This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 "An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine". This work was supported by the 'Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale' project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the 'Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)' project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project "The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions".

<ol>
	<li>Jessome, L. L., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression:+A+major+concern+in+mass+spectrometry.">Ion suppression: A major concern in mass spectrometry.</a> Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).</li><li>Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+plant+metabolomics:+where+do+we+stand,+where+do+we+go?.">NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?.</a> Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).</li><li>Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. 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Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study.</a> Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).</li><li>Jaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+grapevine+genome+sequence+suggests+ancestral+hexaploidization+in+major+angiosperm+phyla.">The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla.</a> Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).</li><li>Velasco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+quality+draft+consensus+sequence+of+the+genome+of+a+heterozygous+grapevine+variety.">A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety.</a> Plos One. 2 (12), (2007).</li><li>Tornielli, G. 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Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+the+grapevine+berry+transcriptome.">The plasticity of the grapevine berry transcriptome.</a> Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).</li><li>Fasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Grapevine+Expression+Atlas+Reveals+a+Deep+Transcriptome+Shift+Driving+the+Entire+Plant+into+a+Maturation+Program.">The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program.</a> Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).</li><li>Gambino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+between+Grapevine+rupestris+stem+pitting-associated+virus+and+Vitis+vinifera+L.+leads+to+decreased+defence+responses+and+increased+transcription+of+genes+related+to+photosynthesis.">Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis.</a> J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).</li><li>Ghan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+omic+technologies+are+concordant+in+differentiating+the+biochemical+characteristics+of+the+berries+of+five+grapevine+(Vitis+vinifera+L.)+cultivars.">Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+defoliation+affects+plant+growth,+fruit+transcriptional+ripening+program+and+flavonoid+metabolism+in+grapevine.">Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine.</a> BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).</li><li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+source/sink+ratio+in+Vitis+vinifera+(cv+Sangiovese)+induces+extensive+transcriptome+reprogramming+and+modifies+berry+ripening.">Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening.</a> BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).</li><li>Rinaldo, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Grapevine+Anthocyanin+Acyltransferase,+Transcriptionally+Regulated+by+VvMYBA,+Can+Produce+Most+Acylated+Anthocyanins+Present+in+Grape+Skins.">A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins.</a> Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).</li><li>Royo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental,+transcriptome,+and+genetic+alterations+associated+with+parthenocarpy+in+the+grapevine+seedless+somatic+variant+Corinto+bianco.">Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco.</a> J Exp Bot. , 259-273 (2015).</li><li>Venturini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+transcriptome+characterization+of+Vitis+vinifera+cv.+Corvina+unveils+varietal+diversity.">De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity.</a> BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).</li><li>Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics:+an+emerging+approach+to+determine+the+composition+of+herbal+products.">Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products.