Die Autoren bedanken sich bei der Präsidentenforschungsfonds von Saint Louis University, um WSN vergeben anerkennen

1. Pflege der Bevölkerung Käfige <ol><li> Pflegen Bevölkerung Käfigen bei 25 ° C auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus. Solange die Kontroll-und Versuchsgruppen sind mit den gleichen Lichtbedingungen ausgesetzt ist, kann diese Technik in einem Standard-Laborbedingungen durchgeführt werden. </li><li> Lassen Weibchen Eier über Nacht auf Apfelsaft-Agar-Platten zu legen. </li><li> Sammeln frisch geschlüpften Larven durch Aufrechterhalten Platten mit neu abgeschiedenen Eier bei 25 º C für 24 Stunden. Setzen Sie einen kleinen Klecks Hefe in der Mitte der Platte zu geschlüpften Larven zu gewinnen. </li><li> Sammeln 1. Larvenstadium, die in der Mitte der Platte Apfelsaft in den Hefe-Paste migriert haben. Verwenden Sie eine Metallspachtel, um es in einem frischen Apfelsaft Platte übertragen. Zusätzliche Hefe Paste kann um sicherzustellen, dass angemessene Ernährung, bis die Tests durchgeführt werden. Traubensaft Platten können auch anstelle von Apfelsaft-Platten verwendet werden. </li><li> Erhalten späten 2. und frühen 3. Larvenstadium larvae indem 1. Larvenstadien bis zum Alter von 40 bis 48 Stunden. Innerhalb dieses Bereichs die Futterraten sind konstant 13. Alter kann durch Untersuchung der Mundhaken bestätigt, da es deutliche Veränderungen in dieser Struktur mit jeder Häutung der Larven werden. </li><li> Späten 2. und frühen 3. Larvenstadium werden für Tests durch vorsichtiges Verhalten und umfassend Waschen Apfelsaft Platten mit Wasser und Sammeln der Larven auf einem Mesh-Filter gesammelt. Die Larven werden dann mit einer Agar-Platte übertragen. </li><li> Alle Analysen sind parallel mit Kontroll-und Versuchstieren durchgeführt. </li></ol> 2. Behavioral Paradigm - Locomotion <ol><li> Legen Sie eine einzelne 3. Larvenstadium auf einem 2% Agar-Substrat in einem 100-mm-Gewebekulturschale und lassen die Larve für 30 sec akklimatisieren. Die Larven nutzen ihre cephalopharyngeal Skleriten (Mundhaken), um ihre Körper über die Oberfläche des Agar-Substrat zu treiben. Dieser wird auf einer separaten Platte getan, weil icht ist schwieriger, die Kontraktionen Körper in der Hefe-Lösung visualisiert das Tier ist fast die gleiche Farbe wie der Hefe. </li><li> Beobachten und Aufzeichnen jedes posterior nach anterior Bewegung über dem Substrat für einen Zeitraum von 1 min. n = 20 für jeden Genotyp. Nicht mehr als 10 Tieren pro Platte sollte untersucht werden. </li></ol> 3. Verhalten Paradigm - Fütterung <ol><li> Mit stumpfen Pinzette Nr. 5 Inox, transferieren es vorsichtig die 3. Larvenstadium von der Bewegungs Agar-Platte in der Mitte von einer Agar-Platte gefüllt mit 5 ml 2% aktiviert Bäckerhefe Lösung überlagert. Stellen Sie sicher, dass die Lösung homogen ist wie die Hefe im Laufe der Zeit zu begleichen. Wenn in der Hefe-Lösung, werden Larven weitgehend vorhanden und Futtermitteln zu bleiben, erleichtert die Beobachtung des Verhaltens. Die Rate der Mund Haken Kontraktionen korreliert direkt mit der Menge der Nahrung aufgenommen 14. </li><li> Ermöglichen Larve für 30 sec akklimatisieren. </li><li> Beobachten und notieren Sie die Anzahl derMund Haken Kontraktionen für einen Zeitraum von 1 min. n = 20 für jeden Genotyp. </li></ol> 4. Larven Gut Dissektionen <ol><li> Machen Sie eine 4% EM-Grade-Formaldehyd-Fixierungslösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und in einen 3-Spot-und Glas. </li><li> Sorgfältig sezieren wandern späten 3. Larvenstadium Larven Mut in einem 3-Loch-Glasschale mit 1x PBS-Lösung, so dass Sie sicher, dass jedes Mal, dass die Drüsen bleibt intakt. Mit einer Pinzette, halten Sie das hintere Ende, und mit der anderen halten die Mundhaken. Halten Sie das hintere Ende unbeweglich, ziehen Sie vorsichtig an den Mund Haken, um Zugriff auf die Eingeweide zu gewinnen. Entfernen Sie alle dazugehörigen Gewebe (Speicheldrüsen, Gehirn, Fettkörper, etc.), dann übertragen Sie einander gut an die 3-Well-Platte, die die Formaldehyd-Lösung. Wander 3. Larvenstadium verwendet werden, da in diesem Stadium der Entwicklung der Larve aufhören Zuführen in Vorbereitung auf Puparium und die Drüsen aus Hefe gelöscht. </li> &lt;li&gt; Mut Inkubation bei 4 ° C über Nacht in einem undurchsichtigen Gewebekultur-Box. </li><li> Vor dem Entfernen Formaldehyd-Fixierungslösung aus Brunnen, entfernen Sie die Magen caeca und Clip den Mitteldarm ~ 150 um 2 aus dem Drüsen so dass Projektionen deutlich ohne Behinderung angesehen werden. </li><li> Entfernen Formaldehyd fix aus den Vertiefungen und ersetzen mit 1x PBT (1x PBS, 0,1% Protease-freien Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100)-Pufferlösung. Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Zeigen Gewebeproben auf einem mechanischen Dreh dabei Wäschen. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 1 h in 10 -6 M 5-HT an Serotonin-Signalisierung erweitern. Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Konzentration von exogenen 5-HT nicht in immunhistochemischen Analysen beeinflussen neuronale Architektur oder Krampfadern Dichte und einfach verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis 15-16. </li><li> Inkubation bei 4 &amp;# 176; C über Nacht in anti-Serotonin primären Antikörper (monoklonale in Maus-oder polyklonalen in Kaninchen auferweckt hat). Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Zeigen Gewebeproben auf einem mechanischen Dreh dabei Wäschen. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 90 min in sekundären Antikörper (Alexa Fluor 568 Ziege-Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-IgG, 1:400 Verdünnung). Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Zeigen Gewebeproben auf einem mechanischen Dreh dabei Wäschen. </li><li> Inkubieren bei 4 mM Natriumcarbonat für 10 min auf einer mechanischen Drehvorrichtung, montieren, in 4% n-Propyl gallate/20 mM Natriumcarbonat und Ansicht unter Fluoreszenz. Natriumcarbonat wird verwendet, um die Probe in den Puffer und pH-Wert im mountant Medien zu konvertieren. </li><li> Machen Sie Bilder von immungefärbten Gewebeproben bei 400-facher Vergrößerung für die Analyse. </li></ol> 5. Analysis of Neural Circuitry <ol><li> Neuriten-Fasern wurden quantifiziert (Anzahl und Größe der Krampfadernund Verzweigungsgrad) mit Neuroleucida und Neuroexplorer. Dies kann jedoch auch manuell durchgeführt werden oder über das Simple Neuriten Tracer (eine kostenlose Anwendung, die online heruntergeladen werden kann). </li><li> Verfolgen Sie die einzelnen Faser Projektionen aus dem Gehirn zu den Drüsen und zu quantifizieren, Krampfadern Nummer, Niederlassungen und die Zahl der großen Krampfadern pro Längeneinheit. Die axonalen Fasern aus dem Gehirn vorstehen, sind in den recurrens Nerven gebündelt und sind nicht für die Analyse zugänglich, bis sie die Drüsen wo sie trennen und fasciculate erreichen. </li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Eine anomale Entwicklung des serotonergen stomatogastrischen Schaltung, die während der späten Embryogenese auftritt, wird seine reife Funktion beeinflussen. Änderungen in der Neuritenwachstum-Architektur innervieren der Darm mit dem Ausgang der Funktionsschaltung, die Fütterung wird Rate (durch den Mund Haken Kontraktionen in einem Hefe-Lösung) (Fig. 1) korreliert werden. Die Verwendung des Gal4-UAS bipartite System in Drosophila macht es möglich, gezielt nach oben oder nach unten reguliert die Expression eines gegebenen Transkripts auf ein spezifisches Gewebe, Änderungen in der Expression eines bestimmten Proteins genau quantifiziert bei entsprechenden Werkzeuge werden. Diese Technik kann verwendet werden, um die Gehirnregionen und sogar neuronalen Teilmengen für die Entwicklung eines spezifischen neuronalen Schaltung notwendig aufzuklären. Die Bewegungs Test wird verwendet, um zu bestätigen, dass die Larven nicht anderweitig physiologisch beeinträchtigt, daher Larven mit 40 Körperwand Kontraktionen oder weniger shoULD aus Analysen (2A) ausgeschlossen werden. Dies kann auftreten, weil entweder der Genotyp führt zu körperlichen Anomalien, oder weil einzelne Tiere während der Behandlung verletzt worden. Darüber hinaus ist die Temperatur des Raumes, in dem der Assay durchgeführt kontrolliert werden muss, da kühlere oder wärmere Temperaturen können die Daten beeinträchtigen. Es wird empfohlen, dieses Verhalten Assay zwischen 24-26 ° C durchzuführen Am Tage, wenn die Temperatur der Testraum kühler ist, hat die Tendenz, Agar härten, daher wird Rückbefeuchtung der Agar-Platte erforderlich ist, nachdem jeder Lokomotive Test abgeschlossen ist, um sicherzustellen, dass der Agar ausreichend weich werden. Es ist wichtig, die Agar-Platte für die Fortbewegung feucht (nicht nass), damit die Larven über die Oberfläche fahren und sie von grab verhindern zu halten. Kühlere Temperaturen auch auf die Leistung der Larven auf dem Agar-Substrat, wie Larven dazu neigen, zur Vorzugstemperaturen (24-26 ° C) 17-18 reisen. No mehr als 10 Tieren pro Platte sollte untersucht werden, und entsorgen Sie jede Platte mit Pannen in der Agar-Substrat. Bei der Durchführung der Fütterungstest, ist es wichtig zu wissen, dass die Hefe-Suspension wird mit der Zeit zu begleichen, Wirbelnde der Hefe auf der Platte sorgt die Hefe bleibt im gesamten Test homogen. Reduzierte Sichtbarkeit der Mundhaken kann auftreten, wenn die Hefe Lösung wird zu konzentriert. Gesunde Larven in der Hefe Medien Vertrag ihre Mundhaken ca. 150-170 mal pro Minute platziert, reduzierte Fütterung kann so niedrig wie 120 sein, und die obere Bereichsgrenze ist 210. Bei der Durchführung der immunhistochemischen Protokoll, ist es ratsam, sowohl die Kontroll-und Versuchsgewebeproben parallel Immunfärbung, eine ähnliche Qualität von Gewebeproben zu gewährleisten. Immunfluoreszenz des Neuriten-Architektur innervating der Darm kann durch Inkubation von Gewebeproben in primärem Antikörper über Nacht bei 4 ° C erhöht werden Die Inkubationszeit of Antikörper bei 4 ° C verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis (Abbildung 5). Die Qualität der Bilder ist sehr wichtig, denn nur so ist für eine genaue Quantifizierung der Faserarchitektur (3) Änderungen in Verzweigungen und Krampfadern Anzahl und Größe (Fig. 4) zeigen. Die Qualität der Gewebeproben kann zerstört werden, wenn der Rotor während des Waschperioden heizt an jedem Punkt von konstanter Verwendung. Während Bildgebung die Gewebeproben sicher nicht zu Proben unter dem Mikroskop Licht zu lange verlassen, da dies die Immunfluoreszenz der Proben nicht nur die derzeit unter Fokus aber umliegenden Proben sowie zu reduzieren. Analyse der Faserarchitektur kann leicht mit Hilfe von Software durchgeführt werden, aber auch manuell erfolgen. Klassifizierung von kleinen und großen Krampfadern beziehen sich auf den Bereich der Krampfadern, Krampfadern Mess mehr als 1 um 2 sind als große Krampfadern eingestuft.

