Wir danken Matyáš Fendrych für das kritische Lesen / Betrachten und Stephan Stadlbauer für die Audiogeräte. Dank der Miba Machine Shop bei IST Österreich für ihren Beitrag zur OpenSPIM. Die Forschung zu diesen Ergebnissen geführt haben Mittel aus dem Programm Menschen (Marie-Curie-Maßnahmen) der Europäischen Union des Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter REA Finanzhilfevereinbarung Nr [291734] und European Research Council (ERC-Projekt-2011 erhalten -StG-20101109-PSDP).

1. Arabidopsis Anzucht vor der Bildgebung <ol><li> Bereiten Sie ½ MS - Medium (halbkonzentriertem Murashige und Skoog - Medium) durch Zusatz von 2,15 g MS-Medium, 10 g Saccharose, 0,97 g MES (2- (N - Morpholino) ethansulfonsäure) und 1 l ddH 2 O (doppelt destilliertem Wasser ) in einen 1-l-Flasche. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit KOH. </li><li> Werden 15 g / l Gellan gum zum ½ MS Medium autoklaviert und für 20 min bei 121 ° C. </li><li> Gießen 30 ml des heißen Mediums in quadratische Petrischalen (245 x 245 x 25 mm), um eine Gelschicht mit einer Dicke von etwa 2 mm zu schaffen. Lassen Sie die Gerichte auf Raumtemperatur abkühlen, um das Medium lassen sich zu verfestigen. </li><li> Setzen Sie sterilisierten Arabidopsis Samen in ein 1,5 - ml - Reaktionsröhrchen mit 1 ml sterilem H 2 O , die Samen mit einer Glaspipette Pick - up oder eine 1000 ul Pipettenspitze und säen sie auf die Oberfläche des Gels. Legen Sie die Samen getrennt ca. 10 mm auseinander. Verschließen Sie die Platte mit Klebeband. </li><li> Inkubiere die Platte für 24 h bei 4° C (Schichtung). </li><li> Pflegen Sie die Platte in einem Wachstums Inkubator, zB bei 22 ° C in einem 16/8 h Tag / Nacht - Zyklus mit 120-140 &amp; mgr; mol / m² / s Lichtmenge für 6 Tage. Bis zu 10 Tage alten Pflanzen eingesetzt werden. </li></ol> 2. Pflanzenprobenvorbereitung Hinweis: Der Probenhalter kann entweder 3D - Druck oder die Hand in eine Maschine Werkstatt hergestellt unter Verwendung der dargestellten Dimensionen in 2C. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Siehe den Link in der Materialliste der 3D-Druck zu bestellen. <ol><li> 5 g niedrigschmelzende Agarose in einen 50 ml-Flasche mit 50 ml MS-Medium ½ und autoklaviert für 20 min bei 121 ° C. </li><li> Aliquot der 1% niedrigschmelzende Agarose-Lösung in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Lagerung bei 4 ° C (für mindestens zwei Monate verwendet werden). </li><li> Schmelzen Sie eine aliquote Menge von 1 %% niedrigschmelzende Agarose bei 80 ° C und lassen Sie es abkühlen33 ° C. </li><li> Reinigen Sie den Probenhalter in einem Ultraschallgerät. Sterilisieren Sie den Probenhalter mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser. </li><li> Schneiden Sie das Gel um die Pflanze mit einem Skalpell. </li><li> Heben Sie den Block mit einem flachen Spatel und schieben Sie sie vorsichtig auf den Probenhalter eine zweite Spachtel. </li><li> Kleben das Gel auf den Probenhalter mit 1% Agarose (bei 33 ° C) unter Verwendung einer 100 &amp; mgr; l-Pipette. </li><li> Kleben Sie die Anlage auf dem Gel mit 1% Agarose unter Verwendung einer 10 &amp; mgr; l-Pipette. Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop, um zu überprüfen, dass die Blätter nicht mit Gel bedeckt sind. Sie nicht das Gel direkt auf die interessierende Region zu positionieren. </li><li> Um zu verhindern, die Pflanze vor dem Austrocknen, ohne Unterbrechung arbeiten. Setzen Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Verwenden Sie die Pipettenspitze als eine Kappe und schieben Sie sie vorsichtig über ein Ende des Probenhalters in dem die Anlage steht. </li><li> Setzen Sie den Probenhalter in einer Pipettenspitze Feld und bereiten mehr Pflanzen, wenn nötig. Pflanzen können Richtungen seintly abgebildet oder im Wachstums Inkubator zurückgestellt. </li></ol> 3. Das Mikroskop einrichten HINWEIS: Die LED-Beleuchtungssystem ist ein custom-built-Lampe. Die technischen Details erforderlich , um die LED-Ring zu bauen ist in Abbildung 3 und der Materialliste zu finden. Siehe die zusätzliche Materialdatei (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) für das Board-Design. <ol><li> Schrauben oder Kleber (zB doppelseitiges Klebeband) der LED - Ring an der unteren Seite des OpenSPIM x / y / z / θ-Stufe Arm. </li><li> Schließen Sie den LED-Ring mit einer einstellbaren Stromversorgung (0-30 V, max 2 A). </li><li> Einzustellen , die Spannung auf die gewünschte Lichtstärke (für Arabidopsis, 120-140 &amp; mgr; mol / m 2 / s, 3D). </li><li> Sterilisieren Sie die Probenkammer mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser. </li><li> Reinigen Sie das Objektiv mit Benzin und einem Objektivreinigungstuch. Sterilisieren der Objektivlinse mit 70% Ethanol. </li><li> Schließen Sie die perfusian Rohren zur Probenkammer in einer Einweganordnung. Setzen Sie einen 1-l-Flasche mit frischem ½ MS-Medium und eine weitere leere Flasche neben der peristaltische Perfusionspumpe. Schließen Sie die Flasche mit Medium, das mit dem unteren Einlass der Probenkammer ein Perfusions-Rohr. Schließen Sie den oberen Ausgang der Probenkammer mit der leeren Flasche, die die verwendete Medium unter Verwendung eines anderen Perfusion Rohr in den Papierkorb. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit auf 1 ml / min. ANMERKUNG: Um nicht die Probenkammer Überlaufen ist es wichtig, eine höhere Ausfluss als der Zufluß zu haben. Entweder die Pumprate zu erhöhen oder ein Rohr mit einem größeren Innendurchmesser für das Ausströmen verwenden. </li><li> Schneiden Sie eine schwarze Kunststofffolie in 3 mm kleine Quadrate, Waschen mit 70% Ethanol und trocknen lassen, bevor sie in der Probenkammer auf der Wasseroberfläche platzieren. </li><li> Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Probenhalter und legen Sie den Probenhalter in der Probenkammer. Wenn der neu hergestellten Probenhalter nicht in die Stufe Arm passt, mit einem feinen SandPapier es dünner zu machen oder einen O-Ring (∅ 6 mm) verwenden, falls sie zu dünn ist. </li><li> Um die Deckel schaffen, schneiden Sie die schwarzen Aluminiumfolie in zwei 50 x 25 mm große Stücke. Machen Sie ein 5 mm geschnitten in der Mitte einer Seite jedes Stück. Fold ein Dreieck Einbuchtung (Figur 1D) zu erzeugen. Schließen Sie die Probenkammer mit den beiden Deckeln durch den Deckel auf der Oberseite der Probenkammer mit dem Dreieck Vertiefungen setzen den Probenhalter gegenüber. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzenblätter nicht im Schatten der Lider und empfangen Licht von dem Beleuchtungssystem. </li><li> Finden Sie die Region von Interesse mit der x / y / z und Rotationsstufe eine neu auftretende Seitenwurzel im Blickfeld zu positionieren. </li><li> Vor der Aufnahme kann das System für mindestens 15 min äquilibrieren. </li><li> Richten Sie die Bildaufnahme. <ol><li> Legen Sie einen Stapel von 217 Bilder mit 3 &amp; mgr; m z-Abstand (650 &amp; mgr; m) und stellen Sie den Zeitablauf mit 15 min Abbildungsintervall für einen Zeitraum von insgesamt 17 Stunden. HINWEIS: Eine ausführliche Dokumentation zuwie die OpenSPIM Software bedienen kann auch gefunden werden (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Starte die Aufnahme. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie hat den großen Vorteil niedrige Phototoxizität und ultraschnelle Aufnahmegeschwindigkeit zu kombinieren, die verwendet werden können, ein großes Volumen mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen, während die Probe in einem physiologischen Zustand zu halten. Die Auflösung eines Lichtblatt - Mikroskop kann mit dem von einem konfokalen Mikroskop 9 verglichen werden. Jedoch tritt Lichtstreuung und Absorption entlang der Anregungs- und Emissionspfad individuell und die Gesamtbildqualität kann innerhalb opaken Gewebe im Vergleich zu der Oberfläche deutlich geringer sein. Um diese Komplikation zu umgehen kann man die Möglichkeit verwenden, um die Probe entlang der vertikalen Achse zu drehen, und das gleiche Volumen aus verschiedenen Richtungen beobachten. Aber dies ist nicht immer von Vorteil, zB Seitenwurzeln entstehen auf der einen Seite der Wurzel und Bildgebung von hinten führt zu einer niedrigen Bildqualität ohne weitere Informationen zu gewinnen. Jedoch kann die Drehung hauptsächlich die samp Positionierung verwendet werden,le in der besten Weise. Die klassische horizontale Anordnung der Objektive ermöglicht neue Wege der Probenmontage. Pflanzen profitieren von einer vertikalen Position. Hier vorgestellte, die &quot;auf der Oberfläche des Gels&quot; Montageverfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Befestigungsarten , wie beispielsweise die Wurzel innerhalb eines Gels 24,25 einzubetten. 