</a> Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+Modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieser Artikel beschreibt die Metabolomik, verwendet Transcriptomics und statistische Analyseprotokolle die Traubenbeere Terroir-Konzept zu interpretieren. Metabolomics Analyse durch HPLC-ESI-MS ist empfindlich genug, um eine große Anzahl von Metaboliten gleichzeitig zu erfassen, aber relativ Quantifizierung wird durch den Matrixeffekt und Ionenunterdrückungs / Erweiterung betroffen. Allerdings hat sich ein ähnlicher Ansatz bereits verwendet worden , um die Reifung und nach der Ernte Welken von Corvina Beeren, und die Korrektur von Matrixeffekten zu beschreiben , hatten eine begrenzte Auswirkungen auf die Ergebnisse 5. Darüber hinaus ist ein kürzliches groß angelegte Multi-Instrument Interlabor - Studie , die die vergleichende Robustheit von NMR und LC-MS für ungezielte Metabolomik mit den gleichen Proben ergab , um festzustellen , dass die verschiedenen Instrumente und Technologien konsistente Ergebnisse 6 ergab. Die Fallstudie hier beschriebenen umfasste die Sammlung und Analyse von Proben, die bei drei Reifestufen von sieben Weinbergen in drei Makro-zdiejenigen über drei Vegetationsperioden. Hierbei wurde das Terroir Unterschrift auf der Makrozone Ebene untersucht (Gardasee und Soave, die jeweils von zwei Weinbergen vertreten, und Valpolicella, vertreten durch drei Weinberge) unter Verwendung von PCA und O2PLS-DA multivariaten Statistik. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Weinbergen sind subtiler und erfordern komplexere und sensible statistische Ansätze 10. Verschiedene Schritte der vorgeschlagenen Protokolle sind kritisch und müssen, um zu berücksichtigen, um erfolgreich auf die biologischen Fragen über Terroir Einflüsse auf die Qualität der Trauben zu beantworten. Zunächst einmal die geeignete Stichprobenplan ist entscheidend: die Wahl eines bestimmten Klon die genetischen Unterschiede und die mehrjährige Dauer der Probenahme zu minimieren ermöglicht, die reale, die Klangunterschiede zwischen den verschiedenen Terroirs zu markieren. Auf der anderen Seite wurde die vorgeschlagene Forschung in einem Terroir durchgeführt, die für den Weinbau besonders geeignet ist, und dies könnte minimieren die Terroir-Unterschiede auf die Qualität der Trauben. Somit wäre es sehr interessant, die gleiche Sorte in einer weniger optimalen Zone gewachsen zu vergleichen, aber natürlich können diese Wein einfach nicht verfügbar. Aus technischer Sicht eine hoch reproduzierbare Metabolit Trennung durch HPLC ist kritisch, gute Datenmatrix zu erhalten, da die höher sind die Unterschiede in der Retentionszeit in den verschiedenen Analysen, desto höher ist die Anzahl der Fehler in der Spitzen Ausrichtung in der letzten Datensatzes. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine angemessene Wieder Equilibrierungszeit zu setzen, um die Proben in Chargen von 9-10 Proben mit Zyklen von chromatographischen Säule Reinigung zwischen ihnen zu teilen und Leerproben als die erste Probe von jeder Charge zu verwenden. LC-MS wird durch einen gewissen Grad an Instabilität beeinträchtigt, was zu Unterschieden zwischen den Proben führen kann, die instrumenten angetrieben werden. Dieses Problem kann teilweise durch die Randomisierung von Probenanalyse gelöst werden, wie in diesem Dokument dargestellt ist. Ein imbesserung des Verfahrens ist die Verwendung von geeigneten Qualitätskontrollproben in jeder Charge, die auf der Plattform Stand informieren können. Eine entsprechende Standardverbindung Mix (dh Standardverbindungen mit m / z - Werte und Retentionszeiten über die gesamte m Spanning / z und Retentionszeitbereich) und eine neue Kontrollprobe durch Mischen von gleichen Teilen Pulver erhalten aus allen Proben können über Plattform informieren Effekte und schließlich auch für die a-posteriori Datennormalisierung verwendet werden. Ein weiterer wichtiger Punkt , um Metabolomik und Transkriptomik Ergebnisse zu vergleichen , war genau das gleiche Material zu verwenden (dh die gleiche crushed Proben) sowohl für die Analysen. In der Datenanalyse ist es kritisch, eine geeignete Statistik Verfahren wie OPLS-DA zu verwenden, die einfache Interpretation der Unterschiede in der Genexpression und Metabolit Akkumulation in Bezug auf Verfahren wie PCA ermöglicht. Eine der Hauptbeschränkungen dieser Art von Ansatz ist dieFehlen starker Methoden für Transcriptomics und Metabolomik Datenintegration. Die Entwicklung geeigneter Verfahren für verschiedene Arten von Datenkorrelation ist notwendig, um eine starke und zuverlässige Korrelation zwischen Transcriptomics und metabolomics Daten aufzubauen. Die Techniken, die in diesem Artikel beschriebenen deutlich gezeigt, die Reifung und Vintage-Effekte auf der Beere Metabolom, aber spezifische chemische Signaturen, die die drei Makro Zonen wurden auch in reifen Beeren unter dem vorherrschenden Vintage-Effekt identifiziert. Interessanterweise ergeben die Analyse von veraison Beeren hat keinen statistisch gültiges Modell, was darauf hinweist , dass das Terroir - Konzept überwiegend von Metaboliten manifestiert , die während der Reifung (zB Anthocyane und Stilbenen) als diejenigen , die bereits in den unreifen Beeren sammeln.

Groß angelegte Datenanalyse auf der Basis der Genome, Transkriptom, Proteom und Metabolomen von Pflanzen bietet noch nie da gewesenen Einblick in das Verhalten von komplexen Systemen, wie zum Beispiel die Terroir Eigenschaften von Wein, die die Wechselwirkungen zwischen Weinrebe Pflanzen und ihrer Umwelt zu reflektieren. Da das Terroir eines Weines verschieden sein kann, selbst wenn identische Weinrebe Klone in verschiedenen Weinbergen angebaut werden, ist Genomik Analyse von geringem Nutzen, da die klonalen Genome identisch sind. Stattdessen ist es notwendig, auf Korrelationen zwischen Genexpression und den metabolischen Eigenschaften der Beeren zu suchen, die die Qualitätsmerkmale des Weines bestimmen. Die Analyse der Genexpression auf der Ebene der Transkriptom profitiert von den ähnlichen chemischen Eigenschaften aller Transkripte, die durch Ausnutzung universellen Eigenschaften wie die Hybridisierung an immobilisierte Sonden auf Mikroarrays quantitative Analyse ermöglicht. Im Gegensatz dazu universellen analytischen Methoden in der Proteomik einnd Metabolomik sind schwieriger wegen der großen physikalischen und chemischen Vielfalt einzelner Proteine ​​und Metaboliten. Im Falle von Metabolomics diese Vielfalt ist noch extremer, weil einzelne Metaboliten stark in Größe, Polarität, die Fülle und die Volatilität unterscheiden, so dass keine einzige Extraktionsverfahren oder Analysemethode bietet einen ganzheitlichen Ansatz. Zu den analytischen Plattformen geeignet für nichtflüchtige Stoffwechselprodukte sind solche auf Basis von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (HPLC-MS) viel empfindlicher als Alternativen wie HPLC mit ultravioletter oder Diodenarray-Detektoren (HPLC-UV, HPLC-DAD ) oder Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie, aber quantitative Analyse durch HPLC-MS kann durch Phänomene wie die Matrixeffekt und Ionenunterdrückungs / Erweiterung 1-3 beeinflußt werden. Die Untersuchung solcher Effekte bei der Analyse von Corvina Traubenbeeren durch HPLC-MS unter Verwendung einer Elektrospray-Ionisations-Quelle (HPLC-ESI-MS) zeigte, dass Zucker und andere Moleküle mit den niedrigsten Retentionszeiten waren stark underreported, wahrscheinlich auch die große Anzahl von Molekülen in dieser Zone reflektiert, und dass die Fülle anderer Moleküle unterschätzt werden könnte, überschätzt bzw. unbeeinflußt von der Matrixeffekt , aber die Datennormalisierung für die Matrix - Effekt schien begrenzte Auswirkungen auf die Gesamtergebnisse 4,5 zu haben. Das hier beschriebene Verfahren ist für die Analyse von mittlerer Polarität Metaboliten optimiert, die während der Reifung, auf einem hohen Niveau in Traubenbeeren anreichern und werden wesentlich durch die terroir beeinflusst. Dazu gehören Anthocyane, Flavonole, Flavans-3-ole, Procyanidine, andere Flavonoide, Resveratrol, Stilbenen, Hydroxyzimtsäuren und Hydroxybenzoesäuren, die zusammen bestimmen die Farbe, Geschmack und gesundheitsbezogenen Eigenschaften von Weinen. Andere Stoffwechselprodukte, wie Zuckern und aliphatischen organischen Säuren, werden ignoriert, da die Quantifizierung durch HPLC-MS unverlässlich ist aufgrund der Matrix effect und Ionensuppression Phänomene 5. Innerhalb der Polaritätsbereich durch diese Methode gewählt, ist der Ansatz ungezielte, dass es zielt darauf ab , so viele verschiedene Stoffwechselprodukte wie möglich 6 zu erkennen. Transcriptomics Methoden , die Tausende von Weinrebe Transkripten erlauben gleichzeitig überwacht werden sollen , durch die Verfügbarkeit des gesamten Weinrebe Genomsequenz 7,8 erleichtert. Frühe Transkriptomik Methoden basieren auf Hochdurchsatz-cDNA-Sequenzierung haben mit dem Aufkommen der nächsten Generation Sequenzierung in eine Sammlung von Prozeduren gemeinsam beschrieben als RNA-Seq-Technologie entwickelt. Dieser Ansatz wird schnell die Methode der Wahl für Transkriptomik Studien. eine große Menge an Literatur jedoch auf Mikroarrays, die durch Hybridisierung in parallel quantifiziert Tausende von Transkripten ermöglicht werden, hat für Weinrebe akkumuliert. Tatsächlich bevor RNA-Seq eine Mainstream-Technologie wurde, hatte viele engagierte kommerziellen Microarray-Plattformen gewesenentwickelt, mit dem Weinrebe Transkriptom zu sehr detailliert