Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu beantworten, wie die einzigartigen Eigenschaften der produktiv infizierten Zellen, welche Wirtskofaktoren es Viren ermöglichen, eine produktive Infektion zu etablieren, und wie diese Zellen in therapeutischen Interventionen gezielt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie quantitative Maßnahmen sowohl für Proteine als auch für mRNA in einzelnen Zellen bereitstellt und die meisten Reagenzien im Handel erhältlich sind. Demonstriert wird das Verfahren zur Zellsortierung von Matthew Creegan, einem leitenden Techniker aus dem Flow-Zytometrie-Kern im Labor von Doktor Michael Eller.
Zunächst bereiten Sie in einer bestimmten Prä-PCR-Molekularbiologie-Workstation den Assay-Mix vor, indem Sie 96 Genexpressions-Assays in einer RNase, DNase-Freirohr, kombinieren, die sicherstellen, dass jeder Assay zu einer Endkonzentration von 180 Nanomolaren von Vorwärts- und Rückwärtsprimern hinzugefügt wird. Fügen Sie einen DNA-Suspensionspuffer hinzu, um die entsprechende Verdünnung des Assay-Mixzus zu erreichen. Für jedes erwartete 96 mal 96 Chip-Array pipette sechs Mikroliter pro Assay in einen bestimmten Brunnen einer 96 well PCR Platte, dann versiegeln Sie die Platte mit einem Klebstoff.
Um mit der Oberflächenfärbung lebensfähiger Zellen zu beginnen, bereiten Sie zunächst in einem Biosicherheitsschrank der Gewebekultur zunächst die Kompensationsproben und einen Master-Mix aus fluoreszierendem Antikörpercocktail vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Die kryokonservierten Zellen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad zwei Minuten lang auftauen. Danach zwischen 5 und zwei Milliliter der Zellsuspension zu einer 15-Milliliter-Röhre mit 12 Milliliter PBS hinzufügen.
Zentrifugieren Sie bei 500 G für drei Minuten bei 25 Grad Celsius, dann aspirieren Sie die PBS und setzen Sie das Pellet in drei Milliliter frischen PBS wieder auf. Diese Mischung in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolrohr geben. Zentrifuge wieder bei 500 G für drei Minuten bei 25 Grad Celsius.
Aspirieren Sie den Überstand, so dass etwa 10 Mikroliter Rest PBS. Als nächstes setzen Sie bis zu 20 Millionen gewaschene Zellen in 80 Mikroliter Antikörper-Cocktail aus. 20 Minuten bei 25 Grad Celsius bebrüten, während sie vor Licht geschützt sind.
Fügen Sie danach drei Milliliter PBS hinzu. Zentrifugieren Sie bei 500 G für drei Minuten und aspirieren Sie den Überstand. Die Zellen in 300 bis 500 Mikroliter PBS gründlich wieder aussetzen.
Filtern Sie diese Lösung, indem Sie sie durch eine 35 Mikrometer Nylon-Zell-Siebkappe pipetieren. dann halten Sie die Zellen auf Eis und vor Licht geschützt, bis die Art. Zurück in der Pre-PCR-Workstation, bereiten Sie zuerst den RT-PreAMP-Reaktionsmix in einer einzigen RNase, DNase freie sterile Röhre, wie im Textprotokoll beschrieben.
Mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter dieser Reaktionsmischung in die gewünschte Anzahl von 96 well PCR-Sortierungs-Sammelplatten geben. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und legen Sie die Platte dann auf einen vorgekühlten 96 gut Aluminiumblock. Legen Sie anschließend das Zellensortierungsschema fest, und bereiten Sie den zytometrischen Zellsortierer des Flusses wie im Textprotokoll beschrieben vor.
Geben Sie die entsprechenden Instrumenteneinstellungen ein, um die Anzahl und Teilmenge der Zellen anzugeben, die in jeden Brunnen sortiert werden sollen. Entfernen Sie die Klebedichtung, dann sortieren FACS die Zellen in die vorbereiteten 96 gut PCR-Sammelplatten. Die Platte mit frischer Klebefolie wieder versiegeln.
Sofort wirbeln die neu versiegelte Platte und dann Zentrifuge bei 2000 G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Thermocycle die Platte in einer PCR-Maschine mit einem vorgeheizten Deckel bei 50 Grad Celsius für 15 Minuten gefolgt von 95 Grad Celsius für zwei Minuten. Schließlich Thermozyklus für 18 Zyklen von 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und 60 Grad Celsius für vier Minuten, dann in einem Post-PCR-Arbeitsplatz, übertragen fünf Mikroliter cDNA in 20 Mikroliter DNA Suspension Puffer in einer neuen 96 well PCR Platte.
Zunächst bereiten Sie die qPCR-Assayplatte vor, indem Sie in jedem Brunnen vier Mikroliter Assay-Ladereagenz pipetieren. Als nächstes übertragen Sie vier Mikroliter jedes Assays von der 2X-Assayplatte auf die qPCR-Platte. Halten Sie die qPCR-Assayplatte bei vier Grad Celsius.
Geben Sie die Steuerleitungsflüssigkeiten aus den Grundierspritzen in die beiden Ansaugventile des Chips. Entfernen Sie den Schützenkunststoff unter der Platte. Platzieren Sie den Chip auf einem IFC-Controller mit der Gekerbtenseite an der A1-Position, und wählen Sie dann das Prime-Skript aus und führen Sie es aus.
Mischen Sie für jeden mikrofluidischen Chip 50 Mikroliter des Probenladereagenzes mit 500 MikroliterPCR-Master-Mix, um den Echtzeit-Reaktionsmix vorzubereiten. Pipette 4,4 Mikroliter dieser Reaktion mischen sich in jeden Brunnen einer neuen 96-Well-PCR-Platte, die jetzt als Probenplatte bezeichnet wird. Als nächstes Pipette 3,6 Mikroliter der zuvor verdünnten cDNA in jeden Brunnen der Probenplatte.
Danach fünf Mikroliter von der Assayplatte auf den entsprechenden Brunnen auf der Gekertalerseite des Chips übertragen. Fünf Mikroliter von der Probenplatte in den entsprechenden Brunnen auf der anderen Seite des Chips übertragen. Legen Sie den geladenen Chip in den IFC-Controller ein, und führen Sie das Load-Mix-Skript aus.
Übertragen Sie den Chip anschließend auf die BioMark-Plattform, und richten Sie das Im Textprotokoll beschriebene Instrument ein, und speichern Sie dann die Chiprun-Datei in einem bestimmten Ordner. Wenn der Chiplauf abgeschlossen ist, öffnen Sie die Echtzeit-PCR-Analysesoftware und wählen Sie dann Datei aus, öffnen Sie, um den Chiprun zu öffnen. bml-Datei.
In der oberen linken Ecke des Softwarefensters, finden Chip Explorer und Chip Run Zusammenfassung. Klicken Sie unter Chiprun Summary auf detektor setup. Klicken Sie unter Aufgabe auf Neu, und wählen Sie den Behältertyp SBS-Platte und das Containerformat SBS 96 aus.
Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Auslassung neben der Zuordnung, und wählen Sie dann M96-Assay-SBS96.dsp. Klicken Sie auf Analyseansichten. Wählen Sie auf der Registerkarte qPCR unter Aufgabe die Baseline-Korrektur für die lineare Ableitung und die CT-Schwellenwertmethode für Benutzerdetektoren aus.
Aktivieren Sie auf der Registerkarte CT-Schwellenwerte das Kontrollkästchen Initialisieren mit auto, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Analysieren. Klicken Sie im oberen rechten Quadranten der Analyseansichten auf die zweite Registerkarte, die Ergebnistabelle. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Heatmap-Ansicht aus und die Heatmap mit den Daten wird angezeigt.
Klicken Sie unter der Heatmap auf Schwellenwert und Protokolldiagramm. Passen Sie die CT-Schwellenwerte manuell für jeden Detektor an, indem Sie auf Assays klicken, die durch Spalten auf der Heatmap dargestellt werden, und ziehen Sie den Schwellenwert nach Bedarf, um die Verstärkungskurven in der Exponentialphase zu schneiden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren.
Exportieren Sie als Nächstes die qPCR-Daten als csv-Datei. Übertragen Sie qPCR-Daten vom BioMark-Computer auf Ihren Desktop. Importieren Sie die Daten in eine Kalkulationstabelle oder eine statistische Analysesoftware und ordnen Sie die Ergebnisse nach Stichproben und Assaypositionen auf dem Chip zu.
Erstellen Sie eine neue Spalte, und verwenden Sie eine bedingte Formel, um die Zellen basierend auf der Expression viraler Gene in Gruppen zu organisieren. Wählen Sie unter Analysieren Y nach X aus und zeichnen Sie die Genexpression im Vergleich zur Gruppe. Danach verwenden Sie FlowJo Version 9, um FCS-Dateien aus FACS-Sort zu öffnen, die einer 96-Well-Platte entsprechen.
Wenn der Dateiname hervorgehoben ist, wählen Sie Plattform, Ereignisnummerngate aus, und erstellen Sie indizierte Sortiergates. Einzelne Zellen werden nach Zeile angezeigt. Markieren Sie alle 96 Zellen, und wählen Sie dann Arbeitsbereich, Exportieren, Auswählen aller kompensierten Etagen aus.
Wählen Sie unter Daten die FCS-Datei aus, klicken Sie auf Exportieren, und wählen Sie einen bestimmten Ordner aus. Ziehen Sie die neuen FCS-Dateien für einzelne Zellen in einen neuen FlowJo-Arbeitsbereich. Markieren Sie alle Zellen, und klicken Sie auf Statistiken hinzufügen, die durch die Sigma-Schaltfläche, den Mittelwert und alle Fluoreszenzparameter dargestellt werden.
Öffnen Sie den Tabelleneditor, markieren Sie dann alle Etagen der ersten Zelle, und ziehen Sie sie in das Tabelleneditorfenster. Klicken Sie in diesem Fenster auf Tabelle erstellen und anzeigen. Kopieren und ausgeben Sie anschließend in eine statistische Software, indem Sie entweder kopieren oder auf die Schaltfläche "Anwendung speichern und starten" klicken.
Führen Sie die einzelzelligen FACS-Daten mit den qPCR-Daten in JMP durch die Plattennummer und die Well-Position zusammen. Führen Sie schließlich grafische und statistische Analysen der kombinierten Daten durch. In dieser Studie wird die quantitierte Proteinquantitation mit einzelligem Oberflächenprotein durch Multiparameter-Flow-Zytometrie mit der quantitativen einzelzelligen mRNA-Expression durch hochmultiplexed RTqPCR integriert.
Hier ist die einzellige quantitative virale Genexpression aus FACS sortierten Rhesus-Makaken-CD4-positiven T-Zellen zu sehen. Tat/rev-positives N von negativen Zellen exprimieren weniger Kopien von Tat/Rev-RNA als das N positiver Zellen in dunkelgrün, was mit einem frühen Infektionsstadium vor der Stabilisierung und einem nuklearen Export von teilweise gespleißter viraler RNA übereinstimmt. Eine hohe Fülle an ungepliced Gag-RNA in tat/rev positiveM N positiver Zellen ist konsistent mit einer produktiven Infektion im spätstadium, bei der reichlich genomische RNA exprimiert und in aufkeimende Virionen verpackt wird.
Dieses trivariate Diagramm, das das einzellige virale Gen, das Wirtsgen und die Proteinexpression der Wirtsoberfläche anzeigt, zeigt, dass die Oberflächen-CD4- und CD3-Proteinexpression in tat/rev-positiven Zellen, die in Grün dargestellt werden, verringert wird, obwohl CD4- und CD3-Transkripte erhalten sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Tagen durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine gezielte prototranskriptielle Einzelzellbewertung durchführen können, um Fragen zu differenziell exprimierten Genen und Proteinen in viral infizierten Zellen zu beantworten.