Drosophila ist ein extrem leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung neuronalen Schaltkreis Entwicklung aufgrund der schnellen Generationszeit, geringe Kosten experimentellen, und die Fähigkeit, genetische und Umweltfaktoren zu manipulieren und zu kontrollieren. Neurogenese, neuronale Wegfindung und Synapsenbildung zwischen Mensch und Drosophila konserviert, daher die Mechanismen in die Erstellung, Pflege und Änderung von neuronalen Schaltkreisen als gut erhalten. Klassische Neurotransmitter wie Serotonin (5-Hydroxytryptamin oder 5-HT) als Wachstumsfaktoren vor der Annahme ihrer Rolle als Signalmoleküle in der reifen neuronalen Schaltkreis 1-3 dienen Frühere Studien haben gezeigt, dass die Konzentration von 5-HT während der Embryogenese gestört verändern die Konnektivität von reifen Neuronen 4. Andere haben gezeigt, dass die Anwendung der Eileiter 5-HT zu kultivierten Neuronen unter Helisoma Neuritenwachstum sowie Synaptogenese 5-7. Drosophila, Entwicklungs 5-HT Pegel umgekehrt proportional zur Anzahl und Größe Krampfadern sowie der Grad der aborization, entlang der Länge der Neuriten aus dem ZNS 8 vorsteht, um den Vorderdarm zusammen. Serotonergen Neurotransmission wurde gezeigt, Fressverhalten in verschiedenen Arten modulieren, einschließlich Drosophila 8-9. Die Speiseschaltung in Drosophila ist eine relativ einfache Schaltung, die als Modell verwendet werden kann, um den Funktionsausgang (Fütterung) mit Veränderungen in der Entwicklung der axonale Projektionen aus dem Gehirn zu den Vorderdarm korrelieren. Schoofs et al. haben gezeigt, dass Drosophila Larvenfraß wird durch zentrale Mustergeneratoren, die die Muskulatur beeinflussen 10 geregelt. Während die spezifische Anatomie muskulös ist nicht vollständig verstanden hat es sich gezeigt, dass die Antennennerv, Oberkiefernerv und prothoracic Zubehör Nerven sind für die Muskel Ziele in die beteiligten verantwortlichFressverhalten. Die meisten Daten, die die Muskulatur und Nerven Anatomie der wirbellosen Fütterung auf Calliphora-Larven beschränkt. Die Zufuhrrate des zweiten Larvenstadium kann durch Zurückziehen der cephalopharyngeal Skleriten (Mundhaken) bewertet und ist reproduzierbar und mit hohem Durchsatz. Die cephalopharyngeal Platten werden durch Fasern aus zentralen 5-HT-Neuronen über den frontalen innerviert. Das Drüsen oder Vorderdarm, wird durch serotonerge Fasern (recurrens Nerv), die im Mitteldarm fasciculate und sind verantwortlich für die Kontraktionen des Vorderdarm (Abbildung 1) 11-12 innerviert. Änderungen der axonalen Verzweigung, und die Anzahl und Größe von Krampfadern entlang der Länge der Neuriten, kann mit immunhistochemischen Techniken quantifiziert werden. Manipulieren von neuronalen 5-HT während der Entwicklung, entweder direkt oder indirekt, kann die Funktions Ausgang dieser Speiseschaltung, die beurteilt werden können, und korreliert mit den Veränderungen in der Morphologien änderngy des Neuriten-Architektur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:217px;">Eclipse E-800 Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:217px;">Neuroleucida</td>
			<td style="width:175px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:115px;">NL-15</td>
			<td style="width:251px;">Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:217px;">Northern Eclipse</td>
			<td style="width:175px;">Empix Inc</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:251px;">Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:217px;">G-2E/C TRITC EX 528-553</td>
			<td style="width:175px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:115px;">96312</td>
			<td style="width:251px;">Filter for specific secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:217px;">N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded</td>
			<td style="width:175px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:115px;">MRH00400</td>
			<td style="width:251px;">Objective used for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:217px;">Simple Neurite Tracer</td>
			<td style="width:175px;">NIH Image J</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:251px;"><a href="http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer">http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional analysis of the larval feeding circuit in drosophila

