Unterstützt durch ein National Cancer Institute Zuschuss 1R03CA172923 teilweise.

Ethik-Statement: Die Verwendung von Mäusen in der Forschung ist nur dann akzeptabel, in Fällen, in denen es die menschliche Verständnis der grundlegenden Biologie oder zur endgültigen Behandlung von Krankheiten voranbringen könnten. 1. Bestellung <ol><li> Kauf weiblichen C57BL / 6-Mäuse (Alter von 6 - 8 Wochen), 5 Mäuse pro Gruppe. Erlauben mehrere Tage für die Mäuse einzustellen. </li></ol> 2. Herstellung von B16-BL6 Zellen <ol><li> Entfernen Zellkulturplatten aus einem 37-Grad-Inkubator und in einer sterilen Haube. Platten sollten etwa 70% konfluent mit B16-BL6 murine Melanom-Zellen sein. Eine größere Zusammenfluß können die Zellen metastatische Potential verändern. </li><li> 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro Platte, lassen für 1 Minute sitzen, und dann die Trypsin-Media-Lösung absaugen. </li><li> 1 ml Trypsin pro Platte und Rückplatten in den Inkubator für 10 min. </li><li> die Platten aus dem Inkubator in die sterile Haube, 4 ml Serum-freien Rosewell Park Memorial Institute Mediu Nach dem Umzugm (RPMI) zu jeder Platte. </li><li> Sammeln Sie die Zellen mit einer sterilen, motorisierten Pipette. Eject-Zellen gegen die Unterseite der Platte, mit der Spitze in einem sehr kleinen Winkel gedrückt, um die Zellen aufzubrechen. Mehrmals wiederholen, um eine ausreichende Trennung von Zellklumpen zu gewährleisten, die sonst die Auswurf Nadel verstopfen könnten. Erinnere und Transfer zu einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zelldichte zu bestimmen. Halten der Gesamtanzahl von B16-BL6 Zellen konstant das Volumen der serumfreien RPMI bestimmen benötigt Endkonzentrationen von 0, 0,065, 0,015, 0,25 und 0,5 Millionen Zellen / ml zu erreichen. </li><li> Ebenso Aliquotierung die Medien in der 50-ml-Tube zu 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugiere die konische Röhrchen bei 2.250 xg für 5 min. Dekantiert die Medien. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von Serum-freiem RPMI und bestätigen Sie die gewünschte Zelldichte über Hemacytometer. Stellen Sie densities- durch Hinzufügen zusätzlicher RPMI oder Spinnen und Resuspendieren in einem kleineren volumen- entsprechend. </li><li> Aliquot 500 uljeder Zellsuspension in beschriftete 1,8 ml Röhrchen auf Eis. </li></ol> 3. Schwanzveneninjektion <ol><li> Nehmen Sie eine Maus, am Schwanz gehalten, und führen Sie ihn rück zuerst in die Maus Verzögerer. Mit dem Rumpf in der Hauptkammer des Verzögerer, mit dem Schwanz außerhalb, ziehen Sie die Maus gegen Ende des Verzögerer. Legen Sie die Verzögerer-Kolben, weiter zu drücken, bis die Maus sicher ist. </li><li> Drehen Sie die Maus um 90 Grad, so dass eine der seitlichen Schwanzvenen nach oben zeigt. Mit einem Alkoholtupfer reinigen kräftig auf die Seite der Schwanz der Maus, insbesondere dort, wo die Schwanzvene am deutlichsten sichtbar. Hinweis: Eine gute Beleuchtung für eine effektive Schwanzvene Visualisierung auf B57BL / 6J Mäuse wesentlich ist. Heizlampen oder erhitzte Chirurgie Pads, während die nicht erforderlich ist, wird auch dazu beitragen, indem das Volumen der Schwanzvene zu erhöhen. </li><li> In einem sterilen Kulturhaube, sammeln 300 ul