untersucht werden. Unter der Vielfalt von Plattformen, nur zwei erlaubt genomweite Transkriptomanalyse 9. Die entwickelte Anordnung erlaubt die Hybridisierung von bis zu 12 unabhängige Stichproben auf einer einzigen Vorrichtung, wodurch die Kosten für jedes Experiment zu verringern. Die 12 Unterfelder umfasst jeweils 135.000 60-mer-Sonden repräsentieren 29.549 Weinrebe Transkripte. Dieses Gerät wurde von 10-24 in einer großen Anzahl von Studien verwendet. Diese beiden Plattformen sind nun eingestellt , sondern eine neue benutzerdefinierte Microarray wurde vor kurzem entwickelt worden und stellt eine neuere Entwicklung , da sie eine noch größere Anzahl von Sonden enthält , die zusätzliche neu entdeckten Gene Weinrebe 25. Die groß Verkauf Datensätze von Transcriptomics und Metabolomics-Analyse erfordern geeignete statistische Verfahren zur Datenanalyse produziert, darunter multivariate Techniken Korrelationen zwischen verschiedenen Form zu bestimmen,s von Daten. Die am häufigsten verwendeten Techniken multivariate sind solche auf Projektion basiert, und diese können zu latent Strukturen Diskriminanzanalyse (O2PLS-DA) unüberwachten wie Hauptkomponentenanalyse (PCA), oder überwacht, wie beispielsweise bidirektionale orthogonale Projektion 26. Das Protokoll in diesem Artikel vorgestellt nutzt PCA für die explorative Datenanalyse und O2PLS-DA Unterschiede zwischen den Gruppen von Proben zu identifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mill Grinder</td>
			<td>IKA</td>
			<td>IKA A11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>System Gold 127 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5x2.1mm; 5&#956;m) Guard Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Alltima HP C18 (150x2.1mm; 3&#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Extraction solvents and HPLC buffers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34966</td>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td>Water&#160; LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares for data collection (a) and processing (b)</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>-</td>
			<td>Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Plant Total RNA kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>STRN250-1KT</td>
			<td>For total RNA extractino from grape pericarps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Nano Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 2</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit RNA Spike In - One-Color</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cRNA Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2514F-048771&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eArray</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td><a href="https://earray.chem.agilent.com/earray/">https://earray.chem.agilent.com/earray/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket slides</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2534-60012</td>
			<td>Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2534-60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Oven</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven Rotator Rack</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2530-60029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Rack Conversion Rod</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2530-60030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining kit</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>10-2000</td>
			<td>Slide-staining dish and Slide rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer device</td>
			<td>AREX Heating Magnetic Stirrer</td>
			<td>F20540163&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus - 6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Microarray Scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2565CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner Carousel, 48-position</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2505-60502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feature extraction software v11.5</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA + V13 Software</td>
			<td>Umetrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics

Terroir bezieht sich auf die Kombination von Umweltfaktoren , die die Eigenschaften von Kulturen wie Weinreben (Vitis vinifera) nach bestimmten Habitaten und Managementpraktiken beeinflussen. Dieser Artikel zeigt, wie bestimmte Terroir Signaturen können in der Beere Metabolom und Transkriptom der Weinrebe Sorte Corvina mit multivariaten statistischen Analyse nachgewiesen werden. Das Verfahren erfordert zunächst eine geeignete Stichprobenplan. In dieser Fallstudie wurde ein spezifischer Klon der Corvina Sorte ausgewählten genetischen Unterschiede zu minimieren und Proben von sieben Weinbergen gesammelt wurden, die drei verschiedene Makro Zonen während der drei verschiedenen Wachstumsphasen. Eine ungezielte LC-MS Metabolomics Ansatz wird durch eine effiziente Datenverarbeitung mit MZmine Software und eine Identifizierung von Metaboliten Strategie auf Fragmentierung Baumanalyse basiert aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, begleitet empfohlen. Umfassende Transkriptom-Analyse kann unter Verwendung von Microarrays erreicht werdenenthaltenden Sonden abdeckt ~ 99% aller Weinrebe Gene vorhergesagt wird, die gleichzeitige Analyse aller differentiell exprimierte Gene im Zusammenhang mit verschiedenen terroirs ermöglicht. Schließlich kann der multivariaten Datenanalyse auf Projektionsverfahren auf Basis verwendet werden, um den starken Jahrgang spezifischen Effekt zu überwinden, so dass die Metabolomik und Transkriptom-Daten zu integrieren und im Detail analysiert werden, um informative Korrelationen zu identifizieren.

Die Fallstudie in diesem Artikel beschrieben ergab eine endgültige Datenmatrix, die 552 Signale (m / z Merkmale) einschließlich Molekülionen sowie deren Isotope, Addukte und einige Fragmente, relativ unter 189 Proben quantifiziert (7 Weinberge x 3 Reifestufen x 3 Vegetationsperioden x 3 biologischen Replikaten). Die Gesamtzahl für Datenpunkte war daher 104.328. Fragmentation Baumanalyse führte zur Annotation von 282 m / z Merkmale, entsprechend Metaboliten sowie Addukte, Isotope und Fragmente. Explorative Analyse der gesamten Datenmatrix durch PCA zeigte , dass die Proben nach der Reifungsstufe geclustert (veraison, mid-Reifung und reifen) entlang der ersten und zweiten Hauptbestandteile (t1-t2, 2A) und nach der Wachstumsperiode entlang die dritte Hauptkomponente (t1-t3, 2B). <img alt="Figur 2"<html> src = &quot;/ files / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2:. PCA der gesamten Metabolomik Datenmatrix Unüberwachte PCA-X Plots Punktzahl streuen das Clustern der Weinrebe Proben gesammelt während drei verschiedenen Vegetationsperioden (2006, 2007 und 2008) und Reifestufen (veraison, Mitte der Reifung und reifen Beeren zeigt ). Im ersten Plot (A) die Proben geclustert nach den Reifungsstadien, während in der zweiten (B) gruppierten sie der Vegetationszeit nach. Die Farben heben die Reifestadien als grün (veraison), Rosa (Mitte Reifung) und lila (reifen Beeren). Die Symbole stellen die Vegetationszeiten: Kreise (2006), Plätzen (2007) und Dreiecke (2008) .Component t1: Q2: 0,34; R2X: 0.331; Q2cum: 0,304; Die Komponente t2: Q2: 0.185; R2X: 0.155; Q2cum: 0,433; Die Komponente t3: Q2: 0.145; R2X: 0,0924; Q2cum: 0.515.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die unüberwachte PCA war nicht in der Lage spezifische Terroir Merkmale zu offenbaren, die unter den vorherrschenden Vintage - Effekte verborgen sind, so ein überwachtes O2PLS-DA Ansatz wurde auf zwei getrennte Datensätze angewandt, das heißt, Beeren an veraison und vollreifen Beeren. Dies ermöglicht die Erforschung der metabolischen Unterschiede, die die drei Makrozonen (Gardasee, Valpolicella und Soave) in zwei wichtigsten Phasen der Reifung spezifische Terroir Unterschriften bei diesen Reifungsstufen darstellen, diese Zonen zu identifizieren. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54410/54410fig3.jpg" /> Abbildung 3: O2PLS-DA von veraison und reifen Trauben Beeren. O2PLS-DA Plots Punktzahl streuen das Clustern der Weinrebe gesammelten Proben im Gardasee zeigt (<html> blau), Soave (grün) und Valpolicella (pink) Makro-Zonen bei veraison (A) und wenn die Beeren reif waren (B). Die Metaboliten verantwortlich für das Clustering in (A) beobachtet und (B) sind in Korrelation Laden Plots (C) und (D) sind. Gruppen von Metaboliten, wie Dreiecke dargestellt, sind blau für Resveratrol und Stilbenen, rosa für Anthocyane, grün für Hydroxyzimtsäure und Hydroxybenzoesäuren, lila für Flavans-3-ole / Procyanidine und Gelb für andere Flavonoide. A: Komponente P1: Q2: 0.278; R2X: 0,0529; Q2cum: 0.278; Komponente P2: Q2: 0,33; R2X: 0,0394; Q2cum: 0.608. B: Komponente P1: Q2: 0.353; R2X: 0,0639; Q2cum: 0,353; Komponente P2: Q2: 0.188; R2X: 0,0374; Q2cum. 0.541 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54410/54410fig4.jpg" /> Abbildung 4: Verteilung der metabolischen Markern unter den drei Makrozonen:. Gardasee, Soave und Valpolicella Metabolit Ebenen spiegeln den Mittelwert ± Standardabweichung (n = 18 für Garda und Soave, 27 für Valpolicella Makro-Zone) von verschiedenen glykosylierten und acylierten Anthocyane, Resveratrol / Stilbenen und Flavonoide in reifen Corvina Beeren in den drei verschiedenen Vegetationsperioden (2006, 2007 und 2008). Unterschiedliche Buchstaben repräsentieren Gruppen , die signifikant verschieden waren , wie durch einen t-Test bestimmt (p &lt;0,05). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die spezifischen Signaturen der sieben Einzellagen wurden unter Verwendung identifiziert eine spezielleized statistischen Ansatz 10. Zwei O2PLS-DA-Modelle wurden gebaut, eine Erkundung der Unterschiede zwischen den Beeren in den drei Makro-Zonen bei veraison gewachsen, und die andere, die Unterschiede in den drei Makro-Zonen unter reifen Beeren zu erkunden. Die Modelle waren kreuzvalidierte eine Permutation Test (200 Permutationen) zeigt, dass das Modell die reifen Beeren in den drei Makro-Zonen beschreiben gültig war, während nur die Gardasee-Proben von den anderen Proben bei veraison verschieden waren (nicht dargestellt). Die Kerbstücke der beiden Modelle, die zeigen , wie die Proben aus den drei Makrozonen veraison und Reife entsprechend getrennt auf die Verteilung der Metaboliten, sind in den 3A und 3B gezeigt. Die Lade Pläne dieses Modell als pq (korr) ausgedrückt, dh die Korrelation zwischen p (die Klasse der Proben) und q (Metaboliten), sind in Abbildung gezeigts 3C und 3D. In den Lade Plots stellen die roten Quadrate, die Klasse der Proben (Makro-Zonen) und die farbige Dreiecke stellen die einzelnen Metaboliten. Der Abstand zwischen den Metaboliten und den Proben spiegelt ihre Beziehungen. Die Metaboliten sind farbcodiert entsprechend ihrer chemischen Klasse. Da Modell die geringe statistische Gültigkeit des veraison wie durch Permutationstest gezeigt, ist es wahrscheinlich von Überanpassung zu leiden. Daher beziehen sich die folgenden Beobachtungen ausschließlich auf die reifen Beeren-Proben, deren Modell war statistisch gültig. In der Lade Grundstück in 3D gezeigt, werden die Stilbenen in Richtung Gardasee Makrozone verschoben, während die Flavonoide in Richtung der Soave und Valpolicella Makro-Zonen verschoben. Ein genauerer Blick auf einzelne Metaboliten zeigt die asymmetrische Verteilung von Anthocyanen, mit Peonidin und seine Derivate häufiger im Lake Garda Makrozone und andere Anthocyane häufiger in der Valpolicella Makro-Zone (Abbildung 4). Einfache Anthocyan-3-O-Glykoside sind häufiger in der Valpolicella Makro-Zone während acyliert und coumarated Derivate sind häufiger in der Soave Makro-Zone. Die Transkriptomik Komponente dieser Fallstudie war ursprünglich eine Transkriptomik Plattform heraus verwenden, die nicht mehr unterstützt wird. Als Folge haben wir ein alternatives Verfahren, mit dem noch verfügbaren Plattform nach oben; die neue Plattform enthält mehrere Sonden als das alte, mehr Pinot noir einschließlich 249 Transkripte vorhergesagt, 4392 neu identifizierte Pinot loci und 179 Gene Corvina Privat 25.

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The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Dieser Artikel beschreibt die Anwendung von ungezielte Metabolomik, Transcriptomics und multivariate statistische Analysen Traubenbeere Transkripte und Metaboliten , um einen Einblick in das Terroir - Konzept zu gewinnen, das heißt, die Auswirkungen der Umwelt auf die Beere Qualitätsmerkmale.

Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

the-terroir-concept-interpreted-through-grape-berry-metabolomics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.3K Aufrufe.  University of Verona.  Dieser Artikel beschreibt die Anwendung von ungezielte Metabolomik, Transcriptomics und multivariate statistische Analysen Traubenbeere Transkripte und Metaboliten , um einen Einblick in das Terroir - Konzept zu gewinnen, das heißt, die Auswirkungen der Umwelt auf die Beere Qualitätsmerkmale. 

Serie: The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Forschung

Genetik

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative transcriptomics. It also serves as a primer for biologists to develop data scientist computational skills, e.g. executing bash commands, visualization and management of large data sets. All command line code and further explanations of each command or step can be found on the wiki (<a href="https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ">https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ</a>). The Discovery Environment and Atmosphere platforms are connected together through the CyVerse Data Store. As such, once the initial raw sequencing data has been uploaded there is no more need to transfer large data files over an Internet connection, minimizing the amount of time needed to conduct analyses. This protocol is designed to analyze only two experimental treatments or conditions. Differential gene expression analysis is conducted through pairwise comparisons, and will not be suitable to test multiple factors. This workflow is also designed to be manual rather than automated. Each step must be executed and investigated by the user, yielding a better understanding of data and analytical outputs, and therefore better results for the user. Once complete, this protocol will yield de novo assembled transcriptome(s) for underserved (non-model) organisms without the need to map to previously assembled reference genomes (which are usually not available in underserved organism). These de novo transcriptomes are further used in pairwise differential gene expression analysis to investigate genes differing between two experimental conditions. Differentially expressed genes are then functionally annotated to understand the genetic response organisms have to experimental conditions. In total, the data derived from this protocol is used to test hypotheses about biological responses of underserved organisms.

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

This protocol outlines a comparative de novo transcriptome assembly and annotation workflow for novice bioinformaticians. The workflow is available for free entirely through CyVerse and connected by the Data Store. Command line and graphical user interfaces are used, but all code needed is available to copy and paste.

Nutzung von CyVerse Resources für<em&gt; De Novo</em&gt; Vergleichende Transkriptomik von unversicherten (Nicht-Modell-) Organismen

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

Transkriptom-Analyse von<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenzierung Daten durch die Tuxedo Suite auf dem Galaxy-Projekt

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...