Das serotonerge Speiseschaltung in Drosophila melanogaster-Larven können auf neuronale Substrate von entscheidender Bedeutung bei der Entwicklung der Schaltung untersuchen. Der funktionalen Ausgang der Schaltung, Zuführen, Änderungen in der Architektur des neuronalen stomatogastrischen System visualisiert werden. Fütterungsverhalten kann durch die Beobachtung der Rate von Zurückziehen der Mundhaken, die Innervation vom Gehirn empfangen aufgezeichnet werden. Bewegungsapparat Verhalten wird als physiologischer Kontrolle für die Fütterung verwendet, da Larven nutzen ihre Mundhaken zu durchqueren über eine Agar-Substrat. Veränderungen im Ernährungsverhalten kann mit der axonalen Architektur der Neuriten korreliert werden innervieren den Darm. Immunhistochemisch ist es möglich, diese Veränderungen zu visualisieren und zu quantifizieren. Unsachgemäße Handhabung der Larven während Verhalten Paradigmen Daten zu ändern, da sie sehr empfindlich auf Manipulationen. Die richtige Abbildung der Neuriten Architektur innervierder Darm ist kritisch für eine genaue Quantifizierung der Anzahl und Größe von Krampfadern sowie der Umfang der Verzweigungsknoten. Analyse der meisten Schaltungen erlauben nur zur Visualisierung von Neuriten Architektur oder Verhaltenswirkungen, jedoch erlaubt dieses Modell ein, um das Ausgangssignal der Funktionsschaltung mit den Störungen der neuronalen Architektur korrelieren.

