Name: isolation of giant lampbrush chromosomes from living oocytes of frogs and salamanders
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders at JoVE.com

Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.

<ol>
	<li>Purkinje, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).</li><li>R&#252;ckert, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Entwickelungsgeschichte+des+Ovarialeies+bei+Selachiern.">Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern.</a> Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).</li><li>Callan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).</li><li>Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampbrush+chromosomes.">Lampbrush chromosomes.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).</li><li>Gall, J. G., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+contents+of+isolated+Xenopus+germinal+vesicles.">Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles.</a> Methods. 51, 45-51 (2010).</li><li>Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tips+and+tricks+for+preparing+lampbrush+chromosome+spreads+from+Xenopus+tropicalis+oocytes.">Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes.</a> Methods. 51, 37-44 (2010).</li><li>Morgan, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+oocyte+nuclei:+cytological+preparations+of+active+chromatin+and+nuclear+bodies+from+amphibian+germinal+vesicles.">Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles.</a> Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).</li><li>Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oocyte+nucleus+isolated+in+oil+retains+in+vivo+structure+and+functions.">The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions.</a> Biotechniques. 13, 238-246 (1992).</li><li>Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies,+nucleoli,+and+speckles+in+the+Xenopus+oocyte+nucleus+have+a+low-density,+sponge-like+structure.">Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure.</a> Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).</li><li>Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+images+of+RNA+polymerase+II+transcription+units.">Live images of RNA polymerase II transcription units.</a> Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).</li><li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octagonal+nuclear+pores.">Octagonal nuclear pores.</a> J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).</li><li>L&#246;schberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+visualizes+the+eightfold+symmetry+of+gp210+proteins+around+the+nuclear+pore+complex+and+resolves+the+central+channel+with+nanometer+resolution.">Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution.</a> J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).</li><li>Gottfert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coaligned+dual-channel+STED+nanoscopy+and+molecular+diffusion+analysis+at+20+nm+resolution.">Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution.</a> Biophys J. 105, L01-L03 (2013).</li><li>Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+incorporation+by+isolated+amphibian+oocytes:+III.+Optimum+incubation+conditions.">Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions.</a> J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).</li><li>Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situhybridization+to+DNA.">Fluorescence in situhybridization to DNA.</a> Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).</li><li>Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+RNA.">In situ hybridization to RNA.</a> Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).</li><li>Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+intronic+sequence+RNA+(sisRNA),+a+new+class+of+noncoding+RNA+from+the+oocyte+nucleus+of+Xenopus+tropicalis.">Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis.</a> Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).</li><li>Talhouarne, G. J., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lariat+intronic+RNAs+in+the+cytoplasm+of+Xenopus+tropicalis+oocytes.">Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes.</a> RNA. 20, 1476-1487 (2014).</li><li>Duryee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+nuclei+and+non-mitotic+chromosome+pairs+from+frog+eggs.">Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs.</a> Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die ersten Beobachtungen von &quot;lebenden&quot; LBCS von Hand isoliert GVs von Fröschen und Salamandern wurden durch die amerikanische Biologe William Duryee, 19 vor fast 80 Jahren vor der Einführung der Phasenkontrast und DIC - Mikroskopie vor Fluoreszenzimmunfärbung und vor FISH. Die Vorteile von LBCS für Details von Chromosomenstruktur und Transkription auf der individuellen Gen-Ebene erforderlich Entwicklung von Techniken der Untersuchung der LBCS auf Glasobjektträger zu befestigen, sie in einer naturgetreuen Weise zu fixieren, und molekularen Techniken anzuwenden, ohne ihre Grund Morphologie zu zerstören. Fast jede Technik, um diese Ziele zu erreichen, erfordert eine gewisse Anpassung an die untersuchten Art und einige Kompromiss zwischen naturgetreue Erhaltung und molekulare Charakterisierung. Zum Beispiel GVs und LBCS von tailed Amphibien sind ungewöhnlich leicht zu verarbeiten aufgrund ihrer enormen Größe und der Leichtigkeit, mit der die GV Inhalt in dem geeigneten Medium zu dispergieren. Until vor kurzem wurde jedoch sehr wenig über ihre genomics bekannt, was es schwierig macht, die Fülle von cytologischen Eigenschaften mit molekularen Details zu korrelieren. Umgekehrt LBCS von Xenopus sind ziemlich klein im Vergleich zu denen von tailed Amphibien (Abbildung 5), aber die Genome von sowohl X. tropicalis und X. laevis wurden sequenziert und einigermaßen gut kommentierten sind. Für die erste mit Amphibien GVs, wird die große Herausforderung sein, die GV zu isolieren und die Kernhülle entfernen, ohne die LBCS zu beschädigen. Bis heute hat niemand einen Weg entdeckt, den Umschlag mit Ausnahme von Hand mit Juwelier Zange zu entfernen. Es wäre ein großer technischer Fortschritt, wenn ein Weg gefunden zu &quot;lösen&quot; oder &quot;verdauen&quot;, um den Umschlag aber die Chromosomen und andere Kernorganellen unbeschadet lassen. Eine solche Technik wäre für molekulare Untersuchungen gleichermaßen nützlich sein. Bei unseren Untersuchungen über die nukleare und zytoplasmatische RNA fanden wir es wichtig,Entfernen Sie die Kernhülle vor der Analyse von Kern - RNA (Abbildung 2). 17,18 Wenn der Umschlag nicht entfernt wird, wird die kleine Menge an Kern - RNA überwältigt durch zytoplasmatische RNA verunreinigenden, die auf die Außenseite der Hülle haftet. Eine weitere wichtige Verbesserung würde Entdeckung gewisser Weise sein LBCS befestigen fester an einem Mikroskop-Objektträger. Zentrifugierung der Herstellung kritisch ist, sondern auch längere Zentrifugation (1 h bei 4500 xg) keine Befestigung zu gewährleisten. Man kann in der Regel sagen, wenn LBCS gut befestigt werden, indem sie mit Phasenkontrast bei mittlerer Vergrößerung zu untersuchen. Gut angebracht Chromosomen überhaupt keine Brownsche Bewegung zeigen. Wenn eine Brownsche Bewegung der Schleifen nachweisbar ist, werden nachfolgende Immunfärbung oder FISH-Protokolle zu umfangreichen Schäden oder Materialverlust führen.

