O presente estudo foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência para Dr. Bai-Chuang Shyu (NSC 99-2320-B-001-016-MY3, NSC 100-2311-B-001-003-MY3 e NSC 102-2320- B-001-026-MY3). Este trabalho foi realizado no Instituto de Ciências Biomédicas, que receberam financiamento da Academia Sinica.

O protocolo do presente estudo recebeu a aprovação da Academia Sinica Institutional Animal Care e do Comitê de utilização em Taiwan. 1. Preparações Animais <ol><li> Obter ratos Sprague-Dawley machos (cerca de 300-400 g). Manter os ratos em um quarto com ar condicionado (21 - 22 ° C, 50% de umidade), sob a 12 luz hr / ciclo de 12 hr / escuro (luzes acesas às 08:00) com livre acesso a comida e água. </li></ol> 2. Procedimento Experimental <ol><li> Permitir que todos os ratos para se adaptar ao ambiente nas suas gaiolas durante 1 semana antes das experiências. Durante a adaptação, realizar os testes plantares von Frey e estabelecer linhas de base. </li><li> von Teste Frey <ol><li> Coloque o rato em um gabinete de acrílico (30 centímetros x 30 centímetros x 80 cm) por 30 min para habitação. </li><li> Se obter filamentos de von Frey (filamento 11 -. 20) que têm o mesmo comprimento mas variando diâmetros para proporcionar um intervalode forças de 2-100 g. </li><li> Para avaliar o limiar de retirada da pata na pata traseira do rato, usar filamentos de von Frey para estimular o centro das patas traseiras por meio de uma porta do tipo rede na placa acrílica em intervalos entre tentativas 5 min. Para gravar a pressão máxima aplicada, use os filamentos em ordem crescente, de baixo para cima, até que a pressão máxima aplicada é gravado. 10 </li><li> Quando os ratos apresentam uma resposta de retirada da pata ao estímulo, registrar o número de filamentos. Determinar a resposta de retirada neste ensaio de acordo com o menor estímulo. </li><li> Repetir o mesmo procedimento imediatamente, para um total de três vezes em sucessão no mesmo rato. Converter o número de filamentos na força correspondente (em gramas) e a média dos valores. </li></ol></li><li> teste plantar <ol><li> Colocar o rato dentro de uma caixa de acrílico transparente (dividida em quatro quadros, 80 cm de × 30 cm × 15 cm) durante 30 min para a habitação. </li><li> Use um infrared feixe para estimular o centro da pata traseira por meio de uma placa de vidro. Ajuste a intensidade da luz infravermelha para obter uma latência média de resposta de retirada da pata de aproximadamente 10 seg. Conduzir um teste pressionando uma chave que liga a fonte de luz infravermelha e inicia um temporizador de estado sólido digital. Manipular a duração do feixe de luz infravermelha. </li><li> Grave a duração da luz infravermelha, quando os ratos exibem uma resposta de retirada da pata. A maior duração não deve exceder 20 s em cada ensaio, para evitar danos nos tecidos. Use um intervalo entre tentativas de pelo menos 5 minutos para evitar a estimulação sucessiva. </li><li> Repita o teste com três ensaios para as patas traseiras esquerda e direita, e calcular a média para cada pata traseira para cada rato. </li></ol></li><li> Cirurgia colagenase Lesão <ol><li> Anestesiar o rato com 4% de isoflurano até a perda da resposta toe-pitada e respostas somáticas a ocorrer estímulos cirúrgicos. Manter a anestesia com 1,5 - 2% isoflurane para a duração da cirurgia. </li><li> Colocar o rato num dispositivo estereotáxico com um simples almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 36,5-37,5 ° C. Aplique o creme de olho nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Raspar a pele com cortador elétrico esterilizados, e fazer uma incisão lisa (cerca de 2-2,5 cm) com um bisturi ao longo da linha média do couro cabeludo. Limpe a pele e do crânio com a alternância de iodo providência e solução de álcool 75% para desinfecção. Durante a fase cirúrgica, use% de álcool 75 para esterilizar todos os dispositivos, ferramentas, e a bancada para manter condições estéreis. Antes disso, todos os materiais cirúrgicos devem ser esterilizados em autoclave a vapor. </li><li> Use as luvas e instrumentos esterilizados, e faça um pequeno furo (3 mm de diâmetro) no crânio com uma broca elétrica sobre o VB (incluindo núcleo ventral póstero-medial do tálamo [VPM] e ventral núcleo talâmico póstero [VPL]) do tálamo (3,0 -3,5 mm posterior, 3,0-3,5 mm lateralem relação ao bregma, e 5,5-5,8 mm de profundidade a partir da superfície do crânio). </li><li> Microinject 0,5 mL de solução salina normal ou 0.125 U do tipo 4 solução de colagenase no controle e grupos experimentais, respectivamente. </li><li> Manter a agulha de injecção no lugar durante mais 5 minutos para permitir a difusão da droga. </li><li> Use cimento dental para encher o orifício no crânio, e sutura da incisão. Após a sutura da incisão, aplicam-se os anestésicos analgésicos locais (lidocaína pomada) sobre a ferida, e devolvê-los às suas gaiolas. </li><li> Após a cirurgia, isoladamente abrigar os ratos em gaiolas de plástico até que eles manter decúbito esternal, e mantém quente até recuperado da anestesia. </li></ol></li><li> Testes comportamentais após a recuperação cirúrgica <ol><li> Após 7 dias de recuperação da cirurgia, repita os procedimentos nas seções 2.2 e 2.3 para a fase de teste. Realizar os testes comportamentais ao longo