Die serotonergen Speiseschaltung in der Drosophila-Larve kann als äußerst effektives Modell, um den Einfluss der einzelnen Faktoren auf die Entwicklung des Nervensystems beobachten, zu dienen. Durch Quantifizieren Zufuhrrate, ist es möglich, die Axon-Architektur der Speiseschaltung mit funktionellen Ausgang (Fig. 1) zu verbinden. Die Bewegungs Assay als physiologische Steuerung für die Einziehungen der Mundhaken verwendet, da ihre Larven verwenden Mundhaken, um sich über die Oberfläche des Agars zu treiben. Es sollte kein Unterschied in der Bewegungsantworten zwischen Kontroll-und mutierten Genotypen sein, wenn die Mutationen nur auf die Speiseschaltung 8 (Fig. 2A). Wenn signifikante Unterschiede auftreten, ist es möglich, das Verhalten der Larven wurde durch unsachgemäße Handhabung kompromittiert. Wenn die Larven Anschlag während des Tests zu versuchen, durch die Agar-Substrat graben, können sie zu alt sein und werden wahrscheinlich den Übergang zu wandernden Larvenstadien.Es ist auch möglich, die Agar-Substrat zu hart sein, so dass es schwierig für die Larvenmundhaken, die Agar-Substrat zu greifen, was durch die Benetzung der Agar-Oberfläche gerichtet werden. Dieser Test kann verwendet werden, um zu beurteilen, ob Drosophila-Stämmen mit neuronaler anatomische Defekte beeinflussen Entwicklung des serotonergen Speiseschaltung werden. Die Mutante Ellipsoidkörper offen (ebo 3) einen Strukturdefekt in der Ellipsoid Körper des zentralen Komplexes. Der Vergleich mit dem Wildtyp-Elternstamm Canton-S, CS wu, zeigt, dass diese anatomische Defekte während der Entwicklung des Gehirns in Folge depressiv Fütterung während der Fortbewegung ist nicht betroffen (Abbildung 2B). Die anatomischen Defekte in ebo 3 Mutanten scheinen die Entwicklung der Neuriten Architektur des Darms zu ändern. Abbildung 3 zeigt die Veränderungen der Faserarchitektur in der ebo 3 Larven UnternehmenRot mit CS wu; diese Larven zeigen eine Zunahme der Verzweigung sowie eine Erhöhung der Zahl der kleinen und großen Krampfadern entlang der Neuritenlänge. Beachten Sie die Verzweigungsknoten (Pfeile), Krampfadern (Pfeilspitzen) und große Krampfadern (Sternchen). Abbildung 4 stellt die Quantifizierung dieser Bilder. Die richtige Quantifizierung des axonalen Architektur erfordert, dass die Bilder sehr klar sein. Ein Bild für die Analyse geeigneten 5A darstellt. Bilder von schlechterer Qualität wird es schwierig, zwischen der Faser und Krampfadern (5B) zu unterscheiden. Beim Fotografieren der Faserarchitektur zu vermeiden, die Bilder, die die Vorsprünge an der vorderen der Drüsen, da die Fasern eng gebündelt sind und diese voneinander trennt und erscheinen, als ob sie verzweigt sind, umfassen. Mehr hinteren Fasern im Mitteldarm sind mehr verzweigt, weil sie, wenn sie ein fasciculate<html> wieder in in diesem Gewebe. Quantifizierung von Zweig und Krampfadern Anzahl und Größe der Krampfadern, kann manuell oder über ein Programm für den Zweck der Untersuchung der Morphologie von Neuriten, wie Neuroleucida ausgelegt analysiert werden. Solange der Drüsen nicht während der immunhistochemischen Protokoll beschädigt, und das Bild scharf eingestellt ist, werden die Vorbereitungen für Abbildung und Analyse akzeptabel. Wenn der Faserarchitektur deutlich von Hintergrund und wenn einzelne Krampfadern entlang der Neuritenlänge identifiziert werden, für die Analyse geeignet ist die Zubereitung sein. Auch wenn einzelne Krampfadern vom Rest der Faser ermittelt werden kann, ist dies auch ein weiterer Indikator für eine Bildqualität für die Analyse. Alle Fasern sind mit Ausnahme der analysiert, die aus dem Fokusbereich (in einigen Fällen werden die Fasern Kurve zwischen mehreren Fokusebenen). es/ftp_upload/51062/51062fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Die Larvenspeiseschaltung. Verrunden a 3. Larvenstadium, die Gehirn-und Darmgewebe (A). Gut Gewebe vom 3. Larvenstadium seziert wurden mit einem Antikörper gegen Drosophila neuronalen Tryptophan-Hydroxylase immun