine Reduktion von Neuritis und Enzephalitis bei Mäusen, die Medikation zeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Pegyliertem fluoreszierende Nanopartikel Epifluoreszenz Bilder von Nahinfrarot-Nanopartikel ergab Gefäßlecks um die Augen und im Gehirn in beiden Behandlungs groups (3A, 2 Beispiele). Die Partikel verteilen sich sehr langsam aus dem Blut in den Zwischenraum, mit Ausnahme von Entzündungsstellen, wo der Farbstoff, so dass für eine Bewertung von BBB Integrität ansammelt. Die Leckage war offensichtlich bei 3 h und 24 h nach der Injektion der Nanopartikel, aber es war zu dem späteren Zeitpunkt stärker. Es gab kein spezifisches Signal in nicht-EAE Mäuse oder Mäuse nicht mit Nanopartikeln (rechts) injiziert. Daher war das Signal spezifisch. Die quantitative Analyse von Strahlungseffizienz in ROIs (3B) zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen (n = 3 pro Gruppe, ungepaarten 2-tailed t-Test, p &lt;0,05). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55321/55321fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bewertung der Blut - Hirn - Barriere - Störung mit pegyliertem Fluoreszierende Nanopartikel. SJL / J-Mäuse erhielten Vehikel oder Medikamente (R-flurbiprofde 5 mg / kg / d) von Tag 5 nach der Immunisierung. Bilder wurden 3 h und 24 h nach der Injektion von nahen Infrarot-markierte Nanopartikel (70 ul iv) während der ersten EAE peak erfasst, n = 3 pro Gruppe. EAE Non-Responder waren ohne Signal. Die Auto-ROI Tool wurde für die Quantifizierung der Strahlungseffizienz verwendet. Die ROIs wurden auf den Kopf beschränkt. Die PLP Injektionsstellen wurden abgeschirmt. A) Beispiele für Epifluoreszenz Bilder von lebenden Mäusen, eingefangen 3 h und 24 h nach der Injektion von Nanopartikeln. Bilder von Mäusen ohne EAE oder ohne die Injektion von Nanopartikeln wurden als Abbildungs ​​Kontrollen verwendet. Maßstabsbalken: 1 cm. LUT Bars reichen von dunkelrot (Nieder-) bis gelb (hohe Intensität). B) Balkendiagramme die Quantifizierung der Strahlungseffizienz in ROIs (Mittelwert ± SD gezeigt). Die Behandlungsgruppen unterschieden sich nicht signifikant (2-seitig ungepaarten t-Test). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig3large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig3large.jpg" target="_blank">v</a><html> IEW eine größere Version dieser Figur. Matrix - Metalloproteinase-empfindliche Sonde Nachdem die Autofluoreszenz Subtrahieren Bilder der Protease-aktivierbare MMP - Sonde zeigte , Entzündung im Gehirn und Rückenmark in EAE - Mäusen (4A, Beispiele für 4 Mäuse pro Gruppe). Es gab kein Signal in Mäusen, die mit der Sonde nicht gespritzt, und ein schwaches Signal trat in einem EAE-Maus ohne klinische Symptome (non-responder). Bilder in Abbildung 4 zeigen das Signal bei Ex / Em 640/700 durch das Bild subtrahiert bei Ex / Em 675/720. Unterschiede zwischen den Behandlungen ergab , wurden erst nach der quantitativen Analyse der Strahlungswirkungsgrad in auto-ROIs nach der spektralen Entmischung (4B, ungepaarten 2-tailed t-Test, n = 6 und 4, P &lt;0,05). iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Bewertung der Metalloproteinase Aktivität mit Nahinfrarot-MMP-empfindlichen Imaging - Sonde. SJL / J-Mäuse erhielten Vehikel oder Medikamente (R-Flurbiprofen 5 mg / kg / d) von Tag 5 nach der Immunisierung. Bilder wurden 24 h nach der Injektion der Sonde (150 ul iv) bei der 1. EAE Peak erfasst, n = 6 und 4. Die Injektionsstellen PLP abgeschirmt wurden. EAE Non-Responder und Mäuse ohne MMP Sonde Injektionen wurden als Kontrollen verwendet. Jede 2 Bilder wurden bei Ex / Em 640/700 nm (spezifische Signal) und 675/720 nm (Autofluoreszenz) erfasst. Verwendung der spektralen Entmischung Werkzeug wurde der Auto-Fluoreszenz abgezogen und anschließend wurde das auto-ROI-Tool verwendet, um die Stellen von spezifischen MMP-Aktivität zu identifizieren. Die Gesamtstrahlungseffizienz wurde für die Quantifizierung verwendet. A) Beispiele für Epifluoreszenz Bilder in lebenden Mäusen eingefangen 24 Stunden nach der Injektion Sonde. Die Bilder sind das Ergebnis der Entmischung (UMX). Maßstabsbalken: 1 cm. LUT bars-Bereich von dunkelrot (Nieder-) bis gelb (hohe Intensität). B) Box - Plots die Quantifizierung der Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs zeigt. Die Box stellt den Quartilabstand, die Linie ist die mittlere und die Whiskers zeigen das Minimum zum Maximum. Der Stern zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (2-sided ungepaarten t-Test, P &lt;0,05). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55321/55321fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen.

Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

bioluminescence-near-infrared-imaging-optic-neuritis-brain

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K Aufrufe.  University Hospital Frankfurt.  Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen. 

Serie: Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) intravaskuläre Molecular Imaging von entzündlichen Plaque, einen multimodalen Ansatz, um Imaging der Atherosklerose

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

Forschung

Medizin

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder resulting in progressive degeneration of motoneurons. Peak of onset is around 60 years for the sporadic disease and around 50 years for the familial disease. Due to its progressive course, 50% of the patients die within 30 months of symptom onset. In order to evaluate novel treatment options for this disease, genetic mouse models of ALS have been generated based on human familial mutations in the SOD gene, such as the SOD1 (G93A) mutation. Most important aspects that have to be evaluated in the model are overall survival, clinical course and motor function. Here, we demonstrate the clinical evaluation, show the conduction of two behavioural motor tests and provide quantitative scoring systems for all parameters. Because an in depth analysis of the ALS mouse model usually requires an immunohistochemical examination of the spinal cord, we demonstrate its preparation in detail applying the dorsal laminectomy method. Exemplary histological findings are demonstrated. The comprehensive application of the depicted examination methods in studies on the mouse model of ALS will enable the researcher to reliably test future therapeutic options which can provide a basis for later human clinical trials.

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS

A mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is examined clinically and behaviorally. As a prerequisite for an accompanying immunohistological analysis the preparation of the spinal cord is depicted in detail.

Klinische Tests und Rückenmark Removal in einem Mausmodell für Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder resulting in progressive degeneration of motoneurons. Peak of onset is around 60 ...

Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to assess changes in myelination at the central nervous system (CNS). However, standard measurements, including routine visual tests and MRI scans, are not sensitive enough for this purpose. We present two visual tests addressing dynamic monocular and binocular functions which may closely associate with the extent of myelination along visual pathways. These include Object From Motion (OFM) extraction and Time-constrained stereo protocols. In the OFM test, an array of dots compose an object, by moving the dots within the image rightward while moving the dots outside the image leftward or vice versa. The dot pattern generates a camouflaged object that cannot be detected when the dots are stationary or moving as a whole. Importantly, object recognition is critically dependent on motion perception. In the Time-constrained Stereo protocol, spatially disparate images are presented for a limited length of time, challenging binocular 3-dimensional integration in time. Both tests are appropriate for clinical usage and provide a simple, yet powerful, way to identify and quantify processes of demyelination and remyelination along visual pathways. These protocols may be efficient to diagnose and follow optic neuritis and multiple sclerosis patients.
In the diagnostic process, these protocols may reveal visual deficits that cannot be identified via current standard visual measurements. Moreover, these protocols sensitively identify the basis of the currently unexplained continued visual complaints of patients following recovery of visual acuity. In the longitudinal follow up course, the protocols can be used as a sensitive marker of demyelinating and remyelinating processes along time. These protocols may therefore be used to evaluate the efficacy of current and evolving therapeutic strategies, targeting myelination of the CNS.

Object From Motion (OFM) and Time-constrained stereo protocols are sensitive tools to identify monocular and binocular dynamic visual function deficits, which are uniquely affected in optic neuritis patients. Furthermore, these tests may be used as quantitative noninvasive tools to assess the extent of myelination along visual pathways.

Dynamische Visuelle Tests zur Identifizierung und Quantifizierung von Visual Schäden und Reparaturen Nach Demyelinisierung in Optikusneuritis Patienten

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to ...

The Multiple Sclerosis Performance Test (MSPT): An iPad-Based Disability Assessment Tool

Precise measurement of neurological and neuropsychological impairment and disability in multiple sclerosis is challenging. We report a new test, the Multiple Sclerosis Performance Test (MSPT), which represents a new approach to quantifying MS related disability. The MSPT takes advantage of advances in computer technology, information technology, biomechanics, and clinical measurement science. The resulting MSPT represents a computer-based platform for precise, valid measurement of MS severity. Based on, but extending the Multiple Sclerosis Functional Composite (MSFC), the MSPT provides precise, quantitative data on walking speed, balance, manual dexterity, visual function, and cognitive processing speed. The MSPT was tested by 51 MS patients and 49 healthy controls (HC). MSPT scores were highly reproducible, correlated strongly with technician-administered test scores, discriminated MS from HC and severe from mild MS, and correlated with patient reported outcomes. Measures of reliability, sensitivity, and clinical meaning for MSPT scores were favorable compared with technician-based testing. The MSPT is a potentially transformative approach for collecting MS disability outcome data for patient care and research. Because the testing is computer-based, test performance can be analyzed in traditional or novel ways and data can be directly entered into research or clinical databases. The MSPT could be widely disseminated to clinicians in practice settings who are not connected to clinical trial performance sites or who are practicing in rural settings, drastically improving access to clinical trials for clinicians and patients. The MSPT could be adapted to out of clinic settings, like the patient&#8217;s home, thereby providing more meaningful real world data. The MSPT represents a new paradigm for neuroperformance testing. This method could have the same transformative effect on clinical care and research in MS as standardized computer-adapted testing has had in the education field, with clear potential to accelerate progress in clinical care and research.

The Multiple Sclerosis Performance Test MSPT: An iPad-Based Disability Assessment Tool

Precise measurement of neurological and neuropsychological impairment and disability in multiple sclerosis is challenging. We report methodologic details on a new test, the Multiple Sclerosis Performance Test (MSPT). This new approach to the objective of quantification of MS related disability provides a computer-based platform for precise, valid measurement of MS severity.

Die Multiple-Sklerose-Performance-Test (MSPT): Ein iPad-Based Disability Assessment Tool

Precise measurement of neurological and neuropsychological impairment and disability in multiple sclerosis is challenging. We report a new test, the ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Th17 Entzündung Modell Oropharyngeale Candidiasis in immundefizienten Mäusen

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

Eine Methode der trigonometrischen Modellierung der saisonalen Schwankungen mit Multipler Sklerose Relapse Daten zeigten,

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

A Protocol for the Use of Remotely-Supervised Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Multiple Sclerosis (MS)

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that uses low amplitude direct currents to alter cortical excitability. With well-established safety and tolerability, tDCS has been found to have the potential to ameliorate symptoms such as depression and pain in a range of conditions as well as to enhance outcomes of cognitive and physical training. However, effects are cumulative, requiring treatments that can span weeks or months and frequent, repeated visits to the clinic. The cost in terms of time and travel is often prohibitive for many participants, and ultimately limits real-world access. 
Following guidelines for remote tDCS application, we propose a protocol that would allow remote (in-home) participation that uses specially-designed devices for supervised use with materials modified for patient use, and real-time monitoring through a telemedicine video conferencing platform. We have developed structured training procedures and clear, detailed instructional materials to allow for self- or proxy-administration while supervised remotely in real-time. The protocol is designed to have a series of checkpoints, addressing attendance and tolerability of the session, to be met in order to continue to the next step. The feasibility of this protocol was then piloted for clinical use in an open label study of remotely-supervised tDCS in multiple sclerosis (MS). This protocol can be widely used for clinical study of tDCS.

A Protocol for the Use of Remotely-Supervised Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Multiple Sclerosis MS

The goal of this pilot study is to describe a protocol for the remotely-supervised delivery of transcranial direct current stimulation (tDCS) so that the procedure maintains standards of in-clinic practice, including safety, reproducibility, and tolerability. The feasibility of this protocol was tested in participants with multiple sclerosis (MS).

Ein Protokoll für den Einsatz von Remote-Betreute Transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS) bei Multipler Sklerose (MS)

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that uses low amplitude direct currents to alter cortical ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

Skelettmuskulatur neurovaskuläre Kopplung, Oxidative Kapazität und mikrovaskuläre Funktion mit "One Stop Shop" Nah-Infrarot-Spektroskopie

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...