This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

Tierversuche wurden vom lokalen Komitee des Kantons Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) zugelassen. 1. Herstellung von Xenopus - Oozyten <ol><li> Pflegen Frösche (Xenopus laevis) auf einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel - Zyklus in Wasser , das streng bei 20 ° C gehalten wird. </li><li> Entfernen Sie die Lappen der Ovarien von weiblichen Frösche 9. HINWEIS: Die Entfernung der Lappen ist ein Anreiz für die Regeneration und häufig die Qualität der Oozyten verbessert sich mit der Operation. Die Eizelle wird durch eine Dotterschicht, eine Schicht von Follikelzellen und Bindegewebe enthalten , die Blutgefäße 21 abgedeckt. Die gesamte Struktur ist die &quot;Follikel&quot; bezeichnet. </li><li> Legen Sie die Lappen der Ovarien , die dicht gepackt sind mit den Follikeln die Eizellen in sterilen Barth Saline 7 (MBS) , ergänzt mit Penicillin und Streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mMNaHCO 3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin). </li><li> Einzel-out Stufe V-VI 21 Follikel. Halten Sie die Ovar Lappen mit einer Pinzette. Senken Sie die Platin - Schleife (Abbildung 1) über die Follikel und sanft die Schleife zurückziehen das Bindegewebe mit dem Follikel aus dem Eierstockgewebe zu zerstören. HINWEIS: Stufe V-VI 21 Follikel durch ihre Größe gekennzeichnet sind (1,0 bis 1,2 mm Durchmesser) und durch den guten Kontrast zwischen dem dunklen pigmentierten Tier Hemisphäre und der gelblichen pflanzlichen Hemisphäre. </li><li> Übertragen Sie nur gesund aussehende Follikel (dh perfekt sphärisch und mit intakten Pigmentierung) zu einem Durchmesser von 35 mm Petrischale mit Hilfe einer Plastik Pasteur - Pipette (schneiden Sie die zurück zu einem Öffnungsdurchmesser von 1,5 mm). </li></ol> Anmerkung: Die hier beschriebenen Mikroinjektionssystem von der durch Kressmann und Birnstiel 22 berichtet abgeleitet ist. <ol><li> Bereiten cRNAs von den entsprechenden cDNAs kodierend für die Untereinheiten der α 4 β 2 δ GABA A Rezeptor durch in vitro Transkription, die Zugabe eines Poly (A +) -Schwanz und RNA Quantifizierung durch Gelelektrophorese 23. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektion Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,0 mm Außendurchmesser (OD), 0,58 mm Innendurchmesser (ID), 100 mm Länge) mit einer Mikropipette Puller. Brechen Sie die Spitzen der Glaskapillaren unter einem Mikroskop mit einem Mikromanipulator und microfilament mit einem Spitzendurchmesser von 12 zu schaffen - 15 &amp; mgr; m mit einer abgeschrägten Spitze. </li><li> Verfüllen die Mikroinjektionspipette mit Paraffinöl mit einem 10-ml-Spritze und dann montieren Sie die Mikroinjektionspipette auf ein selbstgebautes microinjection Vorrichtung (Abbildung 2). HINWEIS: Die Selbstbau ölhydraulische Injektionsgerät besteht aus einem Grill Motor durch einen Fußschalter gesteuert. Ein zusätzlicher Schalter verändert den Drehbetrieb des Motors. Dieser Motor treibt eine Mikrometerschraube (0,5 mm / Umdrehung), die vor- oder zurückzieht, um den Kolben einer 10 &amp; mgr; l-Glasspritze. Die Injektion mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 Upm und eine 0,5 wiederum entspricht einer 50 nL Injektion in einen Follikel. Die Spitze der Spritze verbunden ist dickwandig Polytetrafluorethylen Schlauch, der sich an der Injektionsnadel durch ein sehr kurzes Stück Tygon-Schlauch verbunden ist. Die Injektions Kapillare wird durch ein Bohrfutter gehalten, die von einem Mikromanipulator gesteuert wird. Das gesamte System wird mit Paraffinöl gefüllt. Luftblasen sollten vermieden werden, da sie das Injektionssystem beeinträchtigt. Die Einrichtung ist mit einer Kaltlichtquelle beleuchtet. Ein Stereomikroskop ist für die optische Kontrolle erforderlich. Follikeln unter kaltem Licht mit einer stereomicr sichtbar gemachtOscope (40-facher Vergrößerung). Leistung der Einspritzaufbau wird durch die Injektion von radioaktiven Tracers in Xenopus Oozyten getestet. Ein Volumen von 45 - 55 nL sollte pro Injektion geliefert werden. </li><li> Mit einer Pipette mit einem sterilen Kunststoffspitze, testen Sie die Konfiguration durch einen Tropfen steriles Wasser auf die saubere innerhalb eines feuchtigkeitsbeständigen thermoplastischen Platzierung (2 x 2 cm). Tauchen Sie die Spitze der Injektionspipette in diesem Tröpfchen, und dann den Motor drehen Sie den Kolben (Unterdruck im Inneren der Injektionspipette) zurückzuziehen. HINWEIS: Das Wasser sollte die Pipette eingeben und eine sichtbare Schnittstelle mit dem Öl bilden. </li><li> Ziehen Sie die Spitze der Pipette aus dem Tröpfchen und gelten Überdruck auf der Innenseite der Injektionspipette. Ein Wassertröpfchen sollte an der Spitze der Injektionspipette bilden. </li><li> Vorbereitung für das Einspritzen der Follikel, indem sie sich mit den pflanzlichen Pole nach oben zeigend in den Zwischenräumen ein Nylonnetz (G: 0,8 mm) geklebt Futter auf den Boden eines Petri Schale (60 mm) mit MBS abgedeckt. </li><li> Dispense 2 &amp; mgr; l der mRNA eine Pipette mit einer sterilen Plastikspitze auf die saubere innerhalb eines thermoplastischen verwenden. Nehmen Sie die mRNA nach oben in die Injektionspipette durch Unterdruck auf der Innenseite der Injektionspipette aufgebracht wird. </li><li> Positionieren Sie die Injektionspipette über einen einzelnen Follikel mit dem Mikromanipulator. </li><li> Legen Sie die Injektionsnadel in der Mitte des vegetativen Pol und injizieren 50 nL der mRNA bei einer Flussrate von 0,6 &amp; mgr; l / min durch Überdruck auf der Innenseite der Pipette angelegt wird. Warten von 5 bis 10 s vor der Injektion Pipettenspitze aus dem Follikel zu entfernen mRNA Flucht zu verhindern. HINWEIS: Die mRNA sollte in das pflanzliche (gelblich) Pol injiziert werden, die Injektion in den Nucleus zu vermeiden, die in der Tier Hemisphäre befindet. </li><li> Übertragen Sie die injizierten Follikel auf eine neue Petrischale (35 mm), gefüllt mit 2 ml MBS. Die Schale in einen Weinkühler auf 18 ° C eingestellt. Inkubieren der injizierten Follikel für 1 -7 d vor der Aufnahme in Abhängigkeit von der Identität des neu exprimierten Proteins. </li></ol> 3. Abisolieren der Follikel (Figur 3) HINWEIS: Wie oben erwähnt, ist die Eizelle von einem vitelline Schicht Follikelzellen bedeckt und Bindegewebe, die die Blutgefäße 24 enthält, ist bekannt als &quot;Follikel.&quot; Alle Schichten mit Ausnahme der Dotterschicht, die ohne verhindert den Zugang von Lösungen an die Zelloberfläche mechanische Stabilität bietet, muss vor elektrophysiologischen Experimenten entfernt werden. Der Follikel ohne die umgebenden Zellschichten hat zuvor eine &quot;entblößten&quot; Eizelle 25 bezeichnet worden. Dieser Schritt wird in der Regel am selben Tag wie die elektrophysiologischen Experimenten durchgeführt. <ol><li> Transfer zehn injiziert Follikel mit einem Rohr Borosilicatglas 0,5 ml MBS, 1 mg / ml Kollagenase und 0,1 mg / ml Trypsin-Inhibitor enthält. Eintauchen des Rohres in ein Wasserbad bei 36 ° C gehalten. inkubieren derFollikel für 20 Minuten und schütteln gelegentlich die Rohre. </li><li> Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre. </li><li> Übertragung der Follikel mit einem dritten Rohr mit 0,5 ml doppelt konzentrierter MBS , enthaltend 4 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N &#39;, N&#39;- tetraessigsäure (EGTA), und inkubiere sie für 4 min bei RT. Das Röhrchen wird gelegentlich. HINWEIS: Die hypertonischen Lösung (doppelt konzentriert MBS) wird verwendet, innerhalb Follikel Zellschichten Schrumpfung der Eizellen zu induzieren, wodurch follikulären Zellschichten von der Eizelle löst; EGTA zugegeben Kollagenase-Aktivität zu hemmen. </li><li> Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre. </li><li> Übertragen Sie die Eizellen in eine Petrischale (35 mm Durchmesser), die 2 ml MBS. Unter einem Stereomikroskop, trennen Sie die äußeren Hüllen aus den Follikeln voneinfaches Drücken die nackte Eizelle entfernt die Platin-Schleife. HINWEIS: Die äußeren Einhüllenden der Oozyten fest an der Kulturschale haften und leicht aus den Oozyten getrennt werden können. Einige Eizellen spontan ihre äußeren Hüllen verlieren und als entblößte Eizellen gewonnen werden. Dieses Verfahren führt zu einer relativ stabilen Präparation, die die kugelförmige Erscheinung der Oozyten hält. </li></ol> 4. Schnelle Lösung Ändern Sie rund um die Oozyten <ol><li> Führen Sie eine Spannungsklemm Experiment, wie 9,26 beschrieben. </li><li> Ändern, um die Lösung der Schwerkraft gespeisten Perfusionssystem durch die Perfusion Schalter drehen, wie durch den Versuch benötigt. <ol><li> Gelten die Perfusionslösung bei 6 ml / min durch eine Glaskapillare mit einem Innendurchmesser von 1,35 mm, die Mündung davon platziert ist etwa 0,4 mm von der Oberfläche der Oozyte, schnelle Veränderungen der Agonistenkonzentration zu erlauben um die Eizelle. HINWEIS: Die Änderungsrate war vorher Schätzungd als 70% in weniger als 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Methoden , die in diesem Artikel beschriebenen abweichen von denen traditionell 7-9 verwendet. Es ist Standard , um die Lappen der Ovarien auf eine 1 bis 2 h Kollagenasebehandlung 8 zu exponieren; isolieren unbeschädigte, entblößte Eizellen; und injizieren sie mit mRNA kommerzielle Injektionsgeräte verwenden. Dieses klassische Verfahren hat die folgenden Nachteile: 1) Die Oozyten werden wahrscheinlich durch die lange Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von Kollagenase beschädigt werden. 2) Die instabilen entblößte Eizellen müssen bis zum Experiment gespeichert werden. 3) Denuded Eizellen sind eher bei der Mikroinjektion als Follikel zu leiden. Kommerzielle Injektionsvorrichtungen verwenden mit großem Durchmesser (etwa 20 um), Injektionsnadeln, wahrscheinlich in einer relativ hohen Rate einer Beschädigung führen. Die Vorteile des verbesserten Verfahrens hier beschrieben sind, sind wie folgt: Die Einwirkung der Kollagenase ist auf 20 min, denudierten Oozyten haben nicht gespeichert zu werden, und die kleinen Spitzendurchmesser der Pipetten (etwa 12 bis 15 um) für microinjecti verwendetauf erfordert keine vorherige &quot;defolliculation&quot; der Follikel für die mRNA-Injektion. Der einzige kritische Schritt besteht darin, dass die Follikel Inkubationstemperatur in Kollagenase-Lösung sollte sorgfältig auf 36 ° C eingestellt werden, und es sollte nicht überschreiten. Lösungs Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten, sehr oft die Lösung in der Messkammer geändert wird, die eine erhebliche Menge an Zeit in Anspruch nimmt, je nach Größe der Kammer und der Durchblutungsrate. Mit Hilfe der Perfusion Kapillare vermieden dies. Der größte Nachteil der Expression von Ionenkanälen in Xenopus Oocyten ist ihre giant Größe. Die Spannungssteuerung schneller als etwa 2 ms ist schwierig und sehr schnell (&lt;0,5 s) Lösung Änderungen erfordern aufwendige Verfahren. Weiterhin stark hydrophoben Substanzen können fast irreversibel an das Eigelb der Eizelle gebunden sein. Die Methoden, die hier skizziert haben uns erlaubt, zu untersuchenin einer zeitsparenden Weise die funktionellen Eigenschaften von rekombinanten GABA A Rezeptoren, deren Modulation durch synthetische Verbindungen und Pflanzenstoffe, deren Untereinheit Anordnung und die Lage der Arzneimittelbindungsstellen in Rezeptoren verschiedener Untereinheit Zusammensetzung. Die hier beschriebenen Methoden sind für die Expression von jedem Protein der Wahl in der Xenopus Oozyte geeignet. Die sehr einfache Methode für die schnelle Lösung Änderungen des Mediums, um die Eizelle kann auf die Untersuchung von jeder ligandengesteuerten Ionenkanal oder einen Träger aufgetragen werden.

Xenopus Oozyten werden als Expressionssystem (- 3 und den darin References 2) weit verbreitet. Sie sind in der Lage, richtig montieren und funktionell aktiven Multiunter Proteine ​​in ihre Plasmamembranen integrieren. Mit diesem System ist es möglich, Membranproteine ​​allein oder in Kombination mit anderen Proteinen funktionell zu untersuchen, um die Eigenschaften von mutierten, chimäre oder verketteten Proteine ​​zu studieren, und potentielle Arzneimittel zu screenen. Vorteile von Oozyten über andere heterologe Expressionssysteme umfassen die einfache Handhabung der Riesenzellen, die hohen Anteil an Zellen, die fremde genetische Information, die einfache Steuerung der Umgebung der Oocyte durch Bad-Perfusion, und die Kontrolle des Membranpotentials mit Hilfe . Der Nachteil dieses Expressionssystem ist die saisonalen Schwankungen in vielen Laboratorien , 17-20. Der Grund für diese Variationbei weitem nicht klar ist. Zusätzlich wird die Qualität der Oozyten oft stark zu variieren beobachtet. Traditionelle Methoden 7-9 haben die Isolierung von Ovar Keulen, die Exposition von Ovar Keulen zu Kollagenase für einige Stunden, um die Auswahl von entblößte Eizellen und die Eizelle Mikroinjektions enthalten. Hier wird eine Reihe von alternativen, schnellen Verfahren berichtet, dass erlaubt haben, uns mit diesem Expressionssystem arbeiten, um für mehr als 30 Jahren ohne saisonale Schwankungen und eine geringe Variation in Oozytenqualität. Die modifizierten und verbesserten Methoden , die hier für die Isolierung von Oozyten beschrieben, die Mikroinjektion mit cRNA und Entfernung von follikulären Zellschichten können für die Expression von jedem Protein der Wahl in der Xenopus Oozyten verwendet werden. Die sehr einfache Methode für die schnelle Lösung Änderungen des Mediums, um die Eizelle kann auf die Untersuchung von jeder ligandengesteuerten Ionenkanal und von Trägern aufgetragen werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1467">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">NaCl</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">71380</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P-9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">M-1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:663px;">CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">223560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:663px;">Ca(NO3)2&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">HEPES</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">15140-148</td>
			<td>100 &#956;g penicillin/ml and 100 &#956;g streptomycin/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Platinum wire loop</td>
			<td style="width:240px;">home-made</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:240px;">Zeitz-Instruments GmBH</td>
			<td style="width:136px;">DMZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringe&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">80300</td>
			<td>10 &#956;l, Type 701N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thick walled polytetrafluoroethylene tubing</td>
			<td style="width:240px;">Labmarket GmBH</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>1.0 mm OD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Paraffin oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">18512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Nylon net, gauge 0.8 mm&#160;</td>
			<td style="width:240px;">ZBF Z&#252;richer Beuteltuchfabrik AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Borosilicate glass tube&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">99445-12</td>
			<td>PYREX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Collagenase NB Standard Grade</td>
			<td style="width:240px;">SERVA</td>
			<td style="width:136px;">17454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T-9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">EGTA</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E3389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:240px;">Jencons (Scientific ) LTD.</td>
			<td style="width:136px;">H15/10</td>
			<td>1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:240px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:136px;">30-0019</td>
			<td>1.0 OD X&#160; 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:136px;">30-0044</td>
			<td>1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">&#947;-Aminobutyric acid (GABA)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">3&#945;,21-Dihydroxy-5&#945;-pregnan-20-one (THDOC)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">grill motor</td>
			<td style="width:240px;">Faulhaber&#160;</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">micrometer screw</td>
			<td style="width:240px;">Kiener-Wittlin</td>
			<td style="width:136px;">10400</td>
			<td>TESA, AR 02.11201</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Sterile plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:240px;">Saint-Amand&#160; Mfg.</td>
			<td style="width:136px;">222-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments

Die Xenopus Oozyten als heterologe Expressionssystem für Proteine, wurde zuerst von Gurdon et al. 1 und wurde seit seiner Entdeckung weit verbreitet (Referenzen 2 - 3 und Referenzen darin). Ein Merkmal, das die Eizelle attraktiv für ausländische -Kanalexpression macht , ist die schlechte Fülle von endogenen Ionenkanäle 4. Dieses Expressionssystem hat sich als nützlich für die Charakterisierung vieler Proteine ​​erwiesen, darunter Liganden-gesteuerte Ionenkanäle. Die Expression von GABA - A - Rezeptoren in Xenopus - Oozyten und ihre funktionelle Charakterisierung wird hier beschrieben, einschließlich der Isolierung von Oozyten, Mikroinjektionen mit cRNA, die Entfernung von follikulären Zellschichten und eine schnelle Lösung Veränderungen in elektrophysiologischen Experimenten. Die Verfahren wurden in diesem Labor 5,6 optimiert und weichen von den routinemäßig verwendeten 7-9 diejenigen. Traditionell werden entblößte Eizellen vorbereitetmit einer verlängerten Kollagenase Behandlung von Ovar Keulen bei RT und diese entblößte Oozyten werden mit mRNA mikroinjiziert. Verwendung der optimierten Methoden, diverse Membranproteine wurden mit diesem System exprimiert und untersucht, wie rekombinante GABA A -Rezeptoren 10-12, humanem rekombinantem Chloridkanäle 13, Trypanosom Kaliumkanäle 14 und eine myo - Inositol - Transporter 15, 16. Die Methoden , die hier beschrieben werden , können zur Expression jedes Proteins der Wahl in Xenopus Oozyten angewendet werden, und die schnelle Lösung Änderung verwendet werden kann andere Liganden-gesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen.

Xenopus - Oozyten wurden mit einer Platinöse mechanisch herausgehoben (Figur 1). 0,5: 2,5 fmol / Oocyte (Abbildung 2) Die Oozyten wurden mit mRNA kodierend für den GABA A -Rezeptor - Untereinheiten &amp; agr; 4 &amp; bgr; 2, δ, 0,5 mikroinjiziert. Nach 4 d wurden follicular Zellschichten entfernt werden (Abbildung 3). Oocyten wurden Spannung bei -80 mV eingespannt und ausgesetzt steigenden Konzentrationen von γ-Aminobuttersäure (GABA) in Gegenwart von 1 uM 3α, 21-dihydroxy-5α-pregnan-20-on (THDOC), ein potenter positive allosterische Modulator der GABA - A - Rezeptor. 4A zeigt ursprünglichen Stromspuren in einem solchen Experiment aufgezeichnet. 4B zeigt hervorgerufene Stromamplitude in Abhängigkeit von den GABA - Konzentrationen. Dies erlaubt die Bestimmung der Empfindlichkeit dieser Untereinheit-Kombination gegenüber GABA. Die einzelnen Kurven wurdenausgestattet und standardisiert auf I max und gemittelt anschließend. Die Gleichung war ich (c) = I max / (1+ (EC 50 / c) n), wobei c die Konzentration von GABA ist, 50 EG die Konzentration von GABA (in Gegenwart von 1 &amp; mgr; M THDOC) Hervorrufen einer Hälfte - maximale Stromamplitude ist I max der maximale Stromamplitude, I die Stromamplitude ist, und n der Hill - Koeffizient. Die EG 50 des α 4 β 2 δ GABA - A - Rezeptor belief sich auf 0,41 ± 0,12 uM und n betrug 0,76 ± 0,04. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig1.jpg" /> Abbildung 1: Platinschleife. Der Platindrahtschleife in Protokoll Schritt 1.4 erwähnt. Platin ist ein Metall, das ohne Erzeugung Splitter gebogen werden kann, und es klebt nichtBiologisches Material. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig2.jpg" /> Abbildung 2: Eigenbau Mikroinjektions Vorrichtung. Das Gerät ist in Protokoll Schritt 2 a, Grillmotor beschrieben; b, Mikrometerschraube; c, Feder zwischen Spritze und Kolben; d, 10 &amp; mgr; l - Glasspritze; e, dickwandigen Polytetrafluorethylen Schläuche; f, Hand Bohrfutter; g, Injektionspipette; h, Stereo; und i, Motorsteuerung. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Defolliculation eines Oozyten. Oozyten werden zuerst in einer Kollagenase-Lösung in einem Wasserbad bei 36 ° C für 20 min inkubiert. Oocyten werden dann in einer modifizierten Barth-Medium gewaschen. Die endgültige Inkubationsschritt ist in einer hypertonischen EGTA-Lösung bei RT für 4 min. Als Ergebnis werden das Bindegewebe und die Follikelzellen entfernt Weg zum denudierten Oozyten zu geben. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig4.jpg" /> Abbildung 4. Aktuelle Spuren von einer Zwei-Elektroden - Voltage - Clamp - Experiment. EIN, Aktuelle Spuren von einer GABA-Konzentration-Antwort-Kurve in den presrenz von 1 uM THDOC aus einer Eizelle die A - Rezeptor α 4 β 2 δ GABA exprimieren Xenopus erhalten. Die Balken zeigen die Zeitdauer von GABA / 1 uM THDOC Perfusion. Steigende Konzentrationen an GABA wurden an den Oozyten angewendet, und die entsprechenden Stromamplituden wurden bestimmt. GABA-Konzentrationen werden über den Balken angegeben. B, Gemittelt Konzentrations - Wirkungs - Kurven des α 4 β 2 δ GABA - A - Rezeptor. Einzelne Kurven wurden zunächst normiert auf die Einbau maximale Stromamplitude und wurden anschließend gemittelt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD gezeigt, n = 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

20.0K Aufrufe.  University of Bern. Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented. 

Serie: Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Nuclear Transfer in Maus-Oozyten

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

Hefe und luminometrischer<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...