1) Das Wurzelsystem ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium. Die Probenkammer ist mit einem Perfusionssystem verbunden, die kontinuierlich frisches Medium zur Verfügung stellt. Es kann auch schnell verwendet werden, um das gesamte Volumen der Probenkammer auszutauschen, um verschiedene Medien oder Medikamente anwenden. 2) Vor der Probenvorbereitung Pflanzen wachsen, wie sie in Laboratorien verwendet werden, um zu wachsen. Die Pflanzen können müssen die gewünschten Pflanzen vorbereitet werden unter einem Fluoreszenzmikroskop und nur dann ausgewählt werden. 3) Die Anlage ist aus der Petrischale an den Probenhalter übertragen, ohne berührt zu werden. Dadurch kann die Anlage weiter zu entwickeln auf dem gleichen Gel wurde in der Wachstums incubato wachsen aufr und mechanische Beanspruchung auf ein Minimum reduziert. 4) Die Ansicht auf der Probe ist frei und optische Aberrationen minimiert werden, da der Raum zwischen der Probe und dem Erfassungsziel nur mit Medium und keine anderen Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes gefüllt ist. Um eine langfristige Bildgebung, die Anlage Beleuchtungssystem zur Durchführung notwendig photosynthetische Aktivität der Anlage zu gewährleisten. In den meisten Laboratorien Pflanzen wachsen auf einem transparenten Gel, dh die Wurzeln Licht ausgesetzt werden. Dies kann unterschiedliche Reaktionen auf ihre Umwelt verursachen und induziert Veränderungen in ihrer Biochemie und Entwicklung 26,27. Um zu reduzieren, wurde die Menge des Lichts auf das Wurzelsystem, schwarze Plastikfolie verwendet, um die Wasseroberfläche sowie einen Deckel aus schwarzem Aluminiumfolie zu bedecken bedeckt die Probenkammer. Licht kann die Anlage verlässt durch das zentrale Loch im Deckel erreichen. In dieser Konfiguration wurde kein Anstieg der Hintergrundlicht beobachtet, suggesting, die die Menge an Streulicht von den roten und blauen LEDs wesentlich durch die GFP-Filter und die Abschattung Ansätze reduziert wurde. Dies erlaubt das Licht während der Bildaufnahme gedreht zu halten, ohne die Kamera Hintergrundrauschen zu erhöhen. Der Probenhalter ist für den 3D-Druck entwickelt. Jedoch ist die Auswahl des Materials wichtig, da einige Kunststoffe, die nicht zu 100% stabil getestet wurden, waren, in einer Drift der Probe resultiert. Daher wird empfohlen, Harze stattdessen zu verwenden oder den Probenhalter aufzubauen, indem ein Polyethylen (PEP) Stange Fräsen. Wenn ein Lichtbogen Mikroskopaufbau mit einem doppelseitigen Beleuchtungssystem unter Verwendung der Halter Probe könnte mit einer der Licht Blätter stören auf dem Drehwinkel abhängig. während Schöpfen die Pflanze von der Platte, mit einem flachen Winkel der Spachtel, um mechanische Belastung zu reduzieren. Die Anlage kann schnell austrocknen und Erfahrung Luftstrom zum ersten Mal. Versuchen Sie, jede Zugluft zu vermeiden (schnelle Bewegungen, Klimaanlage Fluss), work ohne Unterbrechung und schieben Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Im Inneren des Mikroskops ist es entscheidend, die ganze Pflanze in Flüssigkeit nicht tauchen und die Blätter trocken halten. Die Technik ist ideal für frühe Stadien der Seitenwurzelbildung Bildgebung. Wenn langfristige Darstellung von reifen Wurzelspitzen durchführt, muss man bedenken, dass Arabidopsis Wurzeln mit 100-300 &amp; mgr; m / h wachsen schnell aus dem Blickfeld. Eine sehr nützliche zukünftige Implementierung könnte ein automatisiertes Tracking-Algorithmus sein, der folgende Wurzelspitze Wachstum über längere Zeiträume ermöglichen würde. Die Fähigkeit, Umgebungsbedingungen zu steuern, wie Licht und Nährstoffzusammensetzung des Mediums während des Akquisitionsprozesses ermöglicht es zu untersuchen, wie Pflanzen an Veränderungen anpassen. Die Wurzel ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium, die verwendet werden können Medikamente anwenden , um chemisch - Genexpression, beispielsweise unter Verwendung des Dexamethason induzierbar 28 