Die meisten Wirbeltiere, mit der bemerkenswerten Ausnahme von Beuteltiere und Plazentatiere, produzieren große yolky Eier. Trotz ihrer zum Teil enorme Größe sind diese Eier einzelne Zellen, die ihre endgültige Dimension erreichen, während noch im Ovar der weiblichen. Ovarian Eier werden Eizellen genannt und jedes enthält typischerweise einen einzigen riesigen Kern, seit dem Anfang des 19. Jahrhunderts als Keimbläschen bekannt oder einfach GV. 1 Oozyten der gemeinsamen Labor Frösche, Xenopus laevis und Xenopus tropicalis, einen maximalen Durchmesser von 1,2 mm und 0,8 mm bzw. (Abbildung 1) erreichen. Die GVs von reifen Eizellen dieser beiden Frösche sind 0,3-0,4 mm Durchmesser (2, 3). Molche haben in der Regel noch größere Eizellen und GVs. Völlig reife Eizellen des mexikanischen Axolotl Ambystoma mexicanum, sind mehr als 2 mm im Durchmesser und der GV ist etwa 0,5 mm. Somit sind diese Kerne gut sichtbar für das bloße Auge und kannwerden in vielfältiger Weise manipuliert, die mit den Kernen der typischen somatischen Zellen unmöglich sind. Ebenso bemerkenswert ist die gigantische Größe der Chromosomen innerhalb der GV, was sich bereits am Ende des 19. Jahrhunderts anerkannt. Einzelnen Chromosomen von Ambystoma und andere Molche kann bis zu 1 mm in der Länge (4, 5) liegen. Diejenigen von Xenopus sind beträchtlich kleiner ist , wenn auch mit Längen bis zu 100 &amp; mgr; m oder mehr ist , sie die typischen somatische Chromosomen der meisten Organismen dwarf. Ein wichtiges Merkmal der Eizelle Chromosomen ist ihre außergewöhnliche Transkriptionsaktivität, die auf einer ihrer charakteristischen morphologischen Merkmale führt - Hunderte von paarigen seitlichen Schleifen (Abbildung 5). Jede Schleife besteht aus einem oder wenigen Transkriptionseinheiten, die aktiv RNA synthetisieren. Die Schleifen geben Eizelle Chromosomen einer Fuzzy-Auftritt, der auf den Namen &quot;Lampbrush&quot; Chromosom führte nach ihrer oberflächlichenÄhnlichkeit mit den in früheren Zeiten verwendet Bürsten Petroleumlampe Schornsteine ​​zu reinigen. 2 Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Verwendung von isolierten GVs LBCS und Kernorganellen (Kernkörperchen, Histon-Locus Körper und Sprenkel) zu studieren. Zwei ziemlich unterschiedliche Techniken beschrieben werden. In der ersten, häufiger Technik, GVs werden in einer Salzlösung unter Verwendung von Juwelier Zange isoliert, kurz adhärenten Eigelb zu entfernen, gespült und der Kernhülle entfernt wurde, wieder mit Juwelier Zange. Die gallertartiger Inhalte, die LBCS und Kernorganellen enthält, dürfen sich auf einen Glasobjektträger oder Deckglas zu begleichen. Solche Präparate können direkt durch Phasenkontrast oder DIC-Mikroskopie untersucht werden. Alternativ zentrifugiert werden können Zubereitungen, die die LBCS und Organellen mit dem Schlitten oder Deckglas zu befestigen. Solche Präparate können dann für detaillierte molekulare Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen verarbeitet werden, in erster Linie durch Immunofluoreszenz und fluorescent in situ - Hybridisierung (FISH). 3-7 Eine zweite Technik beinhaltet die Isolierung des GV in Mineralöl. 8 Öl isoliert GVs bleiben transcriptionsaktive für viele Stunden und sind potentiell nützlich für Studien , in denen man will , dass die Kerninhalte möglichst naturgetreu zu sein. 9,10 Da der Brechungsindex des Kern &quot;Saft&quot; zu der der LBCS Nähe und andere Kernorganellen (Abbildung 3) kann mikroskopischer Techniken eine Herausforderung mit öl isoliert GVs sein. Schließlich aufgrund ihrer Größe und Leichtigkeit der Manipulation, GVs sind ideale Material für Studien über die Kernhülle. Die Kernporenkomplex wurde zuerst aus elektronenmikroskopische Untersuchungen an Amphibien GV Umschläge 11 und neueren Hochauflösungs - Beobachtungen haben das gleiche Material verwendet , beschrieben. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>Sometimes referred to as MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (paraffin wax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Grocery Store</td><td></td><td>Commercial Knox gelatin works fine</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Gold Seal cover glass&amp;nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63786-01</td><td>These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy</td></tr><tr><td>Dumont forceps #5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Paraffin oil (light)&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>For isolating GVs in oil</td></tr><tr><td>Adhesive &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; PCR and hybridization chambers (25 &amp;micro;L)</td><td>BioRad</td><td>Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Silicone isolators</td><td>Grace-Biolabs</td><td>select from catalog link</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Coplin jars and staining dishes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>select from catalog link</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

isolation of giant lampbrush chromosomes from living oocytes of frogs and salamanders

Wir beschreiben Methoden für die riesigen transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen studieren (LBCS) in der Eizelle gefunden, oder unlaid Ei, von Fröschen und Salamandern. Einzelne LBCS kann bis zu 1 mm lang sein und sie befinden sich in einem gigantischen Kern, selbst mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Die große Größe der Chromosomen ermöglicht unvergleichliche Beobachtungen von aktiven Genen, die durch Licht optische Mikroskopie, aber zugleich werden spezielle Techniken zur Isolierung des Kerns, das Entfernen der Kernhülle erforderlich, und die Chromosomen auf einem Objektträger verteilen. Die Eizelle Kern auch die Keimbläschen (GV) genannt wird, wird in einem Medium isoliert, die teilweise Gelieren des nuklearen Aktin ermöglicht und bewahrt die empfindliche Struktur der LBCS. Dieser Schritt erfolgt manuell unter einem Binokular Juwelier Pinzette. Als nächstes wird die Kernhülle, wieder manuell mit Juwelier einer Pinzette entfernt. Die Kerninhalte werden schnell auf ein Medium überführt, die dispeRSES das Aktin-Gel und ermöglicht es, die unbeschädigte LBCS auf einen Objektträger zu begleichen. An diesem Punkt die LBCS und andere Kernorganellen kann durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrastmikroskopie betrachtet werden, obwohl feinere Details durch die Brownsche Bewegung verdeckt sind. Für hochauflösende mikroskopische Beobachtung oder molekulare Analyse wird die gesamte Zubereitung die empfindlichen LBCS fest an der Folie zu befestigen zentrifugiert. Eine kurze Fixierung in Paraformaldehyd wird dann durch Immunfluoreszenzfärbung oder in situ - Hybridisierung verfolgt. LBCS sind in einem transkriptionell aktiven Zustand und ihre enorme Größe ermöglicht auf der individuellen Genniveau molekulare Analyse mittels konfokaler oder superauflösende Mikroskopie.

Um zu untersuchen, Riese Lampbrush Chromosomen beginnt man von Eizellen aus einem Frosch oder Salamander zu isolieren. Abbildung 1 zeigt eine Gruppe von reifen Eizellen in einer gepufferten Salzlösung nach der Entnahme aus dem Ovar des Frosches Xenopus. Solche Eizellen bleiben für Tage bei Raumtemperatur in einem guten Zustand. Der Kern (oder Keimbläschen) wird dann von einer Oocyte mit Juwelierpinzette, entweder in einer Salzlösung (Abbildung 2) oder in Öl (3) entfernt wird . Die Kern Inhalt eines öl isoliert Kern kann durch leichtes Quetschen den Kern und durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie beobachtet untersucht werden. Um den Inhalt eines Kerns untersuchen, die in einer Salzlösung isoliert wurde, muss man entfernen Sie zunächst die Kernhülle mit Juwelier Zange und lassen Sie die Inhalte auf einen Objektträger zu begleichen. Die Zubereitung wird dann zentrifugiert t anhängener Chromosomen fest an der Folie, nach dem die Chromosomen mit einem Antikörper (Figur 4) oder unterzogen , um in - situ - Hybridisierung gefärbt werden. Die Lampbrush Chromosomen von Salamandern sind viel größer als die der Frösche (Abbildung 5). In beiden Fällen einzelne Transkriptionseinheiten (Gene) als Schleifen von Chromatin aus dem Chromosom Achse seitlich abstehenden gesehen werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig1.jpg" /> Abbildung 1: Reife Oozyten aus dem Frosch X. tropicalis. Das Ovar eines reifen weiblichen Frosch enthält Tausende von Eizellen in verschiedenen Reifestadien. Die kleinste sind die Größe der somatischen Zellen und haben bereits Prophase der ersten meiotischen Teilung erreicht. Da die Eizelle wächst, reichert es sich allmählich Eigelbs, der die Zelle ein opakes weißes Aussehen verleiht. Die größte Matteeine dunklere Kappe aufgrund der Ansammlung von Melaninpigment ure Oozyten, hier gezeigt, zu erwerben. Die größten Oozyten von X. tropicalis sind etwa 0,8 mm im Durchmesser, laevis diejenigen von X etwa 1,4 mm, während die der Axolotl sind eine enorme 2,2 mm. Mit Ausnahme der Größe, sind alle drei ähnlich im allgemeinen Aussehen. Maßstabsbalken = 1 mm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Entfernung der GV von einer Oozyten von X. tropicalis. Links. Ein kleines Loch wurde mit Juwelier Zange in den dunkleren Tier Pol einer Eizelle gemacht und die GV wurde sanft extrudiert. In diesem Beispiel war der GV von Eigelb fast frei, wie es aus der Eizelle kam. Adhärenten yolk kann durch Ansaugen des GV in eine und aus einer Pipette mit einem Spitzendurchmesser nur geringfügig größer als der Durchmesser des GV selbst entfernt werden. Recht. Trei GVs von X. tropicalis. Diese GVs wurden ein paar Minuten in einem leicht sauren Medium (GV Isolationslösung auf pH 5,8) nach links, die die Kernhülle verursacht von den gelierten Kern Inhalte zu quellen entfernt. GVs auf diese Weise behandelt werden nicht für die zytologische Untersuchung verbreiten. Allerdings sind solche GVs ideal für die molekulare Analyse: Die Hülle kann mit Juwelieren einer Pinzette entfernt werden, um eine Probe der Kern Inhalt vollständig frei von zytoplasmatischen Kontamination bereitstellt. 17,18 Maßstabsbalken = 0,5 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig3.jpg" /> Abbildung 3: GV von X. tropicalis in Öl isoliert. Links. Nach einem kleinen Einstich wurde in der Eizelle in der Nähe der dunklen Tier po gemachtle, begann die GV zu extrudieren. In diesem Fall kam der GV fast ohne anhaftende Dotter aus. Mitte. Die GV ist jetzt völlig frei von der Eizelle Zytoplasma. Solche GVs weiterhin RNA stundenlang zu transkribieren. Recht. Nach der GV sanft in Öl unter einem Deck zerquetscht wird, kann Kernorganellen von DIC betrachtet werden, wie hier dargestellt, oder durch Phasenkontrast. Die gesamte GV ist viel größer als die kleine Fläche hier gezeigt. HLB = Histon locus Körper mit drei Sprenkel auf seiner Oberfläche. Maßstabsbalken = 0,5 mm für ersten beiden Platten, 10 &amp; mgr; m für die dritte. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig4.jpg" /> Abbildung 4: Lampbrush Chromosome (LBCS) aus dem Axolotl A. Mexicanum. Links. </stRong&gt; 14 Die paarigen Chromosomen aus einer einzigen GV in der Prophase der ersten meiotischen Teilung, mit einem Antikörper gegen phosphoryliertes RNA-Polymerase II immunogefärbt. Die winzigen gefärbten &quot;Punkte&quot; sind Histon-Locus Körper. Recht. Die gleiche Zubereitung von Dunkelfeldbeleuchtung betrachtet. Man kann nun die zahlreichen ungefärbten verstärkt Kernkörperchen zu sehen. Maßstabsbalken = 250 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig5.jpg" /> Abbildung 5: A Single LBC vom Axolotl A. Mexicanum und den Frosch X. tropicalis, bei gleicher Vergrößerung. Diese Bilder zeigen die extreme Größenunterschied zwischen LBCS eines Salamander und ein Frosch (kleines Bild). Die Größe difference korreliert mit der Gesamt - DNA - Gehalt des Genoms (etwa 30 GBP für A. mexicanum vs 1,7 Gbp für X. tropicalis). Einzelne Seitenschleifen (Transkriptionseinheiten) sind auch viel länger in der Salamander als im Frosch. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54103/54103fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders at JoVE.com

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Wir präsentieren einfache Techniken für aus lebenden Eizellen von Fröschen und Salamandern Riese transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen zu isolieren. Wir beschreiben , wie diese Chromosomen &quot;lebendig&quot; durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast zu beobachten, und wie man sie in - situ - Hybridisierung oder Immunfluoreszenzanfärbung für fluoreszierende zu beheben.

Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

isolation-giant-lampbrush-chromosomes-from-living-oocytes-frogs

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K Aufrufe.  Carnegie Institution for Science.  Wir präsentieren einfache Techniken für aus lebenden Eizellen von Fröschen und Salamandern Riese transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen zu isolieren. Wir beschreiben , wie diese Chromosomen "lebendig" durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast zu beobachten, und wie man sie in - situ - Hybridisierung oder Immunfluoreszenzanfärbung für fluoreszierende zu beheben. 

Serie: Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Biochemie

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerv-Muskel-Co-Kulturen

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Neurowissenschaften

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Biologie

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Manipulation und

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis

Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Produktion von

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose