Wir möchten, dass David Watkins für die Unterstützung der Experimente zu danken, die die Optimierung der vorliegenden Methodik ermöglicht. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde teilweise durch einen Piloten Zuschuss zur Verfügung gestellt von der Miami-Zentrum für AIDS-Forschung der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer P30AI073961 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.

Die Pbmc (PBMC) Proben in diesem Manuskript verwendet wurden, aus der indischen Rhesusmakaken am Wisconsin-National Primate Research Center untergebracht erhalten. Diese Tiere wurden betreut in Übereinstimmung mit dem Weatherall Bericht unter einem Protokoll , das von der University of Wisconsin Graduate School Animal Care und Use Committee 33 genehmigt. Alle Tier Verfahren wurden unter Anästhesie und alle Bemühungen durchgeführt wurden gemacht, potentielle Leiden zu minimieren. 1. PKI-Behandlung Hinweis: Dies ist optional, aber für Mamu-B * 017 empfohlen: 01 Tetrameren. Siehe Ergebnisse und Diskussion Abschnitte. <ol><li> Resuspendieren PBMC in R10 - Medium bei einer Konzentration von 1,6 x 10 7 Zellen / ml. </li><li> Je 50 ul dieser Zellsuspension zu dem entsprechenden Durchflusscytometrie Rohre. Werden 50 ul einer 100 nM Lösung von PKI zu jedem Röhrchen. </li><li> Vortex jedes Röhrchen. für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Bis Ende diesesSchritt sollte jedes Röhrchen wurden 100 ul einer Zellsuspension haben die 8,0 x 10 5 PBMC und 50 nM von PKI. </li><li> Fahren Sie mit dem pMHC--I Tetramerfärbung Schritt. </li></ol> 2. Die Färbung mit Fluorochrom-markierten pMHC--I Tetramere <ol><li> Vor der Herstellung des pMHC--I Tetramer Master-Mix, Zentrifuge die pMHC--I Tetramer Röhrchen bei 20.000 g für mindestens 15 min bei 4 ° C. Das Ziel dieses Schrittes ist es Proteinaggregate in dem pMHC-I Tetramer Lösung zu pelletieren, die Hintergrundfärbung erhöhen. Sobald der Zentrifugationsschritt durchgeführt wird, zu vermeiden Pipettieren von dem Boden des Röhrchens, wo die Proteinaggregate angesammelt haben. </li><li> Bereiten Sie genügend pMHC--I Tetramer Master-Mix alle experimentellen Röhren zu färben. Bereiten Sie einen Überschuss von 15% des Gesamtvolumens dieses Mastermixes zu Konto für Fehler Pipettieren. </li><li> Verdünnte pMHC--I Tetrameren in Flecken Puffer (zB Brilliant Stain Buffer) , so dass 25 ul des pMHC--I Tetramer Master - Mix adde sindd jedem Test. <ol><li> Label-PBMC mit zwei pMHC--I Tetrameren pro Test; ein bis Allophycocyanin (APC) und das andere an Brilliant Violet (BV) 421 konjugiert. </li></ol></li><li> Hinzufügen 8,0 x 10 5 PBMC mit dem entsprechenden Durchflusscytometrie Röhrchen in einem Endvolumen von 100 &amp; mgr; l. Wenn die Zellen an der PKI oben beschriebenen Behandlung unterzogen wurden, sollten sie bereits in 100 &amp; mgr; l bei diesem Schritt wieder suspendiert werden. </li><li> In 25 ul pMHC--I Tetramer Master-Mix auf den entsprechenden Durchflusszytometrie Röhren. Bis zum Ende dieses Schritts sollte das Endvolumen in jedem Röhrchen 125 &amp; mgr; l sein. </li><li> Vortexen jedes Rohr, um die Zellsuspension zu homogenisieren. </li><li> Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 45 min. Bereiten Sie die Oberflächenfärbung mAb Cocktail während dieser 45 Minuten Inkubation. </li></ol> 3. Oberflächenfärbung <ol><li> Bereiten Sie genügend mAb Master-Mix alle experimentellen Röhren zu färben. Bereiten eines Überschusses von 15% des Gesamtvolumens dieses Mastermix zu entfallenzum Pipettieren Fehler. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke des Master-Mix mit Flecken Puffer, so dass 50 &amp; mgr; l pro Test hinzugefügt werden. </li><li> Für eine korrekte Ausschluss nicht CD8 + T-Zellen und Abgrenzung der Speicheruntergruppen, Einsatzmengen an gegen die folgenden Moleküle in der Oberflächenfärbung Mastermix gerichtet mAbs titriert. HINWEIS: Die Fluorochrome zu jedem mAbs konjugiert sind als Referenz angegeben: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510 CD8a BV 785, CD28 PE Cy7 und CCR7 FITC. Beachten Sie, dass die mAbs gegen CD14, CD16 und CD20 auf den gleichen Fluorochrom konjugiert sind (dh, BV 510) , da sie in der &quot;dump&quot; Tor aufgenommen werden. </li><li> Fügen Sie einen fixierbaren Farbstoff zur Unterscheidung toten Zellen in der Oberflächenfärbung Mastermix [dh Amin Reaktivfarbstoff (ARD)]. Stellen Sie sicher, dass die ARD-Reagenz an ein Fluorochrom mit einem ähnlichen Emissionsspektrum wie die, die in der &quot;dump&quot; Gate verwendet konjugiert ist. In diesem Fall verwenden Sie ARD Aqua. </li><li> In 50 uldie Färbung Master-Mix in 3,1-3,4 auf den entsprechenden Durchflusszytometrie Röhren beschrieben. Bis zum Ende dieses Schritts sollte das Endvolumen in jedem Röhrchen 175 &amp; mgr; l sein. </li><li> Vortex jedes Röhrchen. Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 25 min. </li><li> Wasche die Zellen mit Waschpuffer (PBS - Lösung , 0,1% Rinderserumalbumin und 0,45 g / l NaN 3 enthält). ACHTUNG: Natriumazid ist eine toxische Substanz. Die Exposition gegenüber selbst geringste Mengen können Symptome verursachen. Gehen Sie mit diesem Stoff nach den vorgegebenen Richtlinien der Environmental Health and Safety (EHS) Büro in der Einrichtung, wo diese Experimente durchgeführt werden. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 510 xg für 5 min. Überstand vorsichtig in einen separaten Abfallbehälter umfüllen. Achten Sie darauf, nicht das Pellet zu stören. ACHTUNG: Nicht Waschpuffer Überstand in Stauseen mit Bleichlauge dekantieren , wie es mit dem Natriumazid in der Waschpuffer und führen zur Bildung eines giftigen Gases 34 reagieren kann. Contact das EHS Amt in der Einrichtung, in der diese Experimente für Richtlinien durchgeführt werden, wie Natriumazid zu entsorgen. </li><li> Nach dem Abgießen, Vortex, um die Zellen in der übriggebliebenen Flüssigkeit in jedem Röhrchen aufbewahrt. </li></ol> 4. Zellfixierung <ol><li> In 250 ul einer 2% Paraformaldehyd (PFA) Lösung für alle Rohre, die die Zellen zu fixieren. ACHTUNG: PFA ist eine giftige Substanz. Die Exposition gegenüber selbst geringste Mengen können Symptome verursachen. Gehen Sie mit diesem Stoff nach den von der EHS Amt festgelegten Richtlinien in der Einrichtung, wo diese Experimente durchgeführt werden. <ol><li> Da die 2% PFA-Lösung zu den Zellen isotonisch sein müssen, verwenden diese PBS-Lösung herzustellen. Einhundert Milliliter einer 2% PFA-Lösung ist für mehrere Experimente genug. Gründlich vortexen alle Rohre unmittelbar nach der Zugabe von 2% PFA, um die Bildung von Zellaggregaten zu verhindern. </li></ol></li><li> im Dunkeln inkubieren 20 min bei 4 ° C. </li><li> WAsche-Zellen durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen. Sobald dieser Schritt abgeschlossen ist, können die Zellen im Dunkeln bei 4 ° C für 24-48 Stunden gelagert werden. Bevor ich auf die Permeabilisierungs Phase verläuft, Strudel, die durch und durch Rohre. </li></ol> 5. Die Permeabilisierung der Zellen <ol><li> In 500 ul Permeabilisierung Puffer. Vortex alle Röhrchen. </li><li> Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Wash-Zellen durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen. </li></ol> 6. intrazelluläre Färbung <ol><li> Bereiten Sie genügend mAb Master-Mix alle experimentellen Röhren zu färben. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke mit PBS oder Flecken Puffer, so dass 50 ul des intrazellulären mAb Master-Mix pro Test hinzugefügt werden. </li><li> Bereiten Sie den mAb Master-Mix in 6.1 und 6.2 unter Verwendung von Mengen von mAb gegen CD3 und GZM B. titriert HINWEIS: TCR Eingriff mit pMHC-I Tetrameren kann in CD3 Internalisierung führen, die mit der Detektion von Tetramer + CD3 + CD8 + störenT-Zellen, wenn die anti-CD3-mAb auf die Oberfläche Anfärbung Mastermix zugesetzt. Um dies zu vermeiden, fügen Sie den Anti-CD3-mAb in diesem Stadium, das heißt, nachdem die Zellen permeabilisiert werden. CD3 PerCP Cy5.5 und GZM B PE: die Fluorochrome zu jedem mAb, konjugiert sind als Referenz aufgeführt. </li><li> In 50 ul mAb Cocktail zu den entsprechenden Rohren. Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Wash-Zellen durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen. Die Rohre sind bereit Zytometer in einem Strömungs erworben werden. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricks+with+tetramers:+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide-MHC.">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC.</a> Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).</li><li>Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+Analysis+of+Leukocyes.">FACS Analysis of Leukocyes.</a> Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).</li><li>Colantonio, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+polymorphisms+modulate+peptide-dependent+binding+to+an+MHC+class+I+ligand+with+a+Bw6+motif.">KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif.</a> PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).</li><li>Schafer, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+a+Natural+Killer+Cell+Response+by+Simian+Immunodeficiency+Virus+Peptides.">Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides.</a> PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ein paar Schritte in diesem Verfahren Verdienst Diskussion, wie sie sind entscheidend für optimale Ergebnisse liefert. Erstens, weil die Qualität der biologischen Proben ein starker Prädiktor für den Erfolg eines Durchflusszytometrie - Assay 38 ist, müssen alle darauf zu achten, dass die Zellen lebensfähig und in Suspension während der Färbung sind. Dies ist besonders relevant, wenn sie mit kryokonservierten Proben arbeiten, da sie anfälliger für Verklumpung und enthalten typischerweise eine höhere...

CD8 + T-Zellen umfassen eine entscheidende Komponente des adaptiven Immunsystems , wie sie in Tumor - Immunüberwachung und tragen zur Eradikation intrazellulärer Pathogene 1 teilnehmen. In einfachen Worten auszudrücken CD8 + T-Zellen T-Zell - Rezeptoren (TCR) , die spezifisch Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC--I) Moleküle auf der Plasmamembran der Wirtszellen erkennen. Da diese Peptide aus der Proteolyse von endogen synthetisierten Proteinen, Zelloberflächen pMHC-I-Komplexe liefern ein Fenster in die intrazelluläre Umgebung abgeleitet werden. Nach der Virusinfektion, zum Beispiel, werden infizierte Zellen zeigen MHC-I - Moleküle Virus abgeleitete Peptide enthält , die als Liganden für TCRs ausgedrückt durch patrouillieren CD8 + T-Zellen dienen kann. Im Falle einer infizierten Zelle präsentiert ein Virus-spezifischen CD8 + T-Zelle ihre pMHC-I - Liganden trifft, wird TCR Eingriff resultieren in CD8 + T-Zell - Aktivierung und ultifähr führen Zell-Lyse zu zielen. In Anbetracht der kritischen Natur dieser TCR / pMHC--I - Wechselwirkungen, die Bestimmung der Größe, Spezifität und Phänotyp reagieren CD8 + T-Zellen können offenbaren oft wichtige Hinweise auf Krankheiten beim Menschen. Bis in die frühen 1990er Jahre, die Quantifizierung von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen auf der technisch anspruchsvollen Grenzverdünnung Assays herangezogen (LDA) 2,3. Nicht nur, dass mehrere Tage die LDA erfordern abgeschlossen werden, ist es auch nicht, Zellen zu erkennen, die proliferative Potential fehlte. Als Ergebnis unterschätzt die LDA in beträchtlichem Ausmaß die tatsächliche Häufigkeit von Antigen (Ag) -spezifische CD8 + T-Zellen in einer Immunantwort beteiligt. Obwohl die Entwicklung von ELISPOT und intrazellulären Zytokin - Färbung Assays die Fähigkeit stark verbesserte zelluläre Immunität zu messen, benötigt diese Methoden noch in - vitro - Stimulation zur Quantifizierung von Ag-spezifischen T-Zellen 4. Erst 1996, dass Altman, Davis, und colleagues ihre Wahrzeichen Artikel veröffentlicht , die Entwicklung der 5 - Technologie pMHC--I Tetramer berichten. Entscheidend für den Erfolg dieser Technik war die Multimerisierung von pMHC-I-Moleküle, die die Halbwertszeit von TCR / pMHC-I-Wechselwirkungen erweitert, wodurch die Wahrscheinlichkeit pMHC-I Tetramere während der Waschschritte von durchflusszytometrischen Assays Abfallen reduzieren. Der Hauptvorteil der pMHC-I - Tetramere in den vorgenannten Tests ist die Fähigkeit, genau Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen direkt ex vivo , ohne die Notwendigkeit für in vitro Restimulation detektieren. Darüber hinaus hat die Kombination von pMHC-I Tetramer - Färbung mit Mehrfarben - Zytometrie detaillierte Analysen der Differenzierungsstufe, Speicher Phänotyps erlaubt fließen und Aktivierungsstatus von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen 2-4. In Anbetracht der jüngsten technischen Fortschritte für die Charakterisierung von CD8 + T-Zell - Repertoires durch pMHC--I - Multimer Färbung 6, die Breite der Anwendungen for diese Methode ist wahrscheinlich, weiter zu wachsen. Nur wenige Gebiete in der biomedizinischen Forschung haben mehr profitierte von pMHC--I Tetramerfärbung als dem Gebiet der HIV Immunologie 7. Obwohl CD8 + T-Zellen zeitlich mit der anfänglichen Kontrolle der HIV - Virämie durch den Zeitpunkt der Veröffentlichung von Altman, Davis und Kollegen 8,9 in Verbindung gebracht worden war, unser Verständnis für die Verwendung von pMHC--I Tetrameren in den folgenden Jahren deutlich ausgebaut die HIV-spezifischen CD8 + T-Zell - Antwort. Zum Beispiel half pMHC-I Tetramerfärbung die robust Größe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zell - Reaktionen in den meisten HIV-infizierten Personen 10-12 bestätigen. Diese Methode erleichtert auch die Charakterisierung von HIV- und SIV-spezifischen CD8 + T-Zell - Antworten beschränkt durch MHC-I - Moleküle mit spontaner Kontrolle der viralen Replikation in Abwesenheit von antiretroviralen Therapie-Phänomen als &quot;Elite - control&quot; bekannt assoziiert <sup&gt; 13-15. Weiterhin wurden pMHC-I Tetramere instrumental bei der Festlegung der programmierten Tod 1 (PD-1) / PD - Ligand 1 (PD-L1) Achse als reversible Weg für die dysfunktionale Phänotyp von HIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in unkontrollierter chronischen Infektion 16,17. Zusammenfassend unterstreichen diese Studien die Nützlichkeit pMHC-I Tetramere zur Überwachung CD8 + T-Zell - Reaktionen gegen das AIDS - Virus. Experimentelle SIV - Infektion von Rhesusaffen (Macaca mulatta) bleibt das beste Tiermodell für 18,19 Immun Interventionen gegen HIV / AIDS zu bewerten. In den letzten 25 Jahren erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in dieser Affenarten, einschließlich der Entdeckung von MHC-I - Allele und die Definition von Peptid - Bindungsmotive hergestellt 13,20-27 . Als Ergebnis wurden für die Analyse von SIV-spezifischen CD8 + T-Zell - pMHC-I Tetramere entwickelteAntworten in diesem Tiermodell 28. Die meisten dieser Reagenzien werden der Genprodukte von vier Rhesusaffe MHC-I - Allele hergestellt: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01 und Mamu-B * 017: 01. Zu beachten ist , Rhesusmakaken exprimieren keine MHC-C - Locus 29. Die überwiegende Mehrheit der pMHC--I-Tetramere in den vorliegenden Experimenten verwendet wurden bei der NIH Tetramer Core Facility an der Emory University produziert. Dennoch können einige dieser Reagenzien, einschließlich Mamu-A1 * 001 Tetrameren die immuno-Gag CM9 Epitop gebunden ist, nur aus kommerziellen Quellen aufgrund von Lizenzverträgen erworben werden. Verwendung pMHC-I Tetramere der vier Rhesusaffe Allele oben aufgeführten haben wir erfolgreich aufgezählt CD8 + T-Zellen gegen insgesamt 21 Epitope SIV (Tabelle 1), die durch Impfung oder primäre SIV - Infektion 30,31 (Martins et induziert wurden al., nicht veröffentlichte Beobachtungen). Die vorliegende Manuskript stellt einoptimiert pMHC-I Tetramer Färbeprotokoll die Frequenz und die Speicher Phänotyp von SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in rhesus macaques zu bestimmen. Der Test beginnt mit einer elektiven 30 min Inkubation mit einem Proteinkinase - Inhibitor (PKI, hier Dasatinib verwendet wird), um TCR - Internalisierung zu verringern und dadurch verbessern pMHC-I Tetramer 32 Anfärbung. Wie unten beschrieben, ist diese Behandlung besonders nützlich, wenn Mamu-B * 017 unter Verwendung von: 01-Tetramere. Die Anleitung, wie die Zellen mit fluorochromkonjugierten pMHC--I Tetrameren und monoklonale Antikörper (mAb) zu beschriften sind ebenfalls vorhanden. Dieses Protokoll umfasst auch eine Zellpermeabilisierung Schritt für die intrazellulären Nachweis des Zytolyse-assoziierten Moleküls Granzym B (GZM B). Der mAb gegen CD3 wird bei diesem Schritt hinzugefügt, und Nachweis dieses TCR Signalmoleküls zu verbessern. Als Referenz, die alle in dieser Färbung Platte eingesetzt Fluorochrome werden aufgelistet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1449">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dasatinib</td>
			<td style="width:236px;">Axon medchem</td>
			<td style="width:127px;">Axon&#160;1392</td>
			<td style="width:757px;">Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI w/ Glutamax</td>
			<td>gibco/ Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td>Must be stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat Inactivated FBS</td>
			<td>gibco/ Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Must be stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745E</td>
			<td>Must be stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers</td>
			<td>NIH Tetramer Core or MBL, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Must be stored and maintained at&#160; 4 &#176;C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorochrome-conjugated mAbs</td>
			<td>Various companies</td>
			<td></td>
			<td>Must be stored and maintained at&#160; 4 &#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD&#160;Fixable Aqua&#160;Dead&#160;Cell Stain Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>l34957</td>
			<td>Must be stored at -20 &#176;C. Resuspend each aliquot in 50 &#956;L of DMSO prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563794</td>
			<td>Must be stored at&#160; 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-158</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumine Bovine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700011-230</td>
			<td>Must be stored at&#160; 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
			<td>Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-620</td>
			<td>Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polysorbate 20 (Tween-20)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L15029</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Permeabilization Solution 2&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340973</td>
			<td>Toxic and corrosive reagent. Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sarsdet Tubes 1.5mL screw top</td>
			<td>VWR</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td>The use of Sterile microtubes is preffered&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biosafety Cabinet&#160;</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milli Q Intergral Water Purification system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ZRXQ010WW</td>
			<td>Molecular Biology grade water from any provider may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 &#176;C&#160; refrigerator</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil</td>
			<td>VWR SCIENTIFIC INC.</td>
			<td>89068-738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to maintain 37 &#176;C&#160; internal temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flowjo software version 9.6</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropippette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of simian immunodeficiency virus-specific cd8+ t-cells in rhesus macaques by peptide-mhc-i tetramer staining

Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC--I) Tetramere haben ein unschätzbares Werkzeug gewesen CD8 + T-Zell - Reaktionen zu untersuchen. Da diese Reagenzien binden direkt an T-Zell - Rezeptoren auf der Oberfläche von CD8 + T-Lymphozyten, Fluorochrom-markiertem pMHC-I Tetramere ermöglichen , die genaue Erfassung von Antigen (Ag) -spezifische CD8 + T-Zellen ohne die Notwendigkeit einer in vitro Re -Stimulation. Wenn darüber hinaus mit Mehrfarben kombiniert Durchflusszytometrie kann pMHC-I Tetramerfärbung Schlüsselaspekte der Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen zeigen, einschließlich Differenzierungsstadium, Gedächtnis Phänotyp und Aktivierungsstatus. Diese Arten von Analysen wurden besonders nützlich auf dem Gebiet der HIV Immunology wo CD8 + T-Zellen , das Fortschreiten zu AIDS beeinflussen können. Experimentelle Infektion von Rhesus-Makaken mit Simian Immunodeficiency Virus (SIV) stellt ein unschätzbares Werkzeug zelluläre Immunität gegen das AIDS-Virus zu untersuchen. Als Ergebnis erhebliche progress wurde bei der Definition und Charakterisierung T-Zell-Antworten in diesem Tiermodell hergestellt. Wir stellen hier ein optimiertes Protokoll für Aufzählen SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in rhesus macaques durch pMHC-I Tetramer-Färbung. Unser Assay erlaubt die gleichzeitige Quantifizierung und Speicher Phänotypisierung von zwei pMHC-I Tetramer + CD8 + T-Zell - Populationen pro Test, der für die Verfolgung von SIV-spezifischen CD8 + T-Zell - Antworten , die durch Impfung oder SIV - Infektion nützlich sein könnten. CD8 + T-Zellantworten in mehreren Krankheitseinstellungen unter Berücksichtigung der Relevanz von nicht - menschlichen Primaten in der biomedizinischen Forschung, ist diese Methode anwendbar für die Untersuchung.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet worden ist, die Größe und die Speicher Phänotyp von Impfstoff-induzierten, CM9 Gag-spezifischen CD8 + T-Zell - Antworten in einem Mamu-A1 * 001 + Rhesusaffe zu bestimmen. Für diese Analyse wird ein APC-konjugiertem Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 Tetramer wurde in einem 8-Farb durchflusszytometrischen Anfärbung Tafel verwendet. 1A - F zeigt die Strategie Gating verwendet , um die Daten zu analysi...

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Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für das Aufzählen und Rhesusaffe CD8 + T - Zellen gegen das AIDS - Virus zu charakterisieren. Dieser Artikel ist nützlich , nicht nur auf dem Gebiet der HIV Immunologie, sondern auch auf anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung , wo CD8 + T - Zell - Reaktionen bekannt sind , Krankheitsverlauf zu beeinflussen.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

analysis-simian-immunodeficiency-virus-specific-cd8-t-cells-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

9.1K Aufrufe.  University of Miami.  Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für das Aufzählen und Rhesusaffe CD8 + T - Zellen gegen das AIDS - Virus zu charakterisieren. Dieser Artikel ist nützlich , nicht nur auf dem Gebiet der HIV Immunologie, sondern auch auf anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung , wo CD8 + T - Zell - Reaktionen bekannt sind , Krankheitsverlauf zu beeinflussen. 

Serie: Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Gleichzeitige Quantifizierung von Anti-Vektor- und Anti-Transgen-spezifische CD8+ T Zellen über MHC Tetramer Färbung nach der Impfung mit viralen Vektoren

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...