Zellkulturmedien von den 2 Millionen Zellen / ml Röhrchen. Kehren Sie die Nadel, blätterte die side und den Kolben drückt, um Blasen aus der Spritze auszustoßen. Auszuwerfen Kultur RPMI in einem Endvolumen von 250 ul zu ergeben. </li><li> Ziehen Sie die Maus-Leitwerk mit nicht-dominanten Hand. Halten den Schwanz mit dem proximalen Ende des Endstücks mit dem Zeigefinger der nicht-dominanten Hand erhöht, und der distale Teil des Schwanzes mit dem Daumen niedergedrückt. Hinweis: Auf diese Weise wird die Schwanzvene in einer seitlichen Position gehalten wird, parallel zu der Verzögerer Oberfläche, mit einem kongruenten Eintrag möglich, in der mehr distalen Teil des Schwanzes. </li><li> Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene, zum distalen Ende hin, in einer Minute Winkel nach unten zu beginnen, und dann stellen Sie die Nadel den Winkel der Schwanzvene bei weiterem Einführen (Senkung Kolbenende der Spritze relativ zur Nadel) zu entsprechen . </li><li> Führen Sie die Nadel ca. 1 cm in die Schwanzvene. Nach dem Einsetzen beginnen den Kolben zu drücken, wobei die Nadel stabil zu halten. Hinweis: Wenn die Nadel in die Schwanzvene ist und das Ende der Nadel not behindert die Medien ungehindert in die Vene fließen sollte. Effektive Injektion wird durch Blut-Clearance von der Vene aus. Wenn es Widerstand gibt, oder eine Blase beginnt an der Stelle in Injektion zu bilden, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut an einer proximalen Stelle entlang der Schwanzvene. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Vene und entsorgen. Halten Sie Gaze gegen die Eintrittsstelle eine Blutung zu stoppen. </li><li> Entfernen Sie den Kolben aus der Verzögerer und legen Sie die Maus in den Empfänger Käfig. </li><li> Wiederholen Sie dies für alle anderen Konzentrationen. . Hinweis: Lungenherde Einrichtung dauert ca. 2 - 3 Wochen, mit Variabilität je nach Zelllinie und die gewünschte Größe der Brennpunkte 9 In der Zwischenzeit Mäuse sollten für Symptome beobachtet werden , die früh Euthanasie, wie übermäßige Keuchen rechtfertigen könnte. </li></ol> 4. Zählen der Lung Foci <ol><li> Euthanize der Maus durch in einem CO 2 Kammer platziert und Belichten auf 100% CO 2 </sub&gt; eingeführt bei 10-30% der Kammervolumen pro Minute für 5 min. Folgen Sie mit einem Genickbruch. </li><li> Spreizen Sie die Maus auf Styropor. Mit chirurgische Scheren, erstellen Sie einen chirurgischen Schnitt entlang des Brustbeins. </li><li> Bilden zwei zusätzliche Einschnitte, die beide von der Oberseite des Brustbeins Inzision und gegenüber den Schultern der Maus Verzweigungs, den Brustkorb ausgesetzt wird. </li><li> Machen Sie zwei Schnitte, die jeweils entlang der seitlichen Seiten des Brustbeins, den Brustkorb vom Rumpf zu entfernen, die Lungen und das Herz aussetzt. </li><li> das Herz mit chirurgischen Pinzette halten, schneiden Sie die Speiseröhre und Luftröhre, das Herz und die Lungen von der Maus zu befreien. Legen Sie unter einem Binokular, bei 10-facher Vergrößerung, für eine bessere Visualisierung. </li><li> Präparieren Sie das Herz von den Lungen und den Thymus zu entfernen, nur die beiden Lungen zu verlassen. </li><li> Mit den Lungen unter einem Binokular, beginnen die Lungenherde zu zählen. Jede Foci sollte als kreisförmiger, braun obtrusion auf der Oberfläche der Lunge auftreten. <ol><li> FürKonsistenz zwischen Mäusen, die Anzahl der Foci auf der Oberfläche eines Lappens zählen und dann diese Lappen invertieren. jeder der vier Lappen tun können einzeln für eine einfachere Zählen. </li></ol></li><li> Speichern und die Lunge festsetzen, wenn der IHC mit, andernfalls verwerfen die Reste. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Zirkulierende Tumorzellen von einem Schwanzveneninjektion die Metastasen darstellen, die Websites von primären Wachstum entziehen und wandern durch Routen wie Blut oder lymphatischen Systems, gelegentlich selbst in den kapillaren Betten von entfernten Standorten zu etablieren. 14 Die oben beschriebenen Protokoll dient als Modell für die Sekundär Metastasen. Mit einer optimalen Anzahl von B16-BL6-Zellen injiziert, kann Experimentatoren bestimmen die relative Wirkung eines verabreichten Arzneimittels oder Immunzellpopulation, post-Neutralisierung, auf Metastasierung von Krebszellen. Dieses Protokoll hat seine Grenzen. Die zirkulierenden Tumorzellen wurden für ihre Fähigkeit ausgewählt , zu metastasieren und sind daher nicht immunogen, geringere Mengen an Haupthistokompatibilitäts mit komplexen Klasse 1 - Moleküle. 12 Ferner ist die plötzliche und gruppierten Einführung einer großen Anzahl von Metastasen im Gegensatz zu dem typischen Szenario ist bei Patienten , wo eine kleine Anzahl von metastatischen Tumorzelleneinen verlängerten Zeitraum aus der primären Tumorlokalisation dissipieren über. Zusätzlich werden die intravenös eingeführten Tumorzellen aus der Gewebekultur und nicht die von einem Primärtumor Ursprungs. Daher sind diese Zellen im Gegensatz zu den sekundären Metastasen , die sich aus Veränderungen in der Zelladhäsion führen, Migration, Immunerkennung und Empfängerorgan Einrichtung. 15,16 Ein alternatives Protokoll würde für die Erzeugung von Primärtumoren und der Analyse der resultierenden &quot;spontanen&quot; Lungenmetastasen die subkutane Injektion von B16 / BL6 sein. Diese &quot;spontane&quot; Metastasen gefunden wurden, um mehr Heterogenität als ihre &quot;experimentell&quot; Pendants enthalten, genauer die der menschlichen Patienten entsprechen. Das Protokoll ist die Begrenzung in seiner Fähigkeit, den Einfluss einer experimentellen Verbindung auf die Metastase zu bestimmen. Mit einer seitlichen Schwanzveneninjektion, die Anzahl von Melanomen in den Blutstrom injizierten Zellen über h approximierenemocytometer. Mit &quot;spontanen&quot; Metastasierung jedoch gibt es eine größere Heterogenität zwischen Tumoren, Hinzufügen eine zusätzliche Variable für die Anzahl der Lungenherde entstehen. 16 Zusammenfassend stellt die Schwanzvene B16-BL6 murine Melanommodell ein einfaches Modell des Einflusses einer Behandlung oder Immuntherapie auf Metastase zu bestimmen. Durch intravenöse Injektion zirkulierende Tumorzellen können Forscher replizieren, zu einem gewissen Grad Patienten post Metastasierung. Betrachtet man die zerstörerischen Auswirkungen des metastasierten Tumorzellen in den Krebspatienten, dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die mehrstufiger Prozess der Metastasierung zu verstehen.

Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Todesfälle bei Patienten mit malignen Erkrankungen. Der Prozess der metastatischen Verbreitung von Krebszellen ist wenig verstanden, aber scheint mehrere Schritte beinhalten, einschließlich Invasion benachbarter Gewebe, intravasation in die Lymphgefäße und Blutgefäße, das Überleben und Translokation innerhalb des Kreislaufsystems, Extravasation aus dem Gefäßsystem am Ort der Metastasierung, Adaptation Jede dieser biologischen Ereignisse an den neuen Mikroumgebung der neuen Website und Kolonisation am neuen Standort durch die Proliferation und Bildung von sekundären Tumoren. 1 umfassen die Transformation, die Verbreitung und das Überleben von metastasierenden Tumorzellen. Zum Beispiel kann die Umwandlung des epithelialen Phänotyps der Tumorzelle in einen mesenchymalen Phänotypen, verbunden mit der erfolgreichen Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix, damit sie benachbarte Gewebe einzudringen und sich auf andere Teile des Körpers metastasieren. 2,3 Darüber hinaus können diese metastatischen Zelleninnerhalb des zirkulierenden Blutstrom und entziehen Immunüberwachung vom Host überleben muss. 4,5 Wenn schließlich an einer entfernten Stelle im Körper implantiert, müssen die Tumorzellen zu ihrer Mikroumgebung um Sekundärtumoren zu proliferieren und bilden anzupassen. 6,7 Deshalb , obwohl Metastasierung ein häufiges Phänomen bei Krebspatienten ist, haben metastasierten Tumorzellen mehrere Bereiche der Verwundbarkeit, die therapeutische Intervention zugänglich sind. In Anbetracht der immunogene Natur des Melanoms, und die jüngste Interesse an Immuntherapien, Modelle für Melanome sind immer nützlich. 8 In den Vereinigten Staaten allein ist das Melanom die Ursache von schätzungsweise 9.000 Todesfälle pro Jahr. 9 Gemeinsame Positionen von Melanom - Metastasen sind Knochen, Gehirn , Leber und Lunge. Die Mehrheit von Metastasen zu entfernten Stellen auftreten, durch den Blutkreislauf. Zirkulierende Tumorzellen im Blut muss Immunclearance entziehen, ein kapillares Bett eines distalen Organ erreichen unddringen durch die Endothelzellen des Blutgefäßes, um sich erfolgreich zu etablieren. 4-7,10, 11 Zur Nachahmung wurde die gemeinsamen und virulent Phänomene der Metastasierung, die Maus-B16-BL6-Zelllinie erstellt. A decedent der parentalen C57BL / 6 Melanomzelllinie B16-F0, B16-BL6 ist das Endprodukt von 10 aufeinander folgenden Selektionen für Lungenmetastasen von intravenöser Injektion (resultierend in B16-F10), gefolgt von 6 aufeinanderfolgenden Auswahlen für Blasenmembranpenetration. 12 als solches ist es ein zuverlässiges Melanomzelllinie für die Einrichtung von metastatischen Foci in der Maus, insbesondere bei intravenöser Injektion. 13 Nach dem Einspritzen einer ausreichenden Menge von B16-BL6-Zellen in die Schwanzvene einer B57BL / 6-Maus, gefolgt von zwei oder mehr Wochen der Implantation und das Wachstum der B16 / BL6 Zellen zu ermöglichen, wird Metastasenherde in der Lunge bilden. Nach Euthanasie und die Überprüfung durch Sezieren Mikroskopie, die Zahl dereinzelne Brennpunkte vorhanden quantifiziert werden können. Dies wiederum kann verwendet werden, um eine Dosis-Metastase Wirkung herzustellen, da die Anzahl der injizierten B16-BL6 Zellen, die mit der Anzahl von Foci korreliert auf der Oberfläche der Lunge gebildet. Dieses Modell wird als &quot;experimentelle Metastasierung&quot;, bekannt, bei denen bekannt-metastatischen Zellen direkt in den Blutstrom eingeführt werden, eine rasche und vorhersehbare Verbreitung und Etablierung in der Lunge, Leber oder andere Organe der Untersuchung zu erleichtern. Dies steht im Gegensatz zu &quot;spontanen Metastasierung&quot; , wo Tumorzellen implantiert werden, oft subkutan und Metastasen stammen aus kontrolliert biologischem Krebszellen zu vergießen. 14,15 Es ist wichtig, eine geeignete Menge an B16 / BL6-Zellen in die Schwanzvenen der Mäuse zu injizieren. Zu viele, und die Lungen werden mit Metastasen und benachbarten Brennpunkte werden voneinander nicht zu unterscheiden abgedeckt sein. Zu wenig, und der Einfluss eines therapeutischen Mittels wird aufgrund inhärenter vari ununterscheidbar seintionen zwischen den Injektionen. Um eine optimale Anzahl von Foci in den Lungen der C57BL / 6-Mäusen zu erhalten, ist es notwendig, die Anzahl der injizierten Zellen mit der Menge von etablierten metastasierenden Foci auf der Oberfläche der Lunge, während unter Berücksichtigung der Unterscheidbarkeit der einzelnen zu korrelieren Brennpunkte. Dieses Protokoll wird ein metastasierendem murine Melanommodell für C57BL / 6-Mäuse zeigen.