angehoben (DTRH, B) oder 5-HT ( C). A, B. E, Speiseröhre; Mh, Mundhaken, Pr, proventriculus, Br, Gehirn (beachten Sie die Muster der 5-HT-Neuronen). Arrowhead bezeichnet den Frontalnerven; Pfeil, der recurrens Nerven-C.. proventriculus zeigt axonalen Fasern (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken = 20 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51062/51062fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51062/51062fig2.jpg" width="500px" /> &lt;br /&gt; Abbildung 2. Anatomische Defekte während der Entwicklung des Gehirns Ergebnisse bei depressiven Fressverhalten. Die Tiere wurden für Bewegungs (A) und Fressverhalten (B) untersucht. Locomotion war unberührt. n = 20 für jede Verhaltenstest, 2-3 unabhängigen Experimenten. **** P &lt;0,0001, ungepaarten t-Test. Linien über der Grafik zeigen Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51062/51062fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51062/51062fig3.jpg" width="500px" /> 3. Anatomische Defekte während der Entwicklung des ZNS führt Aberration in Darmfaserarchitektur. Darmgewebe vom 3. Larvenstadium präpariert und mit Anti-5-HT immun. Pfeil bezeichnet Verzweigungsknoten. Arrowhead bezeichnet eine kleine Krampfadern. Asterisk destellt fest, große Krampfadern. Maßstabsbalken = 40 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51062/51062fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51062/51062fig4.jpg" width="500px" /> 4. Anatomische Defekte während der Gehirnentwicklung führen aberrante Darmfaserarchitektur. Analyse Agen Gewebe 3. Larvenstadium präpariert und mit Anti-5-HT inkubiert. Neuriten Verzweigung (A), die Anzahl der Gesamt Krampfadern pro 0,1 mm Neuritenlänge (B) und die Anzahl der großen Krampfadern (&gt; 1 um 2) pro 0,1 mm Länge (C). CS wu, 20 Fasern von 17 Eingeweide von zwei unabhängigen Experimenten; ebo 3, 20 Fasern von 18 Eingeweide aus 3 unabhängigen Experimenten. **** P &lt;0,0001, ** p &lt;0,01, * p &lt;0,05, ungepaarten ttest Linien obigen Grafik zeigen Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51062/51062fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51062/51062fig5.jpg" width="500px" /> 5. Qualität der Bilder ist wichtig für die richtige Quantifizierung der Darmfaserarchitektur. Gut Gewebe von CS wu dritten Larvenstadium seziert und mit Anti-5-HT-immun. (A). Bild Gute Qualität. (B). Bild schlechter Qualität. Maßstabsbalken = 40 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51062/51062fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Die Speiseschaltung in Drosophila melanogaster-Larven serviert ein einfaches aber leistungsstarkes Modell, das Änderungen in der Zuführungsrate, mit Veränderungen in der neuronalen Schaltkreise stomatogastrischen korreliert werden können. Diese Schaltung wird der zentrale serotonerge Neuronen, die Projektionen auf die Mundhaken sowie die Vorderdarm senden zusammen.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

functional-analysis-of-the-larval-feeding-circuit-in-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

10.2K Aufrufe.  Saint Louis University School of Medicine.  Die Speiseschaltung in Drosophila melanogaster-Larven serviert ein einfaches aber leistungsstarkes Modell, das Änderungen in der Zuführungsrate, mit Veränderungen in der neuronalen Schaltkreise stomatogastrischen korreliert werden können. Diese Schaltung wird der zentrale serotonerge Neuronen, die Projektionen auf die Mundhaken sowie die Vorderdarm senden zusammen. 

Serie: Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila

Zusammenfassung

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Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3^Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Visualisierung von Propriozeptoren in

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der

Live-Imaging von

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der

Entfernung von

Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay