Die vorliegende Studie wurde vom National Science Council gewährt Dr. Bai-Chuang Shyu (NSC 99-2320-B-001-016-MY3, NSC 100-2311-B-001-003-MY3 und NSC unterstützt 102-2320- B-001-026-MY3). Diese Arbeit wurde am Institut für Biomedizinische Wissenschaften durchgeführt, die Finanzierung von Academia Sinica erhalten.

Das Protokoll in der vorliegenden Studie erhielt die Genehmigung von der Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Ausschuss in Taiwan. 1. Tierpräparate <ol><li> Erhalten männliche Sprague-Dawley-Ratten (etwa 300-400 g). Pflegen Sie die Ratten in einem klimatisierten Raum (21 - 22 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit) unter einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Zyklus (Licht um 8:00 Uhr auf) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. </li></ol> 2. Experimentelles Verfahren <ol><li> Lassen Sie all die Ratten in die Umwelt in ihre Käfige für 1 Woche vor den Experimenten anzupassen. Während der Adaption, führen Sie die von Frey und Plantar-Tests Basislinien zu etablieren. </li><li> von Frey - Test <ol><li> Legen Sie die Ratte in einem Acryl-Gehäuse (30 cm × 30 cm × 80 cm) für 30 min für Wohnzwecke. </li><li> Erhalten von Frey Filamenten (Filament-Nr. 11 - 20), die die gleiche Länge haben, aber Durchmesser variierende einen Bereich zu schaffen,der Kräfte von 2-100 g. </li><li> Um die Pfotenrückzugsschwelle in der Hinterpfote einer Ratte beurteilen zu können, verwenden von Frey Filamenten das Zentrum der hindpaws durch einen netzartigen Anschluss auf der Acrylplatte bei 5 min intertrial Abständen zu stimulieren. Um den maximalen ausgeübten Druck aufnehmen, verwenden Sie die Fäden in aufsteigender Reihenfolge von niedrig bis hoch, bis die maximale angelegte Druck aufgezeichnet wird. 10 </li><li> Bei Ratten, die eine Pfote Rückzug Reaktion auf die Stimulation zeigen, notieren Sie die Glühfaden-Nummer. Bestimmen Sie die Entzugserscheinungen, die in dieser Studie entsprechend dem niedrigsten Reiz. </li><li> Wiederholen der gleichen Prozedur sofort für insgesamt dreimal hintereinander auf der gleichen Ratte. Konvertieren Sie die Glühfaden-Nummer in die entsprechende Kraft (in Gramm) und die Werte im Durchschnitt. </li></ol></li><li> Plantar - Test <ol><li> Legen Sie die Ratte in einem transparenten Plexiglas-Box (unterteilt in vier Rahmen, 80 cm × 30 cm × 15 cm) für 30 min für Wohnzwecke. </li><li> Verwenden Sie ein infrared Strahl die Mitte der Hinterpfote durch eine Glasplatte zu stimulieren. Stellen Sie die Infrarot-Lichtintensität eine durchschnittliche Pfotenrückzugsantwortlatenzzeit von etwa 10 Sekunden zu erhalten. Führen Sie eine Studie durch Drücken einer Taste, die auf der Infrarot-Lichtquelle dreht sich um und startet einen digitalen Solid-State-Timer. Manipulieren die Dauer des Infrarot-Lichtstrahl. </li><li> Notieren Sie sich die Dauer des Infrarotlichts, wenn die Ratten eine Pfotenrückzugsreaktion zeigen. Die längste Dauer sollte nicht mehr als 20 Sekunden in jedem Versuch Gewebeschäden zu vermeiden. Verwenden Sie ein intertrial Abstand von mindestens 5 min sukzessive Stimulation zu vermeiden. </li><li> Den Test mit drei Versuche für die linken und rechten Hinterpfoten, und berechnet den Mittelwert für jede Hinterpfote für jede Ratte. </li></ol></li><li> Kollagenase Lesion Chirurgie <ol><li> Anesthetize die Ratte mit 4% Isofluran bis Verlust der Zehen Prise Reaktion und somatischen Reaktionen auf chirurgische Stimuli auftreten. Pflegen Anästhesie mit 1,5-2% isoflurane für die Dauer der Operation. </li><li> Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Gerät mit einem einfachen Heizkissen auf Körpertemperatur bei 36,5 aufrechtzuerhalten - 37,5 ° C. Tragen Sie Augencreme auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Shave das Fell mit sterilisiertem elektrischen Haarschneider und einen glatten Schnitt zu machen (ca. 2-2,5 cm) mit einem Skalpell entlang der Mittellinie der Kopfhaut. Reinigen Sie die Haut und Schädel mit wechselnden Vorsehung Jod und 75% Alkohollösung zur Desinfektion. Während der chirurgischen Phase, verwenden 75% Alkohol alle Geräte, Werkzeuge zu sterilisieren, und die Werkbank sterilen Bedingungen zu halten. Vor, dass alle chirurgischen Materialien müssen in einem Dampfautoklaven sterilisiert werden. </li><li> Verwenden Sie die sterile Handschuhe und Instrumente, und bohren Sie ein kleines Loch (3 mm Durchmesser) in den Schädel mit einer elektrischen Bohrmaschine über die VB (einschließlich ventralen posteromedial Thalamuskern [VPM] und ventralen posterolateral Thalamuskern [VPL]) des Thalamus (3,0 -3,5 mm posterior, 3,0-3,5 mm lateralzu Bregma und von Schädeloberfläche 5,5-5,8 mm Tiefe). </li><li> Microinject 0,5 &amp; mgr; l normaler Salzlösung oder 0.125 U des Typs 4 Kollagenase-Lösung in den Kontroll- und Testgruppen, respectively. </li><li> Halten Sie die Injektionsnadel an Ort und Stelle für weitere 5 min für Arzneimitteldiffusion zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Sie Zahnzement das Loch in den Schädel zu füllen, und die Inzision vernähen. Nach Naht der Einschnitt, gelten die lokalen analgetischen Betäubungsmittel (Lidocain-Salbe) auf die Wunde, und bringt sie in ihre Heimatkäfige. </li><li> Nach der Operation Haus einzeln die Ratten in Plastikkäfigen, bis sie Brustlage halten und warm hält von der Anästhesie erholt, bis. </li></ol></li><li> Verhaltenstests nach der chirurgischen Wiederherstellung <ol><li> Nach 7 Tagen der Genesung von der Operation, wiederholen Sie die Prozeduren in den Abschnitten 2.2 und 2.3 für die Testphase. Führen Sie die Verhaltenstests über 4 Wochen, während die Gesundheitsüberwachung und Entwicklungsstand der Tiere. </li><li&gt; Monitor den Gesundheitszustand der Tiere (zB Körpergewicht, Futtermenge und Freizügigkeit) zwischen der Kontroll- und Versuchsgruppen für die postoperative Phase. </li></ol></li><li> Führen Sie Cannula Implantierung mit PE-50 - Schläuche <ol><li> Anästhesieren die Ratte mit 4% Isofluran und Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 36,5 bis 37,5 ° C mit einer einfachen Heizkissen. </li><li> Mit einem Skalpell geschnitten, um zwei Löcher (2 cm Durchmesser jeweils) in der Mittellinie des Rückenteils der vorderen Gliedmaßen und Schnitt des ventralen Teil der linken Schulter und Brusthöhle sind. </li><li> Dissoziieren die Haut und Muskel mit einer Schere zwischen den beiden Löchern. </li><li> Ein Ende des PE- 50-Schlauch (20 cm Länge) an die äußere Jugularvene durch das ventrale Loch. Schließen Sie das Anschlussende des gleichen PE- 50 Schlauch mit dem Rückenloch und bringt an der Haut. </li><li> Verwenden Sie eine Spritze Kochsalzlösung in die Halsvene zu injizieren, um sicherzustellen, dass die PE- 50 Schlauchnicht behindert wird. </li><li> Nähen Sie den Schnitt, und injizieren die Ratten mit 6 mg / kg Gentamicin (intraperitoneal). </li><li> Spülen Sie den Schlauch jeden zweiten Tag nach der Operation mit 0,3 ml 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 0,1 ml Kochsalzlösung mit 20 U / ml Heparin. </li></ol></li><li> Schlussverhaltenstest <ol><li> Eine Woche nach dem Schritt 2.6, wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 dieses Verhalten zu bestätigen ist stabil im Vergleich zu Schritt 2.5 nach der chirurgischen Wiederherstellung. </li></ol></li><li> Radiotracer - Injection <ol><li> Legen Sie die Ratte in einer Ruhe Käfig 5 - 10 min für die Anpassung. </li><li> Mit einem Splitter verbinden PE- 50 Schlauch mit zwei 1 ml Spritzen. Füllen einer Spritze mit normaler Kochsalzlösung und füllt das andere mit [14 C] -IAP Lösung (125 uCi / kg in einem Volumen von 0,3-0,5 ml). </li><li> Injizieren Sie die Radiotracer in die externe Halsvene, und ersetzen Sie die Spritze mit einer anderen Spritze mit 3 M Kaliumchlorid gefüllt. </li><li> Zehn Sekunden nach dem Radiotracer injection, injizieren 3 M Kaliumchlorid unter einer Überdosierung von Isofluran und opfern , um die Tiere nach Standard Euthanasie Methoden (dh Isofluran aus einem Verdampfer für 50 min) , basierend auf den Richtlinien der Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Ausschuss in Taiwan. </li><li> Nach 1 min, setzen den Schädel, und schneiden Sie die verbleibenden Muskel ab. Mit rongeurs, ziehen Sie die dorsale Oberfläche des Schädels aus dem Gehirn entfernt. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit rongeurs. Als nächstes wird mit einem Spatel, schneiden Sie die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns, und das Gehirn zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindung das Gehirn in Trockeneis einzufrieren und Methylbutan (ca. -55 ° C). Lagern Sie das Hirngewebe in einem Gefrierschrank. 11, 12 </li></ol></li><li> Gehirn - Slicing <ol><li> Richten Sie das Gewebe in einem Mikrotom, mit dem Rautenhirns nach unten zeigt. Verwenden Sie ein Kryostat das Gehirn in 20 &amp; zu schneiden# 181; m-dicke Abschnitte. </li><li> Platzieren Sie die Hirnschnitten auf Objektträgern in einem Kryostaten bei -20 ° C, mit einem 240 um Intervall zwischen jeder Scheibe. </li><li> Legen Sie die Objektträger und fünf Standard-Filterpapiere mit abgestuften Radioaktivität in Belichtungskassetten für 3 Tage bei -20 ° C. Entsprechend der Reihenfolge der Gehirnscheiben, die Mikroskop-Objektträger von oben nach unten anordnen. Schließlich legen Sie die Filterpapiere in der Unterseite der Kassetten. 12 </li><li> Entfernen Sie den Phosphorschirm von den Belichtungskassetten und eine Variable-Modus Imager den Phosphorschirm und erzeugen Bilder zu lesen , um zu zeigen , [14 C] -IAP Aufnahme für die Hirnschnitten. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Nach dem Schritt 2.9.4, passen Sie die Bilder Statistische Parametric Mapping (SPM) und ImageJ-Software. Rekonstruieren alle Bilder seriellen Koronalschnitte verwenden. Glatte und normalisieren die Bilder gemäß einem Referenzrattenhirnmodell.12, 13 </li><li> Für die quantitative Einschätzungen, messen Sie die Region-of-Interest (ROI) des Gehirns Bilder mit ImageJ Software die Pixelsignalintensität, um zu bestimmen , und statistische Software für die Analyse verwendet werden . 12, 13 </li><li> Um die Verbindungen zwischen verschiedenen Hirnkernen zu untersuchen, verwenden MATLAB Korrelationsanalyse-Software Radioaktivität Verhältnis in einer überregionalen Korrelationsmatrix anzuzeigen, und visualisieren die Matrizen als Farbkarten. Schließlich verwenden für Netzwerkanalyse Pajek Software. 12, 13 </li><li> Verwenden Sie 2 x 5 Zwei-Wege-Mischvarianzanalyse (ANOVA), mit Gruppen- und Wochen als Faktoren, die Dauer der Hitzetoleranz in der Plantar-Test und mechanische Kraft in der von-Frey-Test in den Schein und CPSP Gruppen zu Beginn der Studie zu vergleichen und Woche 1 - 5. Mit einem 2 × 31 zwei-Wege-ANOVA die Radioaktivität Verhältnis gemäß Gruppe und Gehirnbereich zu messen. Wenn es angebracht ist , führen Tukey ehrlich signifikante Differenz (HSD) Post - hoc - Tests. Calculate Pearson Korrelationskoeffizienten Korrelationen zwischen allen ausgewählten Gehirnbereiche in der Sham und CPSP Gruppen zu bewerten. </li></ol>

<ol>
	<li>Finnerup, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+central+neuropathic+pain+states.">A review of central neuropathic pain states.</a> Curr Opin Anaesthesiol. 21 (5), 586-589 (2008).</li><li>Andersen, G., Vestergaard, K., Ingeman-Nielsen, M., Jensen, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+central+post-stroke+pain.">Incidence of central post-stroke pain.</a> Pain. 61 (2), 187-193 (1995).</li><li>Chen, B., Stitik, T. P., Foye, P. M., Nadler, S. F., DeLisa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+post-stroke+pain+syndrome:+yet+another+use+for+gabapentin?.">Central post-stroke pain syndrome: yet another use for gabapentin?.</a> Am J Phys Med Rehabil. 81 (9), 718-720 (2002).</li><li>Greenspan, J. D., Ohara, S., Sarlani, E., Lenz, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allodynia+in+patients+with+post-stroke+central+pain+(CPSP)+studied+by+statistical+quantitative+sensory+testing+within+individuals.">Allodynia in patients with post-stroke central pain (CPSP) studied by statistical quantitative sensory testing within individuals.</a> Pain. 109 (3), 357-366 (2004).</li><li>Klit, H., Finnerup, N. B., Jensen, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+post-stroke+pain:+clinical+characteristics,+pathophysiology,+and+management.">Central post-stroke pain: clinical characteristics, pathophysiology, and management.</a> Lancet Neurol. 8 (9), 857-868 (2009).</li><li>Kumar, G., Soni, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+post-stroke+pain:+current+evidence.">Central post-stroke pain: current evidence.</a> J Neurol Sci. 284 (1-2), 10-17 (2009).</li><li>Denk, F., McMahon, S. B., Tracey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+vulnerability:+a+neurobiological+perspective.">Pain vulnerability: a neurobiological perspective.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 192-200 (2014).</li><li>Ji, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+impairment+in+pain+through+amygdala-driven+prefrontal+cortical+deactivation.">Cognitive impairment in pain through amygdala-driven prefrontal cortical deactivation.</a> J Neurosci. 30 (15), 5451-5464 (2010).</li><li>Jungehulsing, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levetiracetam+in+patients+with+central+neuropathic+post-stroke+pain:+a+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Levetiracetam in patients with central neuropathic post-stroke pain: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Eur J Neurol. 20 (2), 331-337 (2013).</li><li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw.">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J Neurosci Methods. 53, 55-63 (1994).</li><li>Jay, T. M., Luciqnani, G., Crane, A. M., Jehle, J., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+blood+flow+with+[14C]iodoantipyrine+in+the+mouse.">Measurement of local cerebral blood flow with [14C]iodoantipyrine in the mouse.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 8 (1), 121-129 (1988).</li><li>Lu, H. C., Chang, W. J., Kuan, Y. H., Huang, A. C., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+[14C]iodoantipyrine+study+of+inter-regional+correlations+of+neural+substrates+following+central+post-stroke+pain+in+rats.">A [14C]iodoantipyrine study of inter-regional correlations of neural substrates following central post-stroke pain in rats.</a> Mol Pain. 11 (1), (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+brain+activation+during+retrieval+of+visceral+pain-conditioned+passive+avoidance+in+the+rat.">Functional brain activation during retrieval of visceral pain-conditioned passive avoidance in the rat.</a> Pain. 152, 2746-2756 (2011).</li><li>Wasserman, J. K., Koeberle, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+hemorrhagic+rat+model+of+central+post-stroke+pain.">Development and characterization of a hemorrhagic rat model of central post-stroke pain.</a> Neuroscience. 161 (1), 173-183 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In den Verhaltenstests zeigten die CPSP Gruppe Reduzierungen des Pfotenrückzugsschwelle bei der thermischen Schmerztest und mechanische Kraft in der Prüfung von Frey zu Beginn der Studie und Wochen . 1 - 5. Die Ergebnisse mit einer früheren Studie waren konsistent 14 Die [14 C] -IAP Verfahren beruht auf der Pixel - Intensität von Gehirnbildern für die quantitative Analyse von Gehirnschnitten. Um die Daten in den Gehirnbilder auszuwerten, wurde die Pixelsignalintensität definiert. 46,979 CPM - In der vorliegenden Studie wurden die Umwelthintergrundsignal wurde als 25,811 definiert. Das Signal des [14 C] -IAP 0,001 uCi Filterpapier wurde als CPM 42 definiert. Die Pixelsignalintensität war &lt;0,001 uCi, die als die Hintergrundintensität. Die Pixelintensität von fünf Filterpapieren wurde 0,001 bestimmt, 0,01, 0,1, und 10 &amp; mgr; Ci, für jede der Gehirnbilder als Pixelgrauskala dient. [14 C] -IAP Radioaktivität zeigte apositive Korrelation mit Pixelintensität und die Radioaktivität auf einer logarithmischen Skala zählen. Daher kann das obige Verfahren für die Kalibrierung von [14 C] -IAP Radioaktivität Intensität zu Pixel folgen. Wenn die [14 C] Durchführung -IAP experimentelle Protokoll müssen einige Punkte beachtet werden. Zum Beispiel kann die äußere Jugularvene blockiert werden, und Experimentatoren müssen die Durchgängigkeit des PE- 50 Schlauch mit Heparin täglich zu gewährleisten. Zusätzlich kann manchmal die Lage der Läsionsstellen verlegt werden, was zu nicht signifikanten CPSP Symptome. Vor den Injektionen muss die Genauigkeit der Injektionsstellen und Stellen relativ zu Bregma bestätigt werden. Der Winkel und die Volumen jeder Injektion auch genau bestimmt werden muss. Beschränkungen von Gehirnbildern müssen auch berücksichtigt werden. Eine Verspannung des Gehirns Bilder können nach dem Aussetzen der Gehirnscheiben in den Kassetten zu einem Phosphorschirm auftreten. Das Gehirn images benötigen ein Bildanalyseprogramm zu einem Standard-Gehirnatlas normalisiert werden mit möglichen Verzerrungen im Gehirn Bilder zu vermeiden. Darüber hinaus können verschiedene Isotope unterschiedlichen Ergebnissen führen aufgrund ihrer unterschiedlichen Mechanismen und Aktion. Zum Beispiel sind der Metabolit und Wirkungsmechanismus von [18 F] fluordeoxyglukose (FDG) ähnlich Glucose. Daher wurden die [18 F] -FDG Bilder auf den Weg des Glukosestoffwechsels als ähnlich gezeigt. Darüber hinaus ist die Halbwertszeit von [18 F] -FDG kurz; daher muß es mit PET kombiniert werden, um die Bilder zu erzeugen. [201 Tl] ist geeignet für myokardiale Blutfluß Perfusion mit Single-Photon - Emissions - Computertomographie Beurteilung. Daher ist ein geeignetes Isotop Wahl für die Beurteilung der Gehirnbildern wichtig. Die Anwendung der [14 C] -IAP Verfahren Gehirnaktivierung zu bewerten in CPSP ist weniger kostspielig als andere Gehirnkartierungstechniken (beispielsweise PET und fMRI). Ter [14 C] -IAP Methode ist für spontan auftretende Ereignisse geeignet, aber es kann nicht für Brain Mapping in Echtzeit verwendet werden. Das Verfahren unterscheidet sich von anderen Gehirnkartierungstechniken, wie beispielsweise PET und fMRI. Weiterhin kann die vorliegende [14 C] -IAP Protokoll subtile Veränderungen in rCBF in irgendeinem pathologischen Zustand messen. Die [14 C] -IAP Verfahren können herkömmliche Schmerzbahnen, wie der spinothalamic - Darm - Trakt (STT), medialen Thalamus (MT) -ACC und mPFC-Amygdala neuronale Schaltkreise zu testen. Die Aktivierung jeder dieser Wege Auswirkungen die anderen. Die Aktivierung dieser Wege in CPSP wurde in unserer früheren Arbeit beschrieben. 12

Schlaganfall Blutung wurde in mehr als 8% der Patienten auftreten gezeigt , die unter neuropathischen Schmerzen leiden, die als zentrale nach Schlaganfall Schmerz (CPSP). 1-3 CPSP von somatosensorischen Dysfunktion führen kann, wodurch die Induktion Überempfindlichkeits und Allodynie. 4 jedoch bleiben die pathophysiologischen Mechanismen der somatosensorischen Dysfunktion in CPSP unsicher. Beispielsweise führt der Verlust von Körperempfindungen von neuronalen Deafferentation im hämorrhagischen Hirnareals. Hyperalgesie kann durch die Übererregbarkeit des zentralen nozizeptiven Neuronen oder zentrale Enthemmung, 5, 6 , aber die neuronalen Substrate verursacht werden , die in CPSP Symptome beteiligt sind , bleiben unbekannt. Einige Studien haben vorgeschlagen , dass die dorsolateralen präfrontalen Kortex (DPFC), rostralen anterioren cingulären Cortex (ACC), der Amygdala, Hippocampus, periaqueductal grau (PAG), rostral ventromedialen Medulla und ihre Verbindungen miteinander nozizeptiven Verarbeitung vermitteln. 7 Zusätzlichein Schmerzen im Zusammenhang mit der Wahrnehmung beteiligt. 8 Daten über die pathophysiologischen Mechanismen von CPSP sind vielfältig, und die Aktivierung der neuronalen Substrate in CPSP muss eine weitere Prüfung ly wurden medialen präfrontalen Kortex (mPFC) -amygdala Schaltungen gezeigt. [14 C] -Iodoantipyrine (IAP) Aufnahme wird verwendet , indirekt zu beobachten , regionale Hirndurchblutung (rCBF), die eine Beziehung zwischen Gehirnaktivität und CBF übernimmt. Obwohl [14 C] -IAP nicht die Gehirnaktivität in Echtzeit, wie zum Beispiel mit der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRI) beurteilen kann, hat es mehrere Vorteile. Zum Beispiel [14 C] -IAP ist zur Messung von spontan auftretenden Gehirn Ereignisse während pathologischen Zuständen geeignet. 9 Außerdem [14 C] -IAP Aufnahme ohne Anästhesie gemessen wird. Es kostet auch weniger als andere Abbildungsverfahren, einschließlich fMRI und Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Die [14 C] -IAP Verfahren ist vorgeschlagen worden , für measurin geeignet seing spontane Schmerzen (zB CPSP) , die durch Läsionen des ventralen Nucleus basalis (VB) des Thalamus induziert wird. 9 Das vorliegende Protokoll beschreibt , wie die [14 C] -IAP Verfahren auszuführen , um die Beteiligung von neuronalen Substrate CPSP zu bewerten , die durch Läsionen der VB des Thalamus in einem Tiermodell induziert wird. Die Technik bietet eine Möglichkeit, die pathophysiologischen Mechanismen der Bestimmung, dass CPSP Symptome an den Verhaltens- und neuronale Ebenen zugrunde liegen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthetic:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Halocarbon Products Corporation&amp;nbsp;</td><td>NDC 12164-002-25</td><td>4%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homeothermic blanket system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 50&amp;ndash;7079</td><td>body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l micro syringe</td><td>Hamilton</td><td>80008, Model 1701SN</td><td>injected with collagenase</td></tr><tr><td>polyethylene-50 tubing</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427411</td><td>catheterized into external jugular vein</td></tr><tr><td>1 c.c syringe</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SS-01T</td><td>injected with &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C-IAP and saline.</td></tr><tr><td>saline (Sodium Chloride 0.9 gm)</td><td>Taiwan Biotech Co., LTD.</td><td>100-130-0201</td><td>To flush the tube</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>type 4 collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138-500MG</td><td>0.125 U</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1264-250MG</td><td>6 mg/kg</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H9399</td><td>20 U/ml; 0.1 ml/day</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C-iodoantipyrine (IAP)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC712</td><td>125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td>3 M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Behavior system:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>von Frey esthesiometer</td><td>Fabrication Enterprises, Inc.</td><td>Baseline Tactile Monofilaments 12-1666</td><td>mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus</td></tr><tr><td>plantar test apparatus</td><td>IITC Life Science</td><td>IITC 390G Plantar Test</td><td>Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Brain slice:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature compound</td><td>Sakura Fintek Inc</td><td>4583</td><td>embedded the brain</td></tr><tr><td>dry ice</td><td></td><td></td><td>frozen in dry ice/methylbutane (approximately &amp;minus;55 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma</td><td>M32631-1L</td><td>frozen in dry ice/methylbutane (approximately &amp;minus;55 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>&amp;nbsp;Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany</td><td>Leica CM1850</td><td>Coronal brain slice were sectioned on this machine.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Data analyze&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>exposure cassettes with a phosphor screen</td><td>Amersham Biosciences&amp;nbsp;</td><td>20 cm x 25 cm</td><td>The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at &amp;minus;20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter</td><td>To measure the radioactivity count of the filter papers.</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>&amp;nbsp;GMI, Inc.</td><td>WS-S9410</td><td>To read&amp;nbsp; phosphor screen which was exposed by brain slice</td></tr><tr><td>Statistical Parametric Mapping (SPM)</td><td>Wellcome Centre for Neuroimaging</td><td>version 8</td><td>all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td>version 1.46</td><td>Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>version 2009b</td><td>used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.</td></tr><tr><td>Pajek</td><td>http://Pajek.imfm.si/</td><td>version 3.06</td><td>Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.</td></tr></tbody></table>

autoradiographic measurements of [14c]-iodoantipyrine in rat brain following central post-stroke pain

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Although some studies have shown that neuropathic pain may involve the dorsolateral prefrontal cortex, rostral anterior cingulate cortex, amygdala, hippocampus, periaqueductal gray, rostral ventromedial medulla, and medial thalamus, the neural substrates and their connections that mediate CPSP remain unclear. [14C]-Iodoantipyrine (IAP) uptake can be measured to evaluate spontaneously active pain. It can be used to assess the activation of neural substrates that may be involved in CPSP in an animal model. The [14C]-IAP method in rats is less expensive to perform compared with other brain mapping techniques. The present [14C]-IAP protocol is used to measure the activation of neural substrates that are involved in CPSP that is induced by lesions of the ventral basal nucleus (VB) of the thalamus in a rodent model.

1A zeigt die experimentelle Zeitleiste. Die Ratten wurden auf den Schein und CPSP Gruppen für die Verhaltenstests (dh von Frey - Test und Plantar - Test) zugeordnet. Am ersten Tag des Experiments diente als Basislinie, und Tests in den Wochen wurden wiederholt, 1 - 5 PE-50-Katheterisierung wurde die Vena jugularis externa in Woche 4 durchgeführt Heparin (20 U / ml, 0,1 ml / Tag) während injiziert wurde Woche 4 und 5 Fünf Minuten nach der Heparin - Injektion, [14 C] -IAP injiziert wurde, gefolgt 10 Sekunden später durch eine Überdosis des Anästhetikums für Opfer. Eine Minute später wurden die Ratten enthauptet und OCT eingebettet Gehirnscheiben wurden hergestellt. 1B zeigt die Ratten in einem chirurgischen stereotaxische Gerät, Kanüle Implantationsstellen und histologische Karte der Hirnschnitten basierend auf einem Rattenhirnatlas. 1C zeigt das rechte Loch der äußeren Jugularvene in rot, die Lage des PE- 50 Schläuche undletzte Versuchsaufbau. 2A zeigt Gehirnschnitte , die in den Kassetten ausgesetzt waren. Der Phosphorschirm wurde mit einem variablen Modus Imager analysiert. Proben- und Standarddaten für die Gehirnscheiben wurden dann analysiert. 2B zeigt die Standard Autoradiographiebild Kurven. Die linke Tafel zeigt die Beziehung zwischen der Bildintensität (Pixel / mm 2) und die Radioaktivität Counts pro Minute (CPM), wodurch die folgenden vorhergesagten lineare Gleichung ergibt: Y = 44.542X + 196,24. Das rechte Bild zeigt , dass die Auflösung (Pixel / mm 2) wurde als die Belichtungszeit (in Tagen) erhöht verbessert. Die optimale Auflösung wurde am Tag 4 beobachtet. 3A zeigt den Versuchsaufbau für die Fußsohlen Test, der thermischen Schmerz beurteilt. Die CPSP Gruppe zeigte eine signifikante Abnahme der Pfotenrückzugsschwelle <em&gt; (dh weniger Hitzetoleranz) im Vergleich mit der Sham - Gruppe zu Beginn der Studie und Wochen . 1 - 5 (alle p &lt;0,05) 3B zeigt den Versuchsaufbau für die von Frey - Test, der mechanische Schmerz beurteilt. Die CPSP Gruppe zeigte eine signifikante Abnahme der mechanischen Kraft (gw) zu Beginn der Studie und Wochen 1 bis 5 (alle p &lt;0,05). 4A zeigt die ROIs in einem anatomischen Atlas. Die ROI - Analyse zeigte , dass die Aktivierung des infralimbischen Kortex (IL), prälimbischen Kortex (PRL) und cingulären Cortex - Bereich 1 (Cg1) war signifikant höher in der CPSP Gruppe in der rechten Hemisphäre, mit Ausnahme der VB (4B) . Die Unterschiede in der interregionalen Korrelationen von rCBF wurden zwischen den CPSP und Scheingruppen in der rechten Hemisphäre (4C) beobachtet. Die Matrix (Fishers Z-statistics) von allen Regionen analysiert Pearson Korrelation verwendet wird . 4C zeigt Unterschiede in der interregionalen Korrelationen der Beteiligung von neuronalen Substrate in der CPSP Gruppe. Schmerzen im Zusammenhang mit neuronalen Substrate wurden durch die Analyse von Unterschieden in der interregionalen Korrelationen von rCBF bestimmt. Die roten Linien in 4D zeigen signifikante positive Korrelationen und blauen Linien zeigen signifikante negative Korrelationen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig1.jpg" /> Abbildung 1. Experimentelle Chronologie der Läsion der ventralen Basal Nucleus (VB) der Thalamus Central Post-Stroke Pain (CPSP) und Einspeisen zu induzieren [14 C] -IAP. (A) Ventral Basalganglien Läsionen CPSP für die Verhaltensabschätzungen und Injektionen von [14 C] -IAP zu induzieren die Aktivierung von neuralen Substrate zu messen , die in CPSP beteiligt sindLage von VB. (B). (C) [14 C] -IAP Injektionen. Maßstabsbalken = 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig2.jpg" /> Abbildung 2. Standard Autoradiographie Kurven. (A) Probe und Standardkurven wurden für verschiedene Belichtungszeiten und Bildauflösungen erhalten. (B) Standardkurve der Bildintensität und CPM und Standardkurve von Belichtungszeit und Auflösung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um ein</a> , <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig2large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern Version dieser Figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig3.jpg" /> Fi5. (A) CPSP Ratten zeigten eine geringere Pfotenrückzugsschwelle im Plantar - Test (- Abbildung 3. Die Plantar - Test (Thermal Pain) und von Frey - Test (mechanische Schmerz) wurden in den Sham und CPSP Gruppen zu Beginn der Studie und Wochen 1 Dirigiert dh weniger Hitzetoleranz) , verglichen mit sham - Ratten, was darauf hinweist größere thermische Schmerzen. (B) CPSP Ratten zeigten eine geringere Pfotenrückzugsschwelle im Test von Frey im Vergleich zu sham - Ratten, was darauf hinweist größere mechanische Schmerzen. SEM, Standardfehler des Mittelwerts. Grüne Sternchen (*) zeigen einen signifikanten Unterschied mit der Sham - Gruppe verglichen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig4.jpg" /> Abbildung 4. ROI - Analyse und Beziehung zwischen Inter-REGIONALE Korrelationen zwischen Neural beteiligten Substrate in CPSP. (A) Hirnbereiche wurden durch das Verhältnis Formulierung bestimmt und analysiert. (B) Die ROIs in der IL, PrL, Cg1 und VB in der rechten Hemisphäre signifikant verschieden waren. (C) Analyse von rCBF in den ausgewählten Bereichen des Gehirns. (D) interregionale Korrelationen zwischen Hirnarealen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain at JoVE.com

Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

We present a protocol to measure [14C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Autoradiographiebild Messungen von [<sup&gt; 14</sup&gt; C] -Iodoantipyrine in Rattengehirn Nach Central Post-Stroke Schmerz

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to ...

autoradiographic-measurements-14c-iodoantipyrine-rat-brain-following

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

8.7K Aufrufe.  Fo Guang University. We present a protocol to measure [14C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Serie: Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Forschung

Medizin

A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats

Post-stroke depression (PSD) is the most recurrent of all psychiatric complications resulting from an ischemic stroke. A greater majority (about 60%) of all ischemic stroke patients suffer from PSD, a disorder considered to be an ischemic stroke-related precursor for increased death and degradation in health. The pathophysiology of PSD is still obscure. To study the mechanism of development and occurrence of PSD further, and to find out a therapy, we attempted to develop a new protocol that requires occluding the middle cerebral artery (MCA) via the internal carotid artery (ICA) in rats. This protocol describes a model of PSD induced in rats through the middle cerebral artery occlusion (MCAO). Also used in the experiment are the Porsolt forced swim test and the sucrose preference test to confirm and evaluate the depressive mood of the rats under investigation. Rather than inserting the catheter through the external carotid artery (ECA), as stipulated for the original procedure, this MCAO technique has the monofilament passing directly through the ICA. This MCAO technique was developed a few years ago and leads to a reduction in mortality and variability. It is generally accepted that the criteria used are preferred in the selection of biological models. The data obtained with this protocol show that this model of MCAO could be a way of inducing PSD in rats and could potentially lead to the understanding of the pathophysiology and the future development of new drugs and other neuroprotective agents.

Here we present a protocol to induce post-stroke depression in rats by occluding the middle cerebral artery via the internal carotid artery. We use the Porsolt forced swim test and the sucrose preference test to confirm and evaluate induced depressive moods.

Eine mittelzerebrale Arterienokklusionstechnik zur induzierung einer Depression im Raten nach dem Schlaganfall

Post-stroke depression (PSD) is the most recurrent of all psychiatric complications resulting from an ischemic stroke. A greater majority (about 60%) of ...

Verhalten

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Neurowissenschaften

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biochemie

Non-invasive Imaging and Analysis of Cerebral Ischemia in Living Rats Using Positron Emission Tomography with 18F-FDG

Stroke is the third leading cause of death among Americans 65 years of age or older1. The quality of life for patients who suffer from a stroke fails to return to normal in a large majority of patients2, which is mainly due to current lack of clinical treatment for acute stroke. This necessitates understanding the physiological effects of cerebral ischemia on brain tissue over time and is a major area of active research. Towards this end, experimental progress has been made using rats as a preclinical model for stroke, particularly, using non-invasive methods such as 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) coupled with Positron Emission Tomography (PET) imaging3,10,17. Here we present a strategy for inducing cerebral ischemia in rats by middle cerebral artery occlusion (MCAO) that mimics focal cerebral ischemia in humans, and imaging its effects over 24 hr using FDG-PET coupled with X-ray computed tomography (CT) with an Albira PET-CT instrument. A VOI template atlas was subsequently fused to the cerebral rat data to enable a unbiased analysis of the brain and its sub-regions4. In addition, a method for 3D visualization of the FDG-PET-CT time course is presented. In summary, we present a detailed protocol for initiating, quantifying, and visualizing an induced ischemic stroke event in a living Sprague-Dawley rat in three dimensions using FDG-PET.

Non-invasive Imaging and Analysis of Cerebral Ischemia in Living Rats Using Positron Emission Tomography with 18F-FDG

Brain damage resulting from cerebral ischemia may be non-invasively imaged and studied in rats using pre-clinical positron emission tomography coupled with the injectable radioactive probe, 18F-fluorodeoxyglucose. Further, the use of modern software tools that include volume of interest (VOI) brain templates dramatically increase the quantitative information gleaned from these studies.

Nicht-invasive Bildgebung und Analyse der zerebralen Ischämie in lebenden Ratten mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie mit<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG

Stroke is the third leading cause of death among Americans 65 years of age or older1. The quality of life for patients who suffer from a stroke fails to ...

Intracranial Pharmacotherapy and Pain Assays in Rodents

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the development of effective therapeutics. Intracranial pharmacology presents an important tool for understanding the molecular and cellular mechanisms of pain in the brain, as well as for novel treatments. Here we present a protocol that integrates intracranial pharmacology with pain behavior testing. Specifically, we show how to infuse analgesic drugs into a select brain region, which may be responsible for pain modulation. Furthermore, to determine the effect of the candidate drug in the central nerve system, pain assays are performed after intracranial treatment. Our results demonstrate that intracranial administration of analgesic drugs in a targeted region can provide relief of pain in rodents. Thus, our protocol successfully demonstrates that intracranial pharmacology, combined with pain behavior testing, can be a powerful tool for the study of pain mechanisms in the brain.

Here we present a protocol to perform intracranial pharmacological experiments followed by pain behavior assays in rodents. This protocol allows researchers to deliver molecular and cellular targets in the brain, for pharmacologic agents in the treatment of pain.

Intrakranielle Pharmakotherapie und Schmerz-Assays bei Nagern

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Neuroinflammation is central to the pathological cascade following ischemic stroke. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide critical insights into the temporal dynamics and role of certain neuroimmune interactions in stroke. Specifically, Positron Emission Tomography (PET) imaging of translocator protein 18 kDa (TSPO), a marker of activated microglia and peripheral myeloid-lineage cells, provides a means to detect and track neuroinflammation in vivo. Here, we present a method to accurately quantify neuroinflammation using [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C]DPA-713), a promising second generation TSPO-PET radiotracer, in distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) compared to sham-operated mice. MRI was performed 2 days post-dMCAO surgery to confirm stroke and define the infarct location and volume. PET/Computed Tomography (CT) imaging was carried out 6 days post-dMCAO to capture the peak increase in TSPO levels following stroke. Quantitation of PET images was conducted to assess the uptake of [11C]DPA-713 in the brain and spleen of dMCAO and sham mice to assess central and peripheral levels of inflammation. In vivo [11C]DPA-713 brain uptake was confirmed using ex vivo autoradiography.

PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Positron Emission Tomography (PET) imaging of translocator protein 18 kDa (TSPO) provides a non-invasive means to visualize the dynamic role of neuroinflammation in the development and progression of brain diseases. This protocol describes TSPO-PET and ex vivo autoradiography to detect neuroinflammation in a mouse model of ischemic stroke.

PET-Bildgebung des Neuroinflammation mit [11C] DPA-713 in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls

Neuroinflammation is central to the pathological cascade following ischemic stroke. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Autoradiographiebild Messungen von [

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video