<table><tbody><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT15040CM</td><td></td></tr><tr><td>Phase Contraast Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine IV Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>14-829-1D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Alcohol Prep Pads</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Restrainer</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9999969</td><td>Restrainer choice depends on age/size of mice</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Harry Schein</td><td>NC0012697</td><td>Optional</td></tr></tbody></table>

injection of syngeneic murine melanoma cells to determine their metastatic potential in the lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Bei Sichtprüfung ist die Variation in der Oberflächen Foci evident. Zählen der Anzahl von Tumoren unter einem Präpariermikroskop sollte eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl der injizierten Tumorzellen und die Anzahl der daraus resultierenden und zählbar Foci ergeben. Verwendung einer optimalen Anzahl von injizierbaren Zellen ist das Ziel , eine , wenn die Lunge nicht vollständig abgedeckt, da sie auf 500.000 Zellen / ml in 1A sind, und nicht zu dünn bedeckt ist , wie sie bei 62.500 Zellen / ml und 125.000 Zellen / ml. Dies ist auch quantifizierbar durch lineare Korrelation (1B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" /> Abbildung 1. Lung Foci Resultierend aus Schwanzvene injiziert B16 / BL6 Zellen. (A) Lung Foci auf der Oberfläche der Lungen von C57BL / 6 - Mäuse als braune Kreis Massen (repräsentative Foki unter Pfeile) visualisiert werden. Da die Höhlenkeit der Zellkultur injiziert (über jedem Bild) erhöht, so die entsprechende Anzahl tut Lungenherde resultierenden (unter jedem Bild). Die Lungen aus der Maus mit der höchsten Dichte der injizierten Zellen hat die größte optische Abdeckung von Lungenherde. Maßstabsbalken repräsentieren 20 mm. (B) Enumeration der Lunge Brennpunkte relativ zu der Zellkulturdichte. Es ist eine annähernd lineare Beziehung über 125.000 Zellen / ml, wie durch Hämocytometer bestimmt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

17.6K Aufrufe.  Beth Israel Deaconess Medical Center & Harvard Medical School. Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Serie: Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Forschung

Medizin

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Krebsforschung

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was established using robust, reproducible in vivo models and standardized methods to identify novel players in melanoma metastasis. This approach allows for data inference at specific experimental stages to precisely characterize a gene's role in metastasis. Models are established by introducing genetically modified melanoma cells via intracardiac, intradermal, or subcutaneous injections into mice, followed by monitoring with serial in vivo imaging. Once preestablished endpoints are reached, primary tumors and/or metastases-bearing organs are harvested and processed for various analyses. Tumor cells can be sorted and subjected to any of several 'omics' platforms, including single-cell RNA sequencing. Organs undergo imaging and immunohistopathological analyses to quantify the overall burden of metastases and map their specific anatomic location. This optimized pipeline, including standardized protocols for engraftment, monitoring, tissue harvesting, processing, and analysis, can be adopted for patient-derived, short-term cultures and established human and murine cell lines of various solid cancer types.

This article describes a workflow of techniques employed for testing novel candidate mediators of melanoma metastasis and their mechanism(s) of action.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>In-vivo-Bildgebung zur Messung spontaner Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Zusammenfassung

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Experimentelle Metastase Assay

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu