We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. C2C12 Zellkultur <ol><li> Pflegen C2C12-Maus-Myoblasten in einer 100 mm-Platte in Wachstumsmedium (Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. Lassen Sie C2C12 agierten Zellen etwa 50 werden - 60% konfluent. </li><li> Verwerfen das Wachstumsmedium und wasche C2C12 Zellen mit 3 ml Raumtemperatur phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und fügen 500 ul 0,25% Trypsin-EDTA die Zellen zu lösen. Die Platte wird in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator 3 - 5 min. </li><li> Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 3 ml Wachstumsmedium. Pipette 6 - 8 mal um die Zellen zu suspendieren. 1 ml suspendierter Zellen zu einer neuen 100 - mm - Platte und inkubiere bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. C2C12 Zelltransfektion / Transduktion und Selektion <ol><li> C2C12 Plasmidtransfektion <ol><li> 24 Stunden vor der Transfektion, pspäten 7,0 x 10 5 C2C12 Zellen in eine Vertiefung einer Sechs-Well - Platte für jede Transfektion. Anmerkung: Dies führt zu einer 50 bis 60% Konfluenz durch den Zeitpunkt der Transfektion. </li><li> Lassen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu kommen. </li><li> In 2 ug Plasmid-DNA (GFP-CUG5 oder GFP-CUG200) in 200 &amp; mgr; l vorgewärmten serumfreien Medium und Wirbel kurz. In 6 ul Transfektionsreagenz auf das Medium und mischen sofort für 30 Sekunden einen Wirbel verwenden. Inkubieren der Mischung für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Ändern Sie die Medien von C2C12-Zellen zu 2,5 ml Serum-freien Wachstumsmedium. Fügen Sie das Transfektionsgemisch zu den Zellen nach der Inkubation. Rück die Platten zu einer 5% CO 2, 37 ° C Inkubator. </li><li> Halten Sie die Zellen in Transfektionsgemischs / Serum-freien Wachstumsmedium für 4 Stunden oder bis über Nacht. Ändern Medien zurück zu den Wachstumsmedien am nächsten Tag oder wenn Zytotoxizität ist offensichtlich. Hinweis: Die Zytotoxizität wird beurteilt durch mikroskopische Untersuchung des cells. Beachten Sie die Veränderungen der Zellmorphologie und Zellablösung. Solange es keine offene Zytotoxizität ist, Inkubation über Nacht in serumfreiem Wachstumsmedium erhöht die Transfektionseffizienz. </li><li> Markieren Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion durch Zugabe von 1,2 bis 1,6 mg / ml G418 für ~ 10 Tage, bis die Kontrollkultur (ohne die Plasmide transfiziert) keine lebenden Zellen haben. Ändern Sie die Medien alle zwei Tage mit Wachstumsmedien mit G418 ergänzt. </li><li> Pflegen die G418 - resistenten Zellen in Wachstumsmedium und 5% CO 2 bei 37 ° C für nachfolgende Experimente. </li></ol></li><li> Retrovirus Vorbereitung und C2C12 retrovirale Transduktion <ol><li> Bereiten HEK 293 Kulturmedium durch DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. <ol><li> Etwa 24 Stunden nach der Transfektion vor, Platte 4,0 x 10 6 ekotropischen HEK 293-basierte Verpackungszellen in einer 100 - mm - Platte (80% Zusammenfluß bei Transfektion) containing Zellkulturmedium. </li></ol></li><li> Lassen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu kommen. </li><li> Mischen Sie 15 ug Plasmid-DNA (pMSCV-Puro oder pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml Serum-freien Wachstumsmedium. Vortex kurz. In 30 ul Transfektionsreagenz aus Schritt 2.2.2 in die DNA / Serum-freien Wachstumsmedium Rohr und gut mischen Wirbel verwenden. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> In Transfektionsgemisch tropfenweise zu den ekotropischen HEK 293-basierte Verpackungszellen. Vorsichtig die Platten wirbeln und sie zurück in die 5% CO 2, 37 ° C Inkubator zurück. Nach 24 Stunden ändern, um die Medien zu 10 ml frischem Wachstumsmedium vorgewärmten. </li><li> Ernten Sie den Überstand (mit Retrovirus) 48 Stunden nach der Transfektion mit einer Pipette und den Überstand in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit. 10 ml neue warme Medien auf die Platte und wieder in den Inkubator. Halten der Überstand bei 4 ° C. Hinweis: Das Medium wird hinzugefügt sanft bis ter Seite des Bohrloches, um nicht die Zellschicht zu stören. </li><li> Ernten Sie die zweite Charge von Überstand 60 Stunden nach der Transfektion und bündeln es mit dem Überstand von 2.2.5. Zentrifuge bei 500 × g, 4 ° C für 7 min Zelldebris zu entfernen. </li><li> Den Überstand in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. Verwenden Retro C2C12-Zellen an diesem Punkt zu transduzieren durch Vorgehen 2.2.9 oder aliquoten zu Schritt und speichern Sie den Überstand bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung. </li><li> Auftauen Retrovirus aus 2.2.7 bei Raumtemperatur, wenn ein gefrorener Lager hier verwendet wird. Hinweis: Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen. </li><li> Platte C2C12-Zellen am Tag der Transduktion 30 Ziel - 40% Konfluenz. <ol><li> Entsorgen Sie das Wachstumsmedium und waschen C2C12-Zellen mit 3 ml Raumtemperatur PBS. Entfernen Sie die PBS, 500 &amp; mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation der Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator 3 - 5 min. </li><li> Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 3 ml Wachstums medium. Pipette 6 - 8 mal um die Zellen zu suspendieren. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und fügen 8,0 x 10 5 C2C12 - Zellen auf eine 60 - mm - Platte. </li></ol></li><li> 0,5 ml Retrovirus ein 60-mm-Platte von Zellen in 3 ml Wachstumsmedium zu infizieren. Bringen Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Ersetzen durch 3 ml frisches Medium mit Selektionsantibiotikum ergänzt (Puromycin 1-3 ug / ml) 48 Stunden nach der Infektion. Ersetzen 3 ml Medium mit Antibiotikum jeden Tag für ~ 5 Tage, bis die untransduzierten C2C12 Kontrollkultur stirbt aus. </li></ol></li><li> Lentiviren Vorbereitung und C2C12 lentivirale Transduktion Hinweis: Führen Sie alle Lentiviren bezogene Verfahren in Biosafety Level 2 Schrank und biologische Sicherheitsrichtlinien befolgen. Flüssige Abfälle, das Virus enthalten, müssen vor der Entsorgung desinfiziert werden. <ol><li> Platte 4.0 x 10 6 293T - Zellen in einer 100 mm Platte (~ 80% Konfluenz am Tag der Transfektion) mit HEK 293 - Zellkulturmedium (DMEM high Glucose, ergänzt mit 10% fötalemRinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) 24 h vor der Transfektion. </li><li> Wärmen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur. Mischen Sie die lentivirale Verpackungsvektoren (4 ug pMD2.G und 6 ug psPAX2) zusammen mit 8 ug lentiviralen Transfervektor (Celf1 shRNA oder verschlüsselt Kontrolle shRNA) in 1 ml Serum-freiem Zellkulturmedium. Vortex kurz. </li><li> In 36 ul vorgewärmte Transfektionsreagenz an die DNA / DMEM Rohr und gut mischen durch Wirbel. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die 293T-Zellen aus dem Inkubator und zu der Platte die Transfektionsgemischs. Die Platte vorsichtig wirbeln und es Inkubator zurück zu 5% zurückkehren CO 2, 37 ° C. Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Transfektionsgemisch mit 10 ml frischem Kulturmedium. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit enthält Lentiviren 48 Stunden nach der Transfektion und gibt sie in eine 50 ml Zentrifugenröhrchen. 10 ml neue warme Medien auf die Platte und senden Sie esInkubator. Lagern Sie den Überstand bei 4 ° C. </li><li> Sammeln Sie die zweite Charge von Überstand 60 Stunden nach der Transfektion und kombinieren es mit dem Überstand von 2.3.5. Zentrifuge kurz bei 500 · g, 4 ° C für 7 min. </li><li> Den Überstand in ein frisches 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wenn frische Virus verwenden, fahren 2.3.9 zu treten. Für eine zukünftige Verwendung, Speicherung virushaltigen Überstand bei -20 ° C in Aliquots von 10 ml. </li><li> Auftauen das Virus aus 2.3.7 bei Raumtemperatur vor der Verwendung, wenn ein gefrorener Vorrat verwendet wird. Hinweis: Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen. </li><li> Platte C2C12-CUG200 Zellen (erhalten in Abschnitt 2.1), wie in 2.2.9 am gleichen Tag der Transduktion beschrieben. Hinweis: Ziel für 30 - 40% der Einmündung. </li><li> 0,5 ml Virus eine 60-mm-Platte von C2C12-CUG200 zu infizieren und die Platte in den Inkubator zurück. </li><li> Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium mit der Auswahl Antibiotikum ergänzt (Puromycin 1-3 ug / ml) 72 Stunden nach der Transduktion.Aktualisieren Kulturmedien jeden Tag mit dem Selektionsantibiotikum für ~ 5 Tage, bis alle untransduzierten C2C12-CUG200 Kontrollkultur stirbt aus. </li><li> Verwenden Western-Blot-Celf1 Knockdown in GFP-CUG200 transfizierten Zellen zu überprüfen. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 Zelldifferenzierung <ol><li> Platte 2 x 10 6 Zellen in einer Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in 2,5 ml Wachstumsmedium 24 h vor der Initiierung der Differenzierung. Hinweis: Die Beschichtungsdichte eingestellt werden kann, so dass eine vollständige Konfluenz in 24 h erreicht ist. <ol><li> Spülen konfluenten Zellen mit PBS und fügen Sie 2,5 ml serumarmen Differenzierungsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 2% Pferdeserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1 uM Insulin) . Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage. Hinweis: Bewahren Sie Lager Insulin gefroren und fügen Sie es bei jedem Mediumwechsel zu den Medien. </li></ol></li><li> Während C2C12 Differenzierung, sammeln Proben für Quantitative RT-PCR in den folgenden Zeitpunkten (siehe Abschnitt 4): Tag0, 1, 2, 4 und 6. Verfahren die Kultur für Tag bei immunostaining 6 - 8 (siehe Abschnitt 5). </li></ol> 4. RNA Isolation und Quantitative RT-PCR <ol><li> Verwenden des Protokolls des Herstellers für die RNA-Isolierung. Nach der Isolierung resuspendieren RNA-Pellet in 30 ul RNase-freies Wasser und pipettieren nach oben und unten mehrmals. Hinweis: Die Proben Quantitative RT-PCR erfolgen kann oder kann bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Verwenden Sie einen RT - qPCR - Kit für die quantitative RT-PCR 10 und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie die Reaktionsmischung gemäß Tabelle 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen (ul) </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 2x Reaktionspuffer </td><td> 10 </td><td> 1x </td&gt; </tr><tr><td> Vorwärtsprimer </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Reverse-Primer </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Reverse Transkriptase und RNase Inhibitor </td><td> 0,1 </td><td> 0,25 U / ml </td></tr><tr><td> Vorlage </td><td> 1 </td><td> 100 ng Gesamt-RNA </td></tr><tr><td> RNase freies Wasser </td><td> 7.4 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> insgesamt Mix </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 : Quantitative RT-PCR Master Mix Herstellungs <ol start="3"><li> Führen Sie einen 20 &amp; mgr; l RT-qPCR - Reaktion unter Verwendung thermischen Profils Tabelle 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reverse Transkriptionsschritt </td><td> 30 min, 48 ° C </td></tr><tr><td> DNA-Polymerase Aktivierung / Reverse-Transkriptase-Inaktivierung </td><td> 10 min, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 Zyklen </td><td> 15 sec, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 min, 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Quantitative RT-PCR - Thermoprofil 5. Immunostaining <ol><li> Befestigen Sie die Monolayer-Kultur in 2,5 ml frisch 4% Paraformaldehyd / PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten vorbereitet. </li><li> Permeabilisieren die Proben in 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf einer feuchten Kammer. Blockieren die Proben in 2,5 ml Blockierungspuffer (0,1% nichtionisches Tensid / PBS, 10% normales Ziegenserum) für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Verwerfen Blockierungspuffer und anzuwenden 800 ul primärem Antikörper gegen Myosin schwere Kette in Blockierungspuffer verdünnt (1: 100). Inkubieren in einer befeuchteten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Platte 3 times (jeweils 10 Minuten) mit 2,5 ml Waschpuffer (0,1% Polysorbat 20 / PBS) am 2. Tag. </li><li> Entfernen der Waschpuffer und 800 ul gelten Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-IgG, 1: 500 in PBS verdünnt). Inkubieren in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Waschen zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 2,5 ml Waschpuffer. </li><li> Inkubieren mit 800 &amp; mgr; l DAPI (1 ug / ml, in destilliertem deionisiertem H 2 O verdünnt) für 5 min. </li><li> Waschen mit 2,5 ml Waschpuffer wieder für 10 min. </li><li> Ändern Sie den Waschpuffer auf 2,5 ml PBS und mit einem Fluoreszenz-Mikroskop Bilder zu erfassen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

C2C12 - Zelllinie wurde als Modell verwendet worden myogenesis 11-14 zu studieren. Diese Zellen behalten einen Fibroblasten-ähnliche Aussehen, proliferieren schnell in den Medien 20% fötales Rinderserum enthält , und unterscheiden sich leicht in Medien mit 2% Pferdeserum 15. Das schnelle Wachstum und die Differenzierung sind vorteilhafte Eigenschaften in einem myogenesis Zellmodell. Hier zeigen wir die Verwendung des Plasmids, retroviralen und lentiviralen Vektoren einzuführen cDNA, 3&#39;-UTR und shRNA in C2C12-Zellen. Die kritischen Punkte für die Transfektion / Transduktion und Wartung der Konsistenz bei der Differenzierung sind unten hervorgehoben. Die Zelldichte in der täglichen Zell Wartung entscheidend. Diese Zellen müssen unter 50 kultiviert werden - 70% Konfluenz. Aufgrund der kurzen Verdopplungszeit unterscheidet hohe Einmündung (&gt; 70%) C2C12 Kultur spontan, wenn über Nacht stehen gelassen. Während der Anteil des spontan differenzierten Zellen klein sein kann, die Anwesenheitvon differenzierten Zellen werden zu Inkonsistenzen in den nachfolgenden Differenzierungsexperimente beitragen. Zusätzlich frisch C2C12 Zellen aufgetaut, die niedrige Passage-Nummer haben, werden bevorzugt. Zur Unterscheidung werden die Zellen in vorher festgelegten Zahlen überzogen, so dass sie voll Einmündung nach 24 Stunden erreichen. Insulin wird in kleinen Portionen eingefroren gehalten und wird jedes Mal, wenn der Differenzierungsmedium zugegeben wird, verändert. Diese Maßnahmen verbessern die Differenzierung Ergebnisse. Serum freies Medium verbessert C2C12 Transfektion von Zellen. Die Zellen können über Nacht in Transfektionsgemischs / Serum-freien Medien inkubiert werden. In unserem Labor erreichen wir bis zu 20% Transfektionsrate auf, durch leichte Anzeichen von Zytotoxizität begleitet. Die Konzentration des Arzneimittels verwendet C2C12 Zelle auszuwählen höher ist, 1,2 bis 1,6 mg / ml G418 oder 1 bis 3 &amp; mgr; g / ml Puromycin, und die Dauer der Auswahl ist länger als die meisten anderen Zelllinien. Aufgrund der potentiellen Toxizität bei hohen Wirkstoffkonzentration und dem verlängerten Inkubationsperiode lot-to-lotVariation in Differenzierungspotential entstehen können. Es ist entscheidend, um die Auswahlschema (Konzentration und Dauer), basierend auf Zelle Erscheinungsbild anzupassen und die Test- und Kontrollgruppen zusammen zu behandeln. Wir haben erfolgreich GFP-CUG200 in C2C12-Zellen eingeführt, die 3&#39;-UTR CUG Expansion in DM1 reproduzieren. Einführen Celf1 in C2C12-Zellen und Celf1 shRNA in GFP-CUG200 C2C12 Zellen hat die Bewertung der zellulären und molekularen Ereignisse, ausgelöst durch Celf1 upregulation und Exploration von Targeting Celf1 DM1 Myoblasten zu helfen Differenzierung erlaubt, respectively. Zusammenfassend stellte der C2C12 Myoblasten Modell hier profitiert die Untersuchung von Muskeldystrophie sowie allgemeine Muskel Zellbiologie und Muskeldifferenzierung. Die Begrenzung dieses Modells ist, dass die Ergebnisse in Zelllinien können nicht vollständig auf Organismen verlängern. Die Ergebnisse in den aktuellen Modellen sind fortgeschritten oft an die frische Myoblasten von Tieren zu isolieren und das Studium ihrer differentiation. Letztlich untermauern wir Myoblasten Erkenntnisse in Organismen. Die einzigartige Stärke dieser Studie ist die Multi-Tier-Genmanipulation in C2C12 Myoblasten, die die aufeinanderfolgenden genetischen / pathologischen Ereignisse in DM1 ermöglicht die Modellierung. Bisher wurde die RNA Toxizitätswirkung DMPK CUG Expansion in Myoblasten dokumentiert 11-14, während die pathologische Rollen Celf1 separat in Mausmodellen 16,17 wurden untersucht. diese sequentielle genetischen / pathologischen Ereignisse Modellierung ist technisch anspruchsvoll und zeitraubend, wenn in Tiermodellen durchgeführt. Wie in dieser Studie gezeigt, ermöglicht die kombinierte Verwendung von Fluoreszenz- und arzneimittelresistente Marker die Modellierung von zusätzlichen molekularen Ereignisse in myotonische Dystrophie. Die Modelle in dieser Studie festgestellt wäre nützlich, in die detaillierten Mechanismen in DM1 Pathogenese sezieren. Sie würden auch wertvoll sein für Drogen in Screening, die verschiedene Schritte der DM1 Pathogenese Ziel. Die Strategien und Verfahren dafürStudie beleuchten können andere Muskelkrankheit Modelle in Myoblasten auf etablieren.

Muskeldystrophie (DM) ist eine autosomal dominante Erkrankung , die mehrere Systeme betrifft, vor allem Herz- und Skelettmuskulatur 1. Es gibt zwei Subtypen dieser Krankheit, DM1 und DM2. DM1 ist häufiger und hat 2 eine schwere Manifestation als DM2. Die genetische Mutation DM1 zugrunde liegt , ist eine Erweiterung der CUG Triplett - Wiederholungen in der 3&#39; - untranslatierten Region liegt (UTR) von DM - Proteinkinase - Gen (DMPK) 3. Der CUG Wiederholungszahl in nicht betroffenen Individuen variiert von 5 bis 37. Im Gegensatz dazu erhöht sich auf mehr als 50, und manchmal bis zu Tausenden in DM1 Patienten 4. Als Ergebnis RNA-bindende Proteine, wie muscle-like 1 (MBNL1), CUGBP und Elav-like Familie 1 (Celf1) falsch reguliert sind. Aufgrund der Sequestrierung auf den CUG repeats erweitert, verliert seine Fähigkeit MBNL1 5 alternatives Spleißen zu regulieren. Celf1, andererseits wird 6,7 hochreguliert. Die Überexpression von Celf1 mit Muskelverlust verbundenund Schwäche, die zum Verlust nicht von MBNL1 Funktion zugeschrieben werden. Tiermodelle DM1 bedingte Veränderungen Simulieren, einschließlich DMPK 3&#39;-UTR CUG Expansion, Verlust von MBNL1 und Überexpression von Celf1, festgelegt wurden. Allerdings bietet die Modellierung DM1 in Myoblasten eine effiziente Alternative, vor allem für Sezieren DM1 bezogenen zellulären und molekularen Ereignisse. C2C12 Myoblasten - Zelllinie wurde zum ersten Mal von verletzten C3H Maus Muskel isoliert und weit verbreitete Muskeldifferenzierung 8,9 zu studieren. C2C12 Zellen vermehren sich rasch in fötalem Rinderserum (FBS) Medien -haltigen und leicht Differenzierung durchmachen, wenn FBS erschöpft ist. Doch dieses Myoblastendifferenzierung Modell stellt zwei Herausforderungen: C2C12-Zellen sind oft resistent gegen Gen-Transfektion / Virusübertragung; und leichte Variationen in die Handhabung von Zellen und Differenzierungsverfahren kann zu deutlichen Veränderungen in Myotube Bildung führen. Unser Labor routinemäßig verwendet C2C12 Myoblasten als acell - Modell und hat Protokolle entwickelt , die effektiv Gene durch Plasmidtransfektion 10, retrovirale Transduktion und lentivirale Transduktion in C2C12 - Zelllinie zu liefern. Im Video zeigen wir die optimierte Verfahren für die Transfektion / Transduktion C2C12-Zellen und die Differenzierung Konsistenz beibehalten in Modellen DM1 Myoblasten zu etablieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="804">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11965-084</td>
			<td style="width:325px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S11150</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">10378-016</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin from bovine pancreas</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">I6634-100MG</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">equine serum</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S12150</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE&#160;HD&#160;Transfection Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">E2311&#160;</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">G418 sulfate&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Gold Biotechnology&#160;</td>
			<td style="width:151px;">G-418-10</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">sc-108071</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0323BOX</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP00061</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m</td>
			<td style="width:112px;">GE healthcare life science</td>
			<td style="width:151px;">10600015</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MF 20</td>
			<td style="width:112px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:151px;">MF 20</td>
			<td>primary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">T-862</td>
			<td>secondary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">One step qRT-PCR MasterMix</td>
			<td style="width:112px;">AnaSpec</td>
			<td style="width:151px;">05-QPRT-032X</td>
			<td>for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">11667165001</td>
			<td>for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CUG-BP1 Antibody (3B1)</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-20003</td>
			<td>primary Ab western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Actin Antibody</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-1615</td>
			<td>goat polyclonal IgG for loading control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">293T Ecopack</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">631507</td>
			<td>cells for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pMSCV-puro</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">634401</td>
			<td>empty retroviral vector for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMSCV-Celf1Flag-puro</td>
			<td style="width:112px;">house-constructed</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">psPAX2</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMD2.G</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP-CUG5</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP- CUG200</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">X100</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P6148</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TWEEN&#160;20</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P9416</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D9542</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells

Muskeldystrophie 1 (DM1) ist eine häufige Form der Muskeldystrophie. Obwohl mehrere Tiermodelle haben für DM1, Myoblasten Zellmodelle sind nach wie vor wichtig, weil sie eine effiziente zelluläre Alternative für die Untersuchung zellulärer und molekularer Ereignisse bieten etabliert. Obwohl in großem Umfang Zellen C2C12 Myoblasten verwendet myogenesis, Resistenz gegen Gen-Transfektion oder virale Transduktion zu studieren, behindert die Forschung in C2C12-Zellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll, das die tägliche Wartung umfasst, Transfektion und Transduktion Verfahren Gene in C2C12 Myoblasten und die Induktion von myocyte Differenzierung einzuführen. Gemeinsam ermöglichen diese Verfahren am besten Transfektion / Transduktionseffizienzen sowie konsequente Differenzierung Ergebnisse. Das Protokoll bei der Einrichtung DM1 Myoblasten Zellmodelle beschrieben würde die Studie von Muskeldystrophie zugute kommen, sowie andere Muskelerkrankungen.

C2C12-Zellen wurden mit GFP-CUG5 oder GFP-CUG200 transfiziert. Nach Medikamentenresistenz Selektion wurden stabile Pools hergestellt, das durch die GFP - Expression (Abbildung 1A) sichtbar gemacht werden kann. Myotube Bildung in den differenzierten Myoblasten wurde von Myosin schwere Kette Immunofärbung 10 (1B) detektiert. Die Quantifizierung der Myotube Bildung zeigte , dass Fusions Indizes von 35,4 ± 4,1% auf 2,6 ± 1,1% und Myotube Bereiche wurden von 35,6 ± 2,2% auf 2,7 ± 0,8% durch abnorme CUG Expansion in GFP-CUG200 (1C) verringerte sich verringert wurden. Das Fusionsindex und die Myotuben Bereich wurden über die Gesamtzahl der Kerne in Myotuben (≥ 2 Kerne), dividiert durch die Gesamtzahl der Kerne und der Prozentsatz der gesamten Bildfläche von Myotuben bzw. abgedeckt gezählt. Echtzeit - RT-PCR wurde durchgeführt , 10 - Expression für eine Anzahl von Muskeln zu analysieren verschiedeneiation verwandte Gene einschließlich MyoD, MYOG, Mef2c und Celf1. Im Vergleich zu CUG5 Kulturen erhöhte CUG200 die Expression von mRNA Celf1 in Myoblasten zu Beginn der Differenzierung proliferierenden. Deckungsgleich mit früheren Berichten wurde Celf1 upregulation mit GBG-Expansion in myogenic Dystrophie 1 (1D) zugeordnet ist . Ferner wurde Western - Blot - 10 zeigte durchweg Celf1 Proteinebene (Abbildung 1E) erhöht, und CUG200 die Expression von MyoD, MYOG und Mef2c während der Differenzierung (Abbildung 1D) gehemmt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die GBG-Erweiterung führt Defekte und die Beeinträchtigung der Myoblastendifferenzierung zu Myotube. Um die Rolle von Celf1 in Myoblasten Differenzierung Studie wurde pMSCV- Celf1Flag retroviraler Vektor konstruiert C2C12 - Zellen zu transduzieren. 10 Puromycin-resistente Klone Differenzierungsstudien wurden gepoolt. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass die Flag-tagged Celf1 war nur in den pMSCV-Celf1Flag transduzierten Kulturen und die Expression des Proteins wurde Celf1 aufreguliert (2A). Die Bildung von Myotuben in Zellen Celf1-überexprimierenden ist selten , wenn zu den Kontrollkulturen (2B) verglichen, was darauf hindeutet , dass die Überexpression von Celf1 stark Myoblasten Differenzierung beeinträchtigt. Um festzustellen, ob Celf1 Knockdown die Differenzierung Mangel in GBG-Expansion Zellen rettet, wurde Celf1 shRNA GFP-CUG200 Zellen von lentiviralen Vektoren geliefert. Doppel-resistente Klone (G418 und Puromycin) wurden für die Differenzierung Studien ausgewählt und vereinigt. Die Höhe der endogenen Celf1 Protein wurde in Gegenwart von Celf1 shRNA (3A) deutlich reduziert. Nach 6 Tagen Differenzierung, war die Wirkung von Celf1 shRNA auf Myotube Bildung zunehmenden evident (3B). Fusion Indizes und Myotube sindso waren 16,1 ± 3,0% und 15,2 ± 1,2% betragen, im Vergleich zu 4,6 ± 0,8% und 5,1 ± 1,3% in Kontrollkulturen (3C). Inzwischen deuten darauf hin , real-time RT-PCR - Ergebnisse , dass die Expression von MyoD, MYOG und Mef2c deutlich in Celf1 shRNA - Zellen erhöht wurde (Abbildung 3D) Unterstützung Celf1 Knockdown myocyte Differenzierung Mangel gerettet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig1.jpg" /> Abbildung 1. CUG-Expansion Hemmt Muskelzellen Differenzierung in C2C12 - Zellen. (A) C2C12 - Zellen exprimiert GFP-CUG5 oder GFP-CUG200 ubiquitär nach der Auswahl. Maßstabsbalken sind 100 &amp; mgr; m. Diese Zahl wurde aus unserem vorherigen Papier geändert . 10 (B) Myotuben wurden in GFP-CUG5 Zellen gebildet , aber weniger in GFP-CUG200 Zellen. Myotuben wurden von Myosin schwere Kette (MF-20) Immunfärbung sichtbar gemacht. Maßstabsbalken sind 100 &amp; mgr; m. (C) </strOng&gt; GFP-CUG200 Kulturen Fusion Index und Myotube Bereichen deutlich reduziert. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. (D) Echtzeit - RT-PCR - Analyse von Celf1, Transkriptionsfaktoren MyoD, MYOG und Mef2c Expression während der Differenzierung der Myoblasten. mRNA-Spiegel wurden nach dem GAPDH normalisiert aufgetragen. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. Student-T-Test wurde durchgeführt, um die Tests zu Kontrollen zu vergleichen. n&gt; 3, * P &lt;0,05. (E) GFP-CUG200 Transfektion erhöhte Celf1 Proteinexpression. ß-Aktin als Ladekontrolle gezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54078/54078fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54078/54078fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Überexpression von Celf1 Beeinträchtigt Myoblastendifferenzierung. (A) Der Nachweis von exogenen Celf1Flag expression in C2C12 - Zellen durch Western - Blot. (B) Myotube Bildung wurde in Celf1Flag-überexprimierenden C2C12 Myoblasten beeinträchtigt. Myotuben wurden von MF-20-Immunfärbung sichtbar gemacht. Maßstabsbalken sind 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54078/54078fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54078/54078fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig3.jpg" /> Abbildung 3. Sturz von Celf1 Teil Rettungen CUG-Expansion-Induced Myoblastendifferenzierung Mangel. (A) Nachweis der Celf1 Knockdown durch Western - Blot. (B) Celf1 shRNA induziert Myotube Bildung in GFP-CUG200 Myoblasten. Myotuben wurden von MF-20-Immunfärbung sichtbar gemacht. Maßstabsbalken sind 100 &amp; mgr; m. (C) Celf1 shRNA-geretteten Zellen , die Fusion - Index und Myotube Bereiche erhöht hatte. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. (D) Echtzeit - RT-PCR - Analyse von Celf1, Transkriptionsfaktoren MyoD, MYOG und Mef2c Expression während der Differenzierung. mRNA-Ebene wurde aufgetragen, nachdem der von GAPDH normalisiert. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. Student-T-Test wurde durchgeführt, um die Tests zu Kontrolle zu vergleichen. n&gt; 3, * P &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54078/54078fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54078/54078fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren in Muskeldystrophie 1 Myoblasten Modelle Gründung, einschließlich optimierte C2C12 Zell Wartung, Gen-Transfektion / Transduktion und Myozyten-Differenzierung.

Modellierung Muskeldystrophie 1 in C2C12 Myoblastenzellen

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

modeling-myotonic-dystrophy-1-in-c2c12-myoblast-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

15.1K Aufrufe.  University of Houston.  In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren in Muskeldystrophie 1 Myoblasten Modelle Gründung, einschließlich optimierte C2C12 Zell Wartung, Gen-Transfektion / Transduktion und Myozyten-Differenzierung. 

Serie: Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Modeling Intracerebral Hemorrhage in Mice: Injection of Autologous Blood or Bacterial Collagenase

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) defines a potentially life-threatening neurological malady that accounts for 10-15% of all stroke-related hospitalizations and for which no effective treatments are available to date1,2. Because of the heterogeneity of ICH in humans, various preclinical models are needed to thoroughly explore prospective therapeutic strategies3. Experimental ICH is commonly induced in rodents by intraparenchymal injection of either autologous blood or bacterial collagenase4. The appropriate model is selected based on the pathophysiology of hemorrhage induction and injury progression. The blood injection model mimics a rapidly progressing hemorrhage. Alternatively, bacterial collagenase enzymatically disrupts the basal lamina of brain capillaries, causing an active bleed that generally evolves over several hours5. Resultant perihematomal edema and neurofunctional deficits can be quantified from both models. In this study, we described and evaluated a modified double injection model of autologous whole blood6 as well as an ICH injection model of bacterial collagenase7, both of which target the basal ganglia (corpus striatum) of male CD-1 mice. We assessed neurofunctional deficits and brain edema at 24 and 72 hr after ICH induction. Intrastriatal injection of autologous blood (30 &mu;l) or bacterial collagenase (0.075U) caused reproducible neurofunctional deficits in mice and significantly increased brain edema at 24 and 72 hr after surgery (p&lt;0.05). In conclusion, both models yield consistent hemorrhagic infarcts and represent basic methods for preclinical ICH research.

Clinically relevant animal models of intracerebral hemorrhage (ICH) are needed to extend our knowledge of hemorrhagic stroke and to examine novel therapeutic strategies. In this study, we describe and evaluate two ICH models that implement unilateral injections of either autologous whole blood or bacterial collagenase into the basal ganglia (corpus striatum) of mice.

Modeling Hirnblutung in Mice: Injektion von Eigenblut oder bakterielle Collagenase

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) defines a potentially life-threatening neurological malady that accounts for 10-15% of all stroke-related ...

Forschung

Medizin

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully recapitulate early- and late-stage metastatic disease progression. Typical tumor implantation models utilize ectopic or orthotopic primary tumor implantation, but few include systemic spontaneous metastatic disease that mimics the clinical setting. This protocol describes the key steps to develop RCC disease progression stages similar to patients. First, it uses a highly metastatic mouse tumor cell line in a syngeneic model to show orthotopic tumor cell implantation. Methods include superficial and internal implantation into the sub-capsular space with cells combined with matrigel to prevent leakage and early spread. Next it describes the procedures for excision of tumor-bearing kidney (nephrectomy), with critical pre- and post- surgical mouse care. Finally, it outlines the steps necessary to monitor and assess micro-and macro-metastatic disease progression, including bioluminescent imaging as well provides a detailed visual necropsy guide to score systemic disease distribution. The goal of this protocol description is to facilitate the widespread use of clinically relevant metastatic RCC models to improve the predictive value of future therapeutic testing.&#160;

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Models of spontaneous metastatic renal cell carcinoma (RCC) disease progression can be used for evaluating treatments in a clinically relevant setting. This protocol demonstrates different procedures for orthotopic kidney tumor cell implantation, proper nephrectomy, and finally outlines a necropsy guide for visual and bioluminescent scoring of metastatic burden and localization.

Modellierung Spontane metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) in Mäusen nach Nephrektomie

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modeling Chemotherapie beständig Leukämie<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon skipping employs short DNA/RNA-like molecules called antisense oligonucleotides (AONs) that restore the reading frame and produce shorter but functional proteins. However, exon skipping therapy faces two major hurdles: limited applicability (up to only 13% of patients can be treated with a single AON drug), and uncertain function of truncated proteins. These issues were addressed with a cocktail AON approach. While approximately 70% of DMD patients can be treated by single exon skipping (all exons combined), one could potentially treat more than 90% of DMD patients if multiple exon skipping using cocktail antisense drugs can be realized. The canine X-linked muscular dystrophy (CXMD) dog model, whose phenotype&#160;is&#160;more similar to human DMD patients, was&#160;used to test the systemic efficacy and safety of multi-exon skipping of exons 6 and 8. The CXMD dog model harbors a splice site mutation in intron 6, leading to a lack of exon 7 in dystrophin mRNA. To restore the reading frame in CXMD requires multi-exon skipping of exons 6 and 8; therefore, CXMD is a good middle-sized animal model for testing the efficacy and safety of multi-exon skipping. In the current study, a cocktail of antisense morpholinos targeting exon 6 and exon 8 was designed and it restored dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. Methods for transfection/injection of cocktail oligos and evaluation of the efficacy and safety of multi-exon skipping in the CXMD dog model are presented.

Exon skipping is currently a&#160;most promising therapeutic option for Duchenne muscular dystrophy (DMD). To expand the applicability for DMD patients and to optimize the stability/function of the resulting truncated dystrophin proteins, a multi-exon skipping approach using cocktail antisense oligonucleotides was developed and we demonstrated systemic dystrophin rescue in a dog model.

Auslassen von Multi-Exon-Verwendung Cocktail Antisense-Oligonucleotiden in der Canine X-chromosomal-Muskeldystrophie

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide (AON)-mediated therapy. While SMN1 mutations are responsible for the disease, AONs targeting intronic splice silencer (ISS) sites in SMN2, including FDA-approved nusinersen, have been shown to restore SMN expression and ameliorate the symptoms. Currently, many studies involving AON therapy for SMA focus on investigating novel AON chemistries targeting SMN2 that may be more effective and less toxic than nusinersen. Here, we describe a protocol for in vitro evaluation of exon inclusion using lipotransfection of AONs followed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and Western blotting. This method can be employed for various types of AON chemistries. Using this method, we demonstrate that AONs composed of alternating locked nucleic acids (LNAs) and DNA nucleotides (LNA/DNA mixmers) lead to efficient SMN2 exon inclusion and restoration of SMN protein at a very low concentration, and therefore, LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides may be an attractive therapeutic strategy to treat splicing defects caused by genetic diseases. The in vitro evaluation method described here is fast, easy, and sensitive enough for the testing of various novel AONs.

Various antisense oligonucleotides (AONs) have been shown to induce exon inclusion (splice modulation) and rescue SMN expression for spinal muscular atrophy (SMA). Here, we describe a protocol for AON lipotransfection to induce exon inclusion in the SMN2 gene and the evaluation methods to determine the efficacy in SMA patient fibroblasts.

Bewertung der Exon-Aufnahme durch induzierte Splice Switching Antisense Oligonukleotide in SMA Patienten Fibroblasten

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...