oder die β-estr aktivierenAdiol induzierbares System 29. Allerdings dauert es Zeit, um das gesamte Volumen der Probenkammer zum Austausch eines Arzneimittels auszuwaschen. Das Setup kann durch Minimieren des Volumens der Probenkammer verbessert werden Mediumaustausch zu beschleunigen. Dennoch hat diese Technik ein großes Potenzial. Die Kombination von Montageverfahren, standardisierte Anbaubedingungen und die sanfte Bildaufnahme mit Hilfe von Licht-Blatt-Mikroskopie ermöglicht Langzeitstudien der Pflanzenentwicklung mit hoher Auflösung auf physiologischer Ebene. Dies wird den Forschern helfen, grundlegende Mechanismen der pflanzlichen Entwicklung zu erforschen.

Eine der wichtigsten Fragen für das Verständnis der Pflanzenentwicklung ist, wie einzelne Zellen während der Organ Differenzierung und das Wachstum verhalten. Idealerweise können zelluläre Ereignisse, wie Genexpressionsmustern und intrazelluläre Proteinlokalisation, in dem Licht einer größeren Kontext des Gewebes gesehen werden. Dieses Ziel stellt technische Herausforderungen und erfordert ganze Organ Beobachtung mit einer hohen räumlichen sowie zeitlichen Auflösung über längere Zeiträume, die phototoxische Effekte verursachen können. Da Pflanzen auf Umweltveränderungen schnell anzupassen, sind die Wachstumsbedingungen streng kontrolliert werden. Um mit dem physiologischen Zustand der Anlage ohne störende Langzeit-Bildgebung zu tun, müssen drei Dinge sichergestellt, 1) Wachstumsbedingungen in der Probenkammer sein, 2) stabile Probe über lange Zeiträume Montage und 3) die Abbildungs mit geringen Lichtintensitäten Foto-Schäden und nicht-physiologischen Bedingungen zu vermeiden. Physiologische wachsenden conditions in der Kammer Mikroskop Probe sind von entscheidender Bedeutung für die langfristige Experimente. Es gibt eine Reihe von Protokollen zur Verfügung , die Abbildungswachstumskammern für konfokale Mikroskope 1 beschreiben - 3. Jedoch führt der konfokalen Mikroskopie eine hohe Lichtintensität auf die Anlage, die 4 Antworten Stress und in der Regel hemmt das Wachstum führen kann. Darüber hinaus erlauben die meisten herkömmlichen Mikroskopen nur horizontale Positionierung der Probe, die für die Pflanzen nicht optimal ist, da sie versuchen, sich neu zu orientieren und zu dem Vektor der Schwerkraft wachsen. In den letzten zehn Jahren hat sich Lichtbogen - Mikroskopie als ein mächtiges Werkzeug entstand die Entwicklung von großen Proben bei zellulärer Auflösung für Zeiträume von bis zu mehreren Tagen 5 zu erfassen - 9. Lichtbogen - Mikroskopie ermöglicht es, die Probe vertikal positioniert und wird zunehmend in der Pflanzenforschung verwendet Wurzelentwicklung studieren 10-21, kürzlich rezensiert von Berthet und Maizel 22. Viele der genannten Studien 10,13 - 18,21 wurden im Labor von Ernst HK Stelzer optimiert und führten eine besondere Art der Probe unter Verwendung Halterung 17 durch Züchten der Wurzel auf der Oberfläche eines Gels gekennzeichnet. In diesen Studien wurde eine maßgefertigte Mikroskop verwendet wird, in dem die Pflanze aus dem Boden gehalten wird. Im Gegensatz dazu halten die Mehrheit der breit verfügbaren Lichtbogen Mikroskope die Probe von der Spitze. Somit ist diese besondere Herstellungsverfahren nicht ohne weiteres angewendet werden können. Die hier vorgestellte Methode liefert ein Protokoll für die gut etablierte auf Oberflächenmontageverfahren anwendbar für die OpenSPIM 23, einem Open - Access - Plattform für die Anwendung und Verbesserung der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM). Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es langfristige Bildgebung von Arabidopsis Wurzeln in der OpenSPIM Lichtbogen Mikroskop zu ermöglichen. Dies wird durch das Züchten einer Pflanze aufrecht auf den s erreichturface eines Gels mit den Wurzeln in einem flüssigen Medium, während die Blätter in der Luft bleiben. Um die photosynthetische Aktivität der Pflanze, eine maßgeschneiderte Beleuchtungssystem , um sicherzustellen , beleuchtet die Blätter , aber nicht die Wurzeln (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Agarose, low melting</td>
			<td >VWR</td>
			<td >AFFY3282125GM</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black aluminum foil</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >BKF12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black plastic foil</td>
			<td >Carl Roth</td>
			<td >HT83.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED blue (453 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LD&#160;CN5M-1R1S-35-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED red (625 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LR T66F-ABBB-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED board - PCB design software</td>
			<td >Cadsoft Eagle</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MES monohydrate</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M1503.0100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropore Surgical Tape</td>
			<td >3M</td>
			<td >1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murashige &#38; Skoog Medium (MS-Medium)</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M0221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phytagel&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P8169</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sample holder 3D print</td>
			<td>i.materialise</td>
			<td ><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square petri dishes (245x245x25 mm)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >734-2179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >84097-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

Dieses Probenherstellungsverfahren ermöglicht den Anbau der Pflanze in der Kammer Mikroskop Probe , während das Wurzelsystem mit einem Lichtbogen Mikroskop (Abbildung 1) zu beobachten. Die Pflanze wächst auf der Oberfläche einer Schicht aus Gel (½ MS Medium , 1,5% Gellangummi enthielt) auf einem kundenspezifischen Probenhalter montiert ist (Abbildung 2). Der Probenhalter ist 3D mit einem transparenten Harz als Material gedruckt. Eine künstlich hergestellte Version die Dimensionen hervorzuheben ist in 2C dargestellt. Die Wurzeln werden in Flüssigkeit (½ MS-Medium) eingetaucht, die kontinuierlich von einem Perfusionssystem aktualisiert wird. Die Blätter bleiben in der Luft und werden kontinuierlich mit einer Lichtintensität von 130 &amp; mgr; Mol / m² / s Herkunft aus blauen und roten LEDs beleuchtet , die über der Anlage (1A, B und 3A-C) in einem Ring angeordnet sind. Der LED-Ring ist in unserer Maschine Werkstatt gefertigt undWir bieten technische Details, wie die LED-Ring in der Abbildung 3 und der Materialliste zu bauen. Die Lichtintensität kann kontinuierlich im Bereich angepasst 30-250 &amp; mgr; mol / m 2 / s (3D). Das Wurzelsystem wird durch kleine Platten aus einer schwarzen Kunststofffolie Abdecken der Wasseroberfläche (Abbildung 1) schattiert. Jede Streulicht von der Beleuchtung, die durch die Erfassungslinse gesammelt wird , wird durch das GFP - Filter (3E) filtriert. Mit diesem Aufbau wurde 17 h ein Zeitraffer einer wachsenden Arabidopsis Seitenwurzel verzeichnete einen 20X / 0,5 Objektiv (Abbildung 4) verwendet wird . Die seitliche Wurzel hat seinen Ursprung in der Perizykel Zellschicht, die sich innerhalb der primären Wurzel tief liegt. Um die Abbildungseigenschaften noch tiefer im Inneren eines Gewebes für längere Zeitperioden eine höhere Vergrößerung (40x / 0,75) wurde zu demonstrieren, verwendet, um die Bildung eines seitlichen ro einzufangenot von der ersten Stufe bis primordium die Entstehung aus der primären Wurzel innerhalb einer Zeitdauer von 38 h (Figur 5). Eine beispielhafte 2D - Schicht des Datensatzes ist in Fig. 5B. Diese Aufnahme erlaubt es uns , die Dynamik der Seitenwurzelbildung in 3D mit einem zellulärer Auflösung (5A) zu folgen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die Anbaubedingungen im Inneren des OpenSPIM Probenkammer. A) Skizze der Imaging - Kammer. Die Pflanze wächst aufrecht auf der Oberfläche eines Gels, montiert auf einem kundenspezifischen Probenhalter eingebaut (siehe auch 2). Die Wurzeln wachsen in einem flüssigen Medium, die kontinuierlich durch ein Perfusionssystem ausgetauscht wird. Die Blätter der Pflanze in der Luft wachsen und werden von roten und blauen LEDs beleuchtet (siehe auch Abbildung 3). Das Wurzelsystem ist wit schattiert<html> h kleine Blätter eines schwarzen Plastikfolie bedeckt die Wasseroberfläche. Ein Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie verringert weiter die Menge an Licht, unter der Wasseroberfläche und hält Feuchtigkeit in der Probenkammer. Das vergrößerte Panel auf der rechten hebt die Pflanze auf der Oberfläche eines Blocks von Gel in das flüssige Medium eingetaucht wächst. Ein Tropfen Agarose ersteigt die Wurzel auf das Gel. Die gestrichelten Kästchen zeigt die Region von Interesse durch das Mikroskop beobachtet. B) Fotografie der Abbildungskammer (ohne Deckel). Numbers (1) - (10) in A und B: (1): x / y / z / θ-Stufe mit LED - Ring, (2): Probenhalter, (3): Deckel (4): Arabidopsis thaliana (5): Blätter aus schwarzem Kunststoff-Folie, (6): Perfusionssystem, (7): Erkennung Objektivlinse (8): flüssiges Medium, (9): Probenkammer (10): Beleuchtungsobjektivlinse. C) wird der Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie hergestellt.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Probenhalter. A) 3D - Modell. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial zur Verfügung gestellt. B) Fotografie von 3D - Drucke mit unterschiedlichen Materialien (1) - (3): transparentem Acryl Kunststoff, (4) und (5): Harz, (6): transparentes Harz. C) Technische Zeichnung des Probenhalters, Zahlen repräsentieren Millimeter. D) Foto des hergestellten Probenhalter mit einer Anlage montiert. Die gestrichelten Bereich kann durch das Mikroskop beobachtet werden. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> laden / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: Pflanzenbeleuchtung Setup. A) Schemaschaltbild der Lampe. Paare von LEDs für die Richtungs Blitz ein- / ausgeschaltet einzeln. LED: Leuchtdiode, R: Widerstand, T: Transistor, JP: Stecknadelkopf. Leiterplatte): B) Das endgültige Design der Beleuchtungslampe wurde mit einer PCB-Software (PCB gezogen. Wir stellen die Board-Design-Datei in dem Zusatzmaterial. Die Platte wurde dann hergestellt und in unserem Institut der MIBA Maschinenhalle zusammengebaut. C) Fotografie des LED - Ring eingeschaltet. Vier Paare von einer roten und einer blauen LED sind in einem Ring angeordnet. D) Der Spannungsbereich zwischen 3,5 V und 14,0 V. Die Widerstände eingestellt werden verwendet , um die Lichtmenge von 30 bis 250 &amp; mgr; mol / m 2 / s (R1-8 bis hin zu erreichen: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) Das Emissionsspektrum der Lampe, und GFP YFP.<html> tp: //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Abbildung 4: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Die 5-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 217 Bilder (3 &amp; mgr; m z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 17 h Aufnahme mit Hilfe einer Linse 20X / 0.5 erfasst. A) Vier Zeitpunkte von 69 sind in einer maximalen Intensitätsprojektion gezeigt. B) Sechs von 217 einzelnen Scheiben eines z-Stapel von einem Zeitpunkt gezeigt. Maßstabsbalken in A und B 100 um.Last / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Abbildung 5: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Der 6-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 200 Bildern (1,5 um z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 38 h Aufnahme unter Verwendung einer Linse 40x / 0,75 erfasst. A) 3D - Rendering von vier Zeitpunkten stellen die Zahlen in der Tabelle um, B) einzelne Scheibe durch die zentrale Ebene der Hauptwurzel. Maßstabsbalken entspricht 50 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">Bitte</a>hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Das 3D-Modell-Datei zur Verfügung gestellt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Ergänzende Datei LED Ring Board.brd. Die Board-Design-Datei zur Verfügung gestellt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

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Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

light-sheet-fluorescence-microscopy-plant-roots-growing-on-surface

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Aufrufe.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Serie: Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Forschung

Biologie

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...