de 4 semanas, enquanto monitora a saúde e estado de desenvolvimento dos animais. </li><li&gt; Monitorar as condições de saúde dos animais (por exemplo, o peso corporal, a quantidade de alimentação, e livre circulação) entre os grupos controle e experimental para a fase pós-cirurgia. </li></ol></li><li> Execute cânula Implantação com PE-50 Tubing <ol><li> Anestesiar ratos com 4% de isoflurano, e manter a temperatura corporal a 36,5-37,5 ° C com uma almofada de aquecimento simples. </li><li> Com um bisturi, cortar dois furos (2 cm de diâmetro cada) na linha média da parte dorsal dos membros anteriores e a intersecção da parte ventral do ombro esquerdo e cavidade torácica, respectivamente. </li><li> Dissociar a pele e o músculo com um par de tesouras entre os dois orifícios. </li><li> Conectar uma extremidade de tubagem PE-50 (20 cm de comprimento) para a veia jugular externa através do orifício ventral. Ligar a extremidade terminal da mesma tubagem PE-50 para o furo dorsal, e apor à pele. </li><li> Utilize uma seringa para injectar solução salina na veia jugular para verificar que a tubagem PE- 50não está obstruído. </li><li> Suturar a incisão, e injetar os ratos com 6 mg / kg de gentamicina (via intraperitoneal). </li><li> Lave a tubagem a cada dois dias após a cirurgia com 0,3 ml de solução salina a 0,9%, seguido por 0,1 ml de soro fisiológico com 20 U / ml de heparina. </li></ol></li><li> Teste Comportamental final <ol><li> Uma semana após o passo 2.6, repita os passos de 2,2-2,3 para confirmar que o comportamento é estável em comparação com o passo 2.5 após a recuperação cirúrgica. </li></ol></li><li> de injeção <ol><li> Coloque o rato em uma gaiola de descanso para 5 - 10 min para a adaptação. </li><li> Usando um splitter, conecte PE- 50 tubulação para duas seringas de 1 ml. Encher uma seringa com solução salina normal e encher o outro com [14 C] -IAP solução (125 uCi / kg num volume de 0,3 - 0,5 mL). </li><li> Injectar o radiofármaco na veia jugular externa, e substituir a seringa com uma outra seringa cheia com cloreto de 3 M de potássio. </li><li> Dez segundos após a inj radiofármacoexão, injetar cloreto de 3 M de potássio sob uma overdose de isoflurano e sacrificar os animais de acordo com métodos de eutanásia padrão (ou seja, isoflurano a partir de um vaporizador por 50 min) com base nas diretrizes da Academia Sinica Institutional Animal Care e do Comitê de utilização em Taiwan. </li><li> Após 1 min, expor o crânio, e retire o músculo remanescente. Usando fórceps, descascar a superfície dorsal do crânio do cérebro. Aparar os lados do crânio utilizando fórceps. Em seguida, usando uma espátula, cortar os bulbos olfativos e ligações nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro, e remover o cérebro. </li><li> Use composto óptima temperatura de corte (OCT) para congelar o cérebro em gelo seco e metilbutano (aproximadamente -55 ° C). Armazenar o tecido cerebral em um congelador. 11, 12 </li></ol></li><li> Cortando o cérebro <ol><li> Orientar o tecido num micrótomo, com o cérebro posterior virado para baixo. Use um criostato para cortar o cérebro em 20 &amp;# 181; seções m de espessura. </li><li> Coloque as fatias de cérebro em lâminas de microscópio num criostato a -20 ° C, com um intervalo de 240 um entre cada fatia. </li><li> Coloque as lâminas de microscópio e cinco papéis de filtro padrão com radioatividade classificados em cassetes de exposição durante 3 dias a -20 ° C. De acordo com a sequência das fatias de cérebro, providenciar as lâminas de microscópio de cima para baixo. Finalmente, colocar os papéis de filtro na parte inferior das cassetes. 12 </li><li> Remover tela de fósforo a partir das cassetes de exposição, e use um gerador de imagens de modo variável a ler o ecrã de fósforo e gerar imagens para mostrar [14 C] absorção -IAP para as fatias de cérebro. </li></ol></li></ol> Análise 3. Dados <ol><li> Após o passo 2.9.4, ajustar as imagens utilizando o Statistical Parametric Mapping (SPM) e software ImageJ. Reconstruir todas as imagens usando cortes coronais em série. Suave e normalizar as imagens de acordo com um modelo de cérebro de rato de referência.12, 13 </li><li> Para avaliações quantitativas, medir a região de interesse (ROI) das imagens do cérebro usando software ImageJ para determinar a intensidade do sinal pixel, e usar software estatístico para a análise. 12, 13 </li><li> Para investigar as conexões entre diferentes núcleos cerebrais, use MATLAB software de análise de correlação para exibir relação radioatividade em uma matriz de correlação inter-regional, e visualizar as matrizes como mapas de cores. Finalmente, use software Pajek para análise de rede. 12, 13 </li><li> Use 2 × 5 bidireccional análise mista de variância (ANOVA), com o grupo e semanas como factores, para comparar a duração da tolerância ao calor no teste plantar e força mecânica no teste de von Frey nos grupos de placebo e CPSP na linha de base e semana 1 - 5. Use a 2 × 31 two-way ANOVA para medir a taxa de radioatividade acordo com o grupo e área do cérebro. Quando adequado, a realizar Diferença Honestamente significativa de Tukey (HSD) Testes post hoc. Calcorrelação cular Pearson coeficientes para avaliar correlações entre todas as áreas do cérebro selecionados na farsa e grupos CPSP. </li></ol>

<ol>
	<li>Finnerup, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+central+neuropathic+pain+states.">A review of central neuropathic pain states.</a> Curr Opin Anaesthesiol. 21 (5), 586-589 (2008).</li><li>Andersen, G., Vestergaard, K., Ingeman-Nielsen, M., Jensen, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+central+post-stroke+pain.">Incidence of central post-stroke pain.</a> Pain. 61 (2), 187-193 (1995).</li><li>Chen, B., Stitik, T. P., Foye, P. M., Nadler, S. F., DeLisa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+post-stroke+pain+syndrome:+yet+another+use+for+gabapentin?.">Central post-stroke pain syndrome: yet another use for gabapentin?.</a> Am J Phys Med Rehabil. 81 (9), 718-720 (2002).</li><li>Greenspan, J. D., Ohara, S., Sarlani, E., Lenz, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allodynia+in+patients+with+post-stroke+central+pain+(CPSP)+studied+by+statistical+quantitative+sensory+testing+within+individuals.">Allodynia in patients with post-stroke central pain (CPSP) studied by statistical quantitative sensory testing within individuals.</a> Pain. 109 (3), 357-366 (2004).</li><li>Klit, H., Finnerup, N. B., Jensen, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+post-stroke+pain:+clinical+characteristics,+pathophysiology,+and+management.">Central post-stroke pain: clinical characteristics, pathophysiology, and management.</a> Lancet Neurol. 8 (9), 857-868 (2009).</li><li>Kumar, G., Soni, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+post-stroke+pain:+current+evidence.">Central post-stroke pain: current evidence.</a> J Neurol Sci. 284 (1-2), 10-17 (2009).</li><li>Denk, F., McMahon, S. B., Tracey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+vulnerability:+a+neurobiological+perspective.">Pain vulnerability: a neurobiological perspective.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 192-200 (2014).</li><li>Ji, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+impairment+in+pain+through+amygdala-driven+prefrontal+cortical+deactivation.">Cognitive impairment in pain through amygdala-driven prefrontal cortical deactivation.</a> J Neurosci. 30 (15), 5451-5464 (2010).</li><li>Jungehulsing, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levetiracetam+in+patients+with+central+neuropathic+post-stroke+pain:+a+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Levetiracetam in patients with central neuropathic post-stroke pain: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Eur J Neurol. 20 (2), 331-337 (2013).</li><li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw.">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J Neurosci Methods. 53, 55-63 (1994).</li><li>Jay, T. M., Luciqnani, G., Crane, A. M., Jehle, J., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+blood+flow+with+[14C]iodoantipyrine+in+the+mouse.">Measurement of local cerebral blood flow with [14C]iodoantipyrine in the mouse.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 8 (1), 121-129 (1988).</li><li>Lu, H. C., Chang, W. J., Kuan, Y. H., Huang, A. C., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+[14C]iodoantipyrine+study+of+inter-regional+correlations+of+neural+substrates+following+central+post-stroke+pain+in+rats.">A [14C]iodoantipyrine study of inter-regional correlations of neural substrates following central post-stroke pain in rats.</a> Mol Pain. 11 (1), (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+brain+activation+during+retrieval+of+visceral+pain-conditioned+passive+avoidance+in+the+rat.">Functional brain activation during retrieval of visceral pain-conditioned passive avoidance in the rat.</a> Pain. 152, 2746-2756 (2011).</li><li>Wasserman, J. K., Koeberle, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+hemorrhagic+rat+model+of+central+post-stroke+pain.">Development and characterization of a hemorrhagic rat model of central post-stroke pain.</a> Neuroscience. 161 (1), 173-183 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Nos testes comportamentais, o grupo CPSP exibiram reduções do limiar de retirada da pata no teste de dor térmica e força mecânica no teste de von Frey no início do estudo e semanas 1 - 5. Os resultados foram consistentes com um estudo anterior 14. O [C 14] -IAP método baseia-se na intensidade de pixel de imagens do cérebro para a análise quantitativa de diferentes fatias de cérebro. Para avaliar os dados das imagens do cérebro, a intensidade do sinal de pixel foi definido. No presente estudo, o sinal de fundo ambiental foi definida como 25,811-46,979 CPM. O sinal de [14 C] -IAP 0,001 uCi papel de filtro foi definida como 42 CPM. A intensidade do sinal de pixel foi &lt;0,001 uCi, que serve como a intensidade do fundo. A intensidade de pixel de cinco filtros de papel foi determinado para 0,001, 0,01, 0,1, e 10 uCi, servindo como a escala de cinzentos do pixel para cada uma das imagens do cérebro. [14 C] radioactividade -IAP mostrou apcorrelação ositive com intensidade de pixel e contagem de radioatividade em uma escala logarítmica. Portanto, o procedimento acima pode ser seguido para a calibração de [14 C] radioactividade -IAP para o pixel intensidade. Ao realizar a [14 C] -IAP protocolo experimental, alguns pontos precisam de ser consideradas. Por exemplo, a veia jugular externa pode tornar-se bloqueado, e experimentadores precisa garantir a desobstrução da tubulação PE- 50 com heparina a cada dia. Além disso, a localização dos locais da lesão pode, por vezes, ser deslocado, resultando em sintomas CPSP não significativas. Antes das injecções, a precisão dos locais de injecção e localizações relativas a Bregma deve ser confirmada. O ângulo e volume de cada injecção também deve ser determinado com precisão. Limitações de imagens do cérebro também precisa ser considerado. Distorções das imagens cerebrais pode ocorrer depois de expor fatias de cérebro nas cassetes para uma tela de fósforo. O cérebro images precisa ser normalizada para um atlas padrão cerebrais usando um programa de análise de imagem para evitar potenciais distorções nas imagens cerebrais. Além disso, diferentes isótopos podem produzir resultados diferentes devido aos seus diferentes mecanismos e ação. Por exemplo, o metabolito e o mecanismo de acção de [18F] -fludeoxyglucose (FDG) são semelhantes à glucose. Portanto, a [18F] -FDG imagens mostraram ser semelhante ao da via do metabolismo da glucose. Além disso, a meia-vida de [18F] -FDG é curto; Por isso, deve ser combinado com PET para gerar as imagens. [201 Tl] é adequado para avaliação da perfusão do fluxo sanguíneo do miocárdio por meio de tomografia computadorizada por emissão de fóton único. Portanto, escolher um isótopo adequado para avaliar imagens do cérebro é importante. A aplicação do [14 C] -IAP método para avaliar a ativação do cérebro em CPSP é menos onerosa do que outras técnicas de mapeamento cerebral (por exemplo, PET e fMRI). Tele [14 C] -IAP método é adequado para eventos que ocorrem espontaneamente, mas não pode ser utilizada para o mapeamento do cérebro em tempo real. O método é diferente de outras técnicas de mapeamento do cérebro, tais como PET e ressonância magnética. Além disso, o presente protocolo -IAP [14 C] pode medir mudanças sutis na FSCr em qualquer condição patológica. O [C 14] -IAP método pode ser usado para testar vias de dor convencionais, tais como o tracto spinothalamic (STT), -ACC tálamo medial (MT), e circuitos neurais CPFm-amígdala. A activação de cada uma destas vias impactos os outros. A ativação destas vias em CPSP foi detalhado em nosso artigo anterior 12.

Hemorragia acidente vascular cerebral foi demonstrado que ocorrem em mais do que 8% de pacientes que sofrem de dor neuropática, a que se refere dor pós-derrame como central (CPSP). 1-3 CPSP pode resultar de disfunção somatossensorial, induzindo, assim, a hipersensibilidade e a alodinia. 4 Contudo , os mecanismos fisiopatológicos da disfunção somatossensorial em CPSP permanecem incertas. Por exemplo, a perda de sensações somáticas resulta de desaferentação neuronal na área do cérebro hemorrágico. A hiperalgesia pode ser causada pela hiper-excitabilidade de neurónios nociceptivos centrais ou desinibição Central, 5, 6, mas os substratos neurais que estão envolvidos nos sintomas de CPSP permanecem desconhecidos. Alguns estudos sugeriram que o córtex pré-frontal dorsolateral (CPFD), rostral do córtex cingulado anterior (ACC), a amígdala, o hipocampo, substância cinzenta periaquedutal (PAG), medula ventromedial rostral, e suas conexões com o outro mediar processamento nociceptivo. 7 adicionaiscircuitos -amygdala ly, medial córtex pré-frontal (mPFC) foram mostrado para ser envolvido na percepção relacionados com a dor. 8 Os dados sobre os mecanismos fisiopatológicos da CPSP são diversas, ea ativação de substratos neurais no CPSP precisa de uma análise mais aprofundada. [14 C] -Iodoantipyrine captação (IAP) é usado para observar indirectamente o fluxo sanguíneo cerebral regional (FSCr), assumindo uma relação entre a atividade cerebral e CBF. Apesar de [14 C] -IAP não permite avaliar a actividade cerebral em tempo real, tal como acontece com a ressonância magnética (IRMf), tem várias vantagens. Por exemplo, [14 C] -IAP é adequado para a medição que ocorre espontaneamente eventos cerebrais durante estados patológicos. 9 Além disso, a [14 C] -IAP absorção é medida sem anestesia. Ele também custa menos do que outros métodos de imagem, incluindo fMRI e tomografia por emissão de positrões (PET). O [C 14] -IAP método tem sido sugerido para ser apropriado para measuring dor espontânea (p.ex., CPSP) que é induzido pelas lesões do núcleo basal ventral (VB) do tálamo. 9 O presente protocolo descreve como realizar a [14 C] -IAP método para avaliar o envolvimento de substratos neurais de CPSP que é induzido pelas lesões da VB do tálamo em um modelo animal. A técnica oferece uma maneira de determinar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes a sintomas CPSP nos níveis comportamentais e neuronais.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthetic:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Halocarbon Products Corporation&amp;nbsp;</td><td>NDC 12164-002-25</td><td>4%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homeothermic blanket system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 50&amp;ndash;7079</td><td>body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l micro syringe</td><td>Hamilton</td><td>80008, Model 1701SN</td><td>injected with collagenase</td></tr><tr><td>polyethylene-50 tubing</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427411</td><td>catheterized into external jugular vein</td></tr><tr><td>1 c.c syringe</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SS-01T</td><td>injected with &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C-IAP and saline.</td></tr><tr><td>saline (Sodium Chloride 0.9 gm)</td><td>Taiwan Biotech Co., LTD.</td><td>100-130-0201</td><td>To flush the tube</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>type 4 collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138-500MG</td><td>0.125 U</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1264-250MG</td><td>6 mg/kg</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H9399</td><td>20 U/ml; 0.1 ml/day</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C-iodoantipyrine (IAP)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC712</td><td>125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td>3 M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Behavior system:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>von Frey esthesiometer</td><td>Fabrication Enterprises, Inc.</td><td>Baseline Tactile Monofilaments 12-1666</td><td>mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus</td></tr><tr><td>plantar test apparatus</td><td>IITC Life Science</td><td>IITC 390G Plantar Test</td><td>Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Brain slice:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature compound</td><td>Sakura Fintek Inc</td><td>4583</td><td>embedded the brain</td></tr><tr><td>dry ice</td><td></td><td></td><td>frozen in dry ice/methylbutane (approximately &amp;minus;55 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma</td><td>M32631-1L</td><td>frozen in dry ice/methylbutane (approximately &amp;minus;55 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>&amp;nbsp;Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany</td><td>Leica CM1850</td><td>Coronal brain slice were sectioned on this machine.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Data analyze&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>exposure cassettes with a phosphor screen</td><td>Amersham Biosciences&amp;nbsp;</td><td>20 cm x 25 cm</td><td>The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at &amp;minus;20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter</td><td>To measure the radioactivity count of the filter papers.</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>&amp;nbsp;GMI, Inc.</td><td>WS-S9410</td><td>To read&amp;nbsp; phosphor screen which was exposed by brain slice</td></tr><tr><td>Statistical Parametric Mapping (SPM)</td><td>Wellcome Centre for Neuroimaging</td><td>version 8</td><td>all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td>version 1.46</td><td>Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>version 2009b</td><td>used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.</td></tr><tr><td>Pajek</td><td>http://Pajek.imfm.si/</td><td>version 3.06</td><td>Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.</td></tr></tbody></table>

autoradiographic measurements of [14c]-iodoantipyrine in rat brain following central post-stroke pain

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Although some studies have shown that neuropathic pain may involve the dorsolateral prefrontal cortex, rostral anterior cingulate cortex, amygdala, hippocampus, periaqueductal gray, rostral ventromedial medulla, and medial thalamus, the neural substrates and their connections that mediate CPSP remain unclear. [14C]-Iodoantipyrine (IAP) uptake can be measured to evaluate spontaneously active pain. It can be used to assess the activation of neural substrates that may be involved in CPSP in an animal model. The [14C]-IAP method in rats is less expensive to perform compared with other brain mapping techniques. The present [14C]-IAP protocol is used to measure the activation of neural substrates that are involved in CPSP that is induced by lesions of the ventral basal nucleus (VB) of the thalamus in a rodent model.

A Figura 1A mostra a linha do tempo experimental. Os ratos foram atribuídos ao simulada e grupos CPSP para os testes comportamentais (isto é, teste de teste plantar e von Frey). O primeiro dia da experiência serviu como linha de base, e os testes foram repetidos nas semanas 1 - 5. PE-50 cateterização foi realizada na veia jugular externa na semana 4. A heparina (20 U / ml, 0,1 ml / dia) foi injectada durante semanas 4 e 5. Cinco minutos após a injeção de heparina, [14 C] -IAP foi injetado, seguido de 10 segundos mais tarde, por uma overdose de anestésico para o sacrifício. Um minuto mais tarde, os ratos foram decapitados, e fatias de cérebro de outubro-incorporados foram feitas. A Figura 1B representa os ratos num dispositivo cirúrgico estereotáxico, locais de implantação de cânula, e mapa histológica das fatias de cérebro com base em um rato Atlas Cerebral. A Figura 1C mostra o furo direito da veia jugular externa em vermelho, o local da tubagem PE- 50, econfiguração experimental final. A Figura 2A mostra que fatias de cérebro foram expostas nas cassetes. A tela de fósforo foi analisada utilizando um gerador de imagens de modo variável. Amostra e os dados normalizados para as fatias de cérebro foram então analisadas. A Figura 2B mostra as curvas autorradiográficas convencionais. O painel da esquerda mostra a relação entre a intensidade da imagem (pixel / mm 2) e as contagens de radioactividade por minuto (cpm), obtendo-se assim a seguinte equação linear previu: Y = 44.542X + 196,24. O painel da direita mostra que a resolução (pixel / mm 2) foi reforçada como o aumento do tempo de exposição (em dias). Observou-se a resolução ideal no dia 4. A Figura 3A mostra a instalação experimental para o teste plantar, que avalia a dor térmica. O grupo CPSP exibiu uma diminuição significativa no limiar de retirada da pata <em&gt; (isto é, menos tolerância ao calor) em comparação com o grupo simulado no início do estudo e semanas 1 -. 5 (todos p &lt;0,05) A Figura 3B mostra a instalação experimental para o teste de von Frey, que avalia a dor mecânico. O grupo CPSP exibiu uma diminuição significativa na força mecânica (GW) no início do estudo e semanas 1-5 (todos p &lt;0,05). Figura 4A mostra os ROIs em um atlas anatômico. A análise de ROI mostraram que a activação do córtex infralimbic (IL), córtex prelimbic (PRL), e a área de córtex cingulado 1 (CG1) foi significativamente mais elevada no grupo de CPSP no hemisfério direito, com a excepção do VB (Figura 4B) . Foram observadas diferenças na correlação inter-regionais de FSCr entre os grupos CPSP e sham no hemisfério direito (Figura 4C). A matriz (de Fisher Z-statistics) de todas as regiões foi analisada utilizando a correlação de Pearson. A Figura 4C mostra diferenças nas correlações inter-regionais do envolvimento de substratos neurais no grupo CPSP. substratos neurais de dor relacionada foram determinadas através da análise de diferenças nas correlações inter-regionais de FSCr. As linhas vermelhas na Figura 4D indicam correlações positivas significativas, e as linhas azuis indicam correlações negativas significativas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig1.jpg" /> Figura 1. Experimental Timeline da lesão do Ventral Basal Núcleo (VB) do tálamo para induzir Central pós-AVC Pain (CPSP) e injectando [14 C] -IAP. (A) lesões núcleos basais ventrais para induzir CPSP para as avaliações e injecções de [14 C] -IAP comportamentais para medir a activação de substratos neurais que estão envolvidos na CPSP. (B) Localização do VB. (C) [14 C] -IAP injeções. Barra de escala = 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig2.jpg" /> Figura 2. Curvas de auto-radiográficas padrão. (A) Sample e curvas padrão foram obtidos para diferentes tempos de exposição e resoluções de imagem. (B) curva padrão de intensidade da imagem e CPM e curva padrão de tempo de exposição e resolução. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig3.jpg" /> Fifigura 3. O teste plantar (dor térmica) e von Frey Test (Mecânica Pain) foram realizadas nos grupos Sham e CPSP no início e Semanas 1 - 5. (A) ratos CPSP exibiu um limiar mais baixo de retirada da pata no teste plantar ( ou seja, menos tolerância ao calor) em comparação com os ratos sham, indicando maior dor térmica. (ratos B) CPSP exibiu um limiar de retirada da pata inferior no teste de von Frey comparados com ratos sham, indicando maior dor mecânica. EPM, erro padrão da média. Asteriscos Verdes (*) indicam uma diferença significativa em comparação com o grupo sham. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53947/53947fig4.jpg" /> Figura 4. Análise de ROI e do relacionamento entre Inter-RCorrelações EGIONAIS entre os substratos neurais envolvidos na CPSP. (A) As áreas do cérebro foram determinadas e analisadas pela formulação proporção. (B) O ROI no IL, PrL, CG1, e VB foram significativamente diferentes no hemisfério direito. (C) Análise de FSCr nas áreas selecionadas do cérebro. (D) correlações inter-regional entre áreas do cérebro. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53947/53947fig4large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain at JoVE.com

Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

We present a protocol to measure [14C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Medidas autoradiográficas de [<sup&gt; 14</sup&gt; C] -Iodoantipyrine no cérebro de um rato Seguindo Central pós-AVC Dor

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to ...

autoradiographic-measurements-14c-iodoantipyrine-rat-brain-following

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

8.7K visualizações.  Fo Guang University. We present a protocol to measure [14C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Vídeo: Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-oclusão do vaso / hipotensão: um modelo de rato de isquemia cerebral

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Medicina

A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats

Post-stroke depression (PSD) is the most recurrent of all psychiatric complications resulting from an ischemic stroke. A greater majority (about 60%) of all ischemic stroke patients suffer from PSD, a disorder considered to be an ischemic stroke-related precursor for increased death and degradation in health. The pathophysiology of PSD is still obscure. To study the mechanism of development and occurrence of PSD further, and to find out a therapy, we attempted to develop a new protocol that requires occluding the middle cerebral artery (MCA) via the internal carotid artery (ICA) in rats. This protocol describes a model of PSD induced in rats through the middle cerebral artery occlusion (MCAO). Also used in the experiment are the Porsolt forced swim test and the sucrose preference test to confirm and evaluate the depressive mood of the rats under investigation. Rather than inserting the catheter through the external carotid artery (ECA), as stipulated for the original procedure, this MCAO technique has the monofilament passing directly through the ICA. This MCAO technique was developed a few years ago and leads to a reduction in mortality and variability. It is generally accepted that the criteria used are preferred in the selection of biological models. The data obtained with this protocol show that this model of MCAO could be a way of inducing PSD in rats and could potentially lead to the understanding of the pathophysiology and the future development of new drugs and other neuroprotective agents.

Here we present a protocol to induce post-stroke depression in rats by occluding the middle cerebral artery via the internal carotid artery. We use the Porsolt forced swim test and the sucrose preference test to confirm and evaluate induced depressive moods.

Uma técnica de oclusão da artéria cerebral média para induzir A depressão pós-AVC em ratos

Post-stroke depression (PSD) is the most recurrent of all psychiatric complications resulting from an ischemic stroke. A greater majority (about 60%) of ...

Comportamento

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

A dupla Tracer PET-MRI Protocolo para a medida quantitativa da Regional cérebro substratos energéticos Captação no Rato

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Neurociência

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Bioquímica

Non-invasive Imaging and Analysis of Cerebral Ischemia in Living Rats Using Positron Emission Tomography with 18F-FDG

Stroke is the third leading cause of death among Americans 65 years of age or older1. The quality of life for patients who suffer from a stroke fails to return to normal in a large majority of patients2, which is mainly due to current lack of clinical treatment for acute stroke. This necessitates understanding the physiological effects of cerebral ischemia on brain tissue over time and is a major area of active research. Towards this end, experimental progress has been made using rats as a preclinical model for stroke, particularly, using non-invasive methods such as 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) coupled with Positron Emission Tomography (PET) imaging3,10,17. Here we present a strategy for inducing cerebral ischemia in rats by middle cerebral artery occlusion (MCAO) that mimics focal cerebral ischemia in humans, and imaging its effects over 24 hr using FDG-PET coupled with X-ray computed tomography (CT) with an Albira PET-CT instrument. A VOI template atlas was subsequently fused to the cerebral rat data to enable a unbiased analysis of the brain and its sub-regions4. In addition, a method for 3D visualization of the FDG-PET-CT time course is presented. In summary, we present a detailed protocol for initiating, quantifying, and visualizing an induced ischemic stroke event in a living Sprague-Dawley rat in three dimensions using FDG-PET.

Non-invasive Imaging and Analysis of Cerebral Ischemia in Living Rats Using Positron Emission Tomography with 18F-FDG

Brain damage resulting from cerebral ischemia may be non-invasively imaged and studied in rats using pre-clinical positron emission tomography coupled with the injectable radioactive probe, 18F-fluorodeoxyglucose. Further, the use of modern software tools that include volume of interest (VOI) brain templates dramatically increase the quantitative information gleaned from these studies.

Imagem não invasivo e Análise de Isquemia Cerebral em Ratos de Vida Usando Positron Emission Tomography com<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG

Stroke is the third leading cause of death among Americans 65 years of age or older1. The quality of life for patients who suffer from a stroke fails to ...

Intracranial Pharmacotherapy and Pain Assays in Rodents

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the development of effective therapeutics. Intracranial pharmacology presents an important tool for understanding the molecular and cellular mechanisms of pain in the brain, as well as for novel treatments. Here we present a protocol that integrates intracranial pharmacology with pain behavior testing. Specifically, we show how to infuse analgesic drugs into a select brain region, which may be responsible for pain modulation. Furthermore, to determine the effect of the candidate drug in the central nerve system, pain assays are performed after intracranial treatment. Our results demonstrate that intracranial administration of analgesic drugs in a targeted region can provide relief of pain in rodents. Thus, our protocol successfully demonstrates that intracranial pharmacology, combined with pain behavior testing, can be a powerful tool for the study of pain mechanisms in the brain.

Here we present a protocol to perform intracranial pharmacological experiments followed by pain behavior assays in rodents. This protocol allows researchers to deliver molecular and cellular targets in the brain, for pharmacologic agents in the treatment of pain.

Farmacoterapia intracraniana e ensaios de dor em roedores

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Neuroinflammation is central to the pathological cascade following ischemic stroke. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide critical insights into the temporal dynamics and role of certain neuroimmune interactions in stroke. Specifically, Positron Emission Tomography (PET) imaging of translocator protein 18 kDa (TSPO), a marker of activated microglia and peripheral myeloid-lineage cells, provides a means to detect and track neuroinflammation in vivo. Here, we present a method to accurately quantify neuroinflammation using [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C]DPA-713), a promising second generation TSPO-PET radiotracer, in distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) compared to sham-operated mice. MRI was performed 2 days post-dMCAO surgery to confirm stroke and define the infarct location and volume. PET/Computed Tomography (CT) imaging was carried out 6 days post-dMCAO to capture the peak increase in TSPO levels following stroke. Quantitation of PET images was conducted to assess the uptake of [11C]DPA-713 in the brain and spleen of dMCAO and sham mice to assess central and peripheral levels of inflammation. In vivo [11C]DPA-713 brain uptake was confirmed using ex vivo autoradiography.

PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Positron Emission Tomography (PET) imaging of translocator protein 18 kDa (TSPO) provides a non-invasive means to visualize the dynamic role of neuroinflammation in the development and progression of brain diseases. This protocol describes TSPO-PET and ex vivo autoradiography to detect neuroinflammation in a mouse model of ischemic stroke.

Imagem de Neuroinflammation usando [11C] DPA-713 em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico do animal de estimação

Neuroinflammation is central to the pathological cascade following ischemic stroke. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Medidas autoradiográficas de [

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo