Name: in situ characterization of hydrated proteins in water by salvi and tof-sims
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
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We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.

1. Reinigung und Sterilisation des SALVI Microchannel <ol><li> Sterilisation des Mikrokanals in SALVI <ol><li> Unentschieden 2 ml 70% Ethanol wässrigen Lösung in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlassende von SALVI, und spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten. Entfernen Sie die Spritze am Ende der Injektion. Als nächstes den Einlass und Auslass von SALVI ein Polyetheretherketon (PEEK) Vereinigung anschließen werden. Alternativ können Sie eine Spritzenpumpe die gleiche Prozedur durchzuführen. Sie können beispielsweise die Strömungsgeschwindigkeit bei 100 &amp; mgr; l / min. </li><li> Halten Sie die SALVI Mikrokanal gefüllt mit 70% Ethanol-Lösung bei Raumtemperatur für 4 Stunden. </li></ol></li><li> Einführung Entionisiertes (DI) Wasser in SALVI <ol><li> Unentschieden 2 ml sterilisiertem VE-Wasser in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI, und spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten. Entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Eingang und Ausgang von SALVI einer PEEK-Vereinigung mit. Alternativ können Sie eine Spritzenpumpe wie erwähnt inSchritt 1.1.1. </li></ol></li></ol> 2. Immobilisierung des Proteins Film in SALVI <ol><li> Immobilisierung der Proteinfilm in SALVI <ol><li> Unentschieden 2 ml Fibronektin (10 ug / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS) Lösung in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI, spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten, entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Einlass und Ausgang des SALVI mit einer PEEK-Vereinigung. </li><li> Inkubation des SALVI mit der Fibronektin-Lösung in einem sauberen Kulturschale gefüllt, für 12 Stunden das Gericht in die Haube bei Raumtemperatur halten. </li><li> Unentschieden 2 ml sterilisiertem VE-Wasser in eine Spritze und verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI. spritzen langsam 1 ml Wasser in 10 Minuten, entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Eingang und Ausgang von SALVI. Hinweis: Wenn mit einem Lichtmikroskop ausgestattet, unter dem Mikroskop die SALVI überprüfen, um sicherzustellen, dass der SiN-Membran vor ToF-SIMS-Analyse intakt ist. Nun ist die SALVI Gerät ist bereit für TOF-SIMS einalysis. </li></ol></li></ol> 3. Installieren SALVI in der TOF-SIMS Schleusenkammer Hinweis: Schutzhandschuhe sollten jederzeit getragen werden, wenn das Gerät SALVI Handhabung und auf die TOF-SIMS Phase der Installation von potentiellen Verunreinigungen während der Oberflächenanalyse zu vermeiden. <ol><li> Berg SALVI auf die Bühne <ol><li> Legen Sie die TOF-SIMS Bühne auf eine ebene und saubere Fläche. Setzen Sie den SALVI Gerät auf die Bühne mit der Silizium-Wafer und SiN-Membran nach oben. Befestigen Sie die SALVI mit vier Metallklemmstücke und schrauben Sie die Metallteile der Ecke des Geräts in die Metallplatte mit vier Schrauben halten. </li><li> aufrollen vorsichtig die PTFE-Schlauch an den mikrofluidischen Kanal verbunden. Verwenden Sie vier Metallstücke und vier Schrauben, die das steife Teil zu halten. Stellen Sie sicher, dass das Gerät in dem freien Platz auf dem SIMS Stufe so positioniert ist, dass es nicht mit dem primären Ionenstrahl während der Analyse nicht stört. Zusätzliche Bild und Darstellung der SALVI fabricatIon und Installation sind in früheren Veröffentlichungen zur Verfügung. 8,9,11 </li></ol></li><li> Montieren Sie den Faraday-Cup auf die Bühne <ol><li> Befestigen Sie den Faraday-Cup auf der Bühne mit einer Schraube. </li></ol></li><li> Laden Sie die Bühne in die TOF-SIMS Schleusenkammer <ol><li> Öffnen Sie die TOF-SIMS Schleusen, halten und die Bühne horizontal auf der Ladefläche, und schließen Sie die Schleusentür. </li></ol></li></ol> 4. TOF-SIMS Datenerfassung <ol><li> Einschalten der Vakuumpumpe und sicherzustellen geeignetes Vakuum (beispielsweise in der Größenordnung von 10 -6 mbar oder Torr) in der Ladeschleusenkammer erreicht. </li><li> Bewegen Sie den SALVI in die Hauptkammer, sobald das Vakuum nach etwa 30 min stabilisiert. Hinweis: Das Vakuum sollte niedriger sein als 5 x 10 -6 mbar Vakuum in der Hauptkammer während der Datenerfassung. Ansonsten ist höheres Vakuum eines Lecks in dem System SALVI indikativ. </li><li> Stellen Sie den Primärionenstrahl und Analysator von TOF-SIMS mit einräumliche Auflösung von etwa 400 nm gemäß den Herstellerempfehlungen. Der Strom des Primärstrahls ist 1.200 pA, während die Zykluszeit von 30 Mikrosekunden unter DC-Modus befindet. Hinweis: Dieser Vorgang weitgehend folgt Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Finden Sie den mikrofluidischen Kanal des optischen Mikroskop. Verwenden Sie die optische Bildmitte als Referenz und richten Sie sie an der Sekundärionen-Bildmitte, konsequent zu sein. </li><li> Vor jeder Messung verwenden, um eine 1 keV O 2 + Strahl (~ 40 nA) auf dem SiN-Fenster mit einem 500 x 500 &amp; mgr; m 2 Fläche zu scannen für ~ 15 sec Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Verwenden Sie außerdem eine Elektronenflutkanone Oberfläche Aufladung bei allen Messungen zu kompensieren. Verwenden Sie die automatische Funktion des Hochwasserpistole in den Standardmodus für diesen Schritt. </li><li> Wählen positiven oder negativen Modus, bevor die Datenerfassung. Verwenden Sie die 25 keV Bi 3 + Strahl als primäre Ionenstrahl in alle Messungen. Hinweis: Die Schritte sind ähnlich foder positive und negative Datenerfassungen. Für das Interesse der Raum wird die positive Modus im Detail beschrieben. <ol><li> Tiefenprofilierung <ol><li> Scannen Sie den Bi 3 + Strahl auf eine runde Fläche mit einem Durchmesser von ca. 2 &amp; mgr; m mit 32 Pixeln mal 32 Pixeln Auflösung. </li><li> Um die Zeit zu minimieren, die erforderlich zum Durchgriff der SiN-Membran, mit einem langen Impulsbreite (dh 180 nsec, Strahlstrom ~ 1,0 Pa bei einer Zykluszeit von 100 &amp; mgr; s) Bi 3 + Strahl. Die Intensitäten von sekundären Ionen repräsentativ von der Flüssigkeitsoberfläche erhöhen, wenn Durchgriff erreicht wird. Die Punch-Through Zeit variiert von 300 sec bis 500 sec, je nach Charge des SiN-Membran. Anmerkung: Dieser Unterschied in den Ansatz von SiN Membranen verwandt zu sein scheint erworben nach unseren Erfahrungen. Allerdings ist die Punch-Through-Zeit nicht wirklich die Datenanalyse beeinflussen. </li><li> Nach dem SiN Membrandurchgriff, halten Sie das gleiche für etwa 200 sec Strom zugenügend Daten für 2D-Bildrekonstruktionen erhalten. </li><li> Reduzieren Sie die Impulsbreite auf 80 ns für Sammlungsdaten Spektren mit einer besseren Massenauflösung zu erwerben. Setzen Sie diese Akquisition noch etwa 200 Sekunden. Die Spektraldaten in 1 gezeigt werden aus diesem Bereich erhalten. </li></ol></li><li> 2D-Imaging und Massenspektren <ol><li> Sammeln Sie die 2D-Bildgebung und Massenspektren Daten zur gleichen Zeit, als die Tiefenprofilmessdaten. Die TOF-SIMS Gerät speichert alle Daten von jedem Punkt während des Experiments. (- Spectra, FPanel - FPanel Profile und FPanel - Bilder separat) Die Daten werden in verschiedenen Fenstern angezeigt des digitalen Steuerungssoftware. Prüfen Sie Daten in jedem Feld umsichtig bei der Datenerfassung. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. TOF-SIMS Datenanalyse Hinweis: Die Datenanalyse zunächst ausgeführt, um die IonToF TOF-SIMS instrumental Software. <ol><li> Öffnen Sie die einealysis Software von SIMS (Messung Explorer) und klicken Sie dann auf die &quot;Profile&quot;, &quot;Spektrum&quot; und &quot;Bild&quot; Tasten bzw. Tiefenprofil, m / z-Spektrum, und Bilddaten zu verarbeiten. </li><li> Öffnen Sie die Dateien, die die Erweiterung &quot;.ita&quot; haben. </li><li> Wählen Sie Spitzen von Interesse, geben Sie den Artnamen in &quot;Ion&quot; ein, und beschriften Sie sie mit verschiedenen Farben in den Spektren. Verwenden Sie das Mausrad auf der x-Achse zu ziehen. Mit Strg und Scroll-Rad-Spitze Höhen und Breiten anzupassen. Buchstabe &quot;L&quot; wird zwischen Linear- und Log-Modi auf der y-Achse. </li><li> Führen Datenrekonstruktion vor Massenkalibrierung. Ansonsten ist es schwierig, den Abstand zwischen den Peaks im Massenkalibrierungsschritt zu wählen. <ol><li> Wählen Sie die Tiefenprofildaten von Interesse und rekonstruieren die Spektren nach dem Tiefenprofil Zeitreihe. </li><li> Klicken Sie auf die Rekonstruktion Taste. In der &quot;Start Wiederaufbau&quot; -Fenster, geben Sie einen Scanbereich von interest. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um die Tiefenprofil Daten rekonstruieren. </li></ol></li><li> Führen Sie eine Massenkalibrierung. Drücken Sie &quot;F3&quot;, um den &quot;Massenkalibrierung&quot; -Fenster. Wählen Sie Spitzen für die Kalibrierung auf der Basis der spezifischen Probe. 21 In dieser Arbeit, die folgenden Spitzen CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), 11 H O 5 + (m / z 99) und H 13 O 6 + (m / z 109) für die positive Betriebsart. Verwenden Sie die folgenden Peaks CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), und C 4 H - (m / z 49) für die negative Betriebsart. <ol><li> Wählen Sie eine Spitze,stellen Sie sicher, dass der Pfeil nach unten ist auf dem Höhepunkt in der linken unteren Ecke des Fensters zeigte. Klicken Sie auf diesen Höhepunkt und geben Sie den Spitzennamen in der &quot;Massenkalibrierung&quot; Fenster, klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;, und das Ion von Interesse ist in der Massenkalibrierung enthalten. </li><li> Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche &quot;Recalibrate&quot;. Überprüfen Sie, ob die Flächen der Peaks in den richtigen Stellen sind nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnissen. In der &quot;Spectrum&quot; -Menü und klicken Sie auf &quot;Übernehmen Massenkalibrierung&quot; auf &quot;All Spectra&quot; oder &quot;Ausgewählte Spektren&quot;, auf die spezifische Analyse je durchgeführt. </li></ol></li><li> Als Höhepunkt Auswahl für die Probenanalyse erforderlich ist, der Literatur oder anderen bisherigen Erkenntnissen nach charakteristischen Peaks der Probe bestimmen. Vergleichen Sie die Intensität der Peaks von Interesse in der m / z-Spektren. Falls erforderlich, neue Spitzen oder löschen nutzlos Spitzen in der Peak-Liste. <ol><li> In Spitzen. Klicken Sie auf eine Spitze, die roten Linien in der linken unteren Fenster finden. Hold die &quot;Strg&quot; -Taste, bewegen Maus horizontal Peakbreite zu definieren, die automatisch einen Peak, der dem Peak-Liste hinzufügt. Eine weitere Möglichkeit, einen Höhepunkt hinzuzufügen, ist ein Höhepunkt in der Haupt Spektrum Fenster auszuwählen, und dann auf &quot;Hinzufügen peak&quot; zu klicken über dem Fenster. Wenn es viele Spitzen an, in der &quot;Spectrum&quot; Menü sind, wählen Sie &quot;Suche Spitzen&quot;, überprüfen bezogenen Spezifikationen in dem sich öffnenden Fenster, dann Spitzen nach Bedarf hinzufügen. </li><li> Um eine Peak-Liste exportieren, in der &quot;Peak-Liste&quot; Menü wählen Sie &quot;Speichern unter ...&quot;, um die Peak-Liste im &quot;itmil&quot; -Format. Verwenden Sie die Strg-Taste und linke Taste auf dem Spektrum zu ziehen. In den Spektren Fenster, wählen Sie einen Höchststand von Interesse und ziehen Sie die beiden gestrichelten Linien, um wünschenswerte Positionen. </li><li> Um eine Peak-Liste zu importieren, in der &quot;Mass Intervall-Liste&quot; Wählen Sie im Menü &quot;Import ...&quot;, suchen Sie eine bestehende Spitzenlistendatei mit der Dateiendung &quot;.ITPL&quot;. Klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. </li><li> eine &quot;itmil&quot; Peak-Liste zu verwenden,die &quot;Mass Intervall List&quot; Menü klicken Sie auf &quot;Öffnen ...&quot;, um die Datei zu finden, dann auf &quot;Öffnen&quot; klicken. </li></ol></li><li> Tragen Sie eine Peak-Liste zur weiteren Daten zu analysieren. Am linken unteren Teil &quot;Spectra&quot; -Fenster, gibt es ein Fenster &quot;Mass Interval Liste&quot; genannt. Das importierte Spitzen Liste ist hier aufgetaucht. <ol><li> Rechtsklick auf die Peak-Liste-Datei verwendet werden soll, wenden sie auf die &quot;aktive Spektrum&quot; oder &quot;alle Spektren&quot;. </li></ol></li><li> Sehen Sie sich die Datenprofile. Im &quot;Profil&quot; Fenster, Nutzung Buchstaben &quot;M&quot; auf Fenster (Vollbereich) und der Buchstabe &quot;N&quot; zu passen zu der y-Achse zu passen. Mit Strg und Scrollrad das Profil Breite anzupassen. Oder nutzen Sie &quot;/&quot; und &quot;*&quot; auf der Tastatur die Y-Achsenbereich und Höhe zu ändern. </li><li> Datenexport für die weiter nach der ersten Analyse mit anderen Grafik-Software plant. <ol><li> Um ein Tiefenprofil, in dem &quot;Profil&quot; Fenster exportieren, klicken Sie auf das Menü &quot;Datei&quot; und dann &quot;Export &amp; #34 ;, und wählen Sie dann &quot;Speichern unter&quot; einem &quot;.txt&quot; -Datei. </li><li> So exportieren einen m / z-Spektrum-Datei, in der &quot;Spectra&quot; Fenster, klicken Sie auf das Menü &quot;Datei&quot; und dann &quot;Export&quot; und wählen Sie &quot;Speichern unter&quot; einem &quot;.txt&quot; -Datei. </li><li> eine Bilddatei, in der &quot;Bild&quot; Fenster, Print Screen und speichern wie die Bilddatei zu exportieren. </li></ol></li></ol> 6. TOF-SIMS Daten Plotten und Präsentation Hinweis: Verwenden Sie eine grafische Werkzeug, um die Daten zu zeichnen, nachdem die SIMS Daten verarbeitet werden, die instrumental-Software. <ol><li> Verwenden Sie ein Grafik-Tool die Daten zu importieren. </li><li> Machen Sie einen Plan mit dem m / z als der x-Achse und Spitzenintensität als der y-Achse des rekonstruierten Spektrums zu zeigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 1 wiedergegeben. </li><li> Machen Sie einen Plan mit der Sputter-Zeit wie die x-Achse und Spitzenintensität als der y-Achse des rekonstruierten Tiefenprofil zeitliche Serie zu zeigen. Ein Beispiel ist gegeben in FiguRE 2. </li><li> Kombinieren Sie rekonstruierten 2D-Bilder von verschiedenen m / z und bilden eine Matrix, die die Ionen-Mapping zu zeigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 wiedergegeben. </li></ol>

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	<li>Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+rotation+barriers+on+protein+molecular+surfaces.">Water rotation barriers on protein molecular surfaces.</a> Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).</li><li>Maruyama, Y., Harano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+water+drive+protein+folding?.">Does water drive protein folding?.</a> Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).</li><li>Chaplin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Do+we+underestimate+the+importance+of+water+in+cell+biology.">Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hydration+dynamics+around+a+protein+surface.">Mapping hydration dynamics around a protein surface.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).</li><li>Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+analysis+of+conformational+changes+in+adsorbed+protein+films.">Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films.</a> Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).</li><li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+proteins+with+solid+surfaces.">The interaction of proteins with solid surfaces.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).</li><li>Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+structure+of+binary+and+ternary+adsorbed+protein+films+using+electron+spectroscopy+for+chemical+analysis,+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry,+and+radiolabeling.">Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling.</a> Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).</li><li>Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+liquid+surfaces+under+vacuum+using+SEM+and+and+ToF-SIMS.">Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).</li><li>Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+hybrid+microfluidic+platform+compatible+for+in+situ+imaging+by+vacuum-based+techniques.">Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).</li><li>Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+aqueous+surfaces+by+ToF-SIMS.">Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS.</a> LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).</li><li>Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+and+methods+for+analyzing+liquids+under+vacuum.">Systems and methods for analyzing liquids under vacuum.</a> US patent. , (2013).</li><li>Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electrochemical+device+and+process+for+chemical+imaging+and+electrochemical+analysis+at+the+electrode-liquid+interface+in+situ.">Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ.</a> US patent. , (2014).</li><li>Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+microfluidic+device+for+in+situ+ToF-SIMS+analysis+of+selected+organic+molecules+at+aqueous+surfaces.">Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces.</a> Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+SEM+and+ToF-SIMS+analysis+of+IgG+conjugated+gold+nanoparticles+at+aqueous+surfaces.">In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces.</a> Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+molecular+imaging+of+hydrated+biofilm+in+a+microfluidic+reactor+by+ToF-SIMS.">In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS.</a> Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+and+three-dimensional+dynamic+imaging+of+live+biofilms+in+a+microchannel+by+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry.">Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry.</a> Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chemical+probing+of+the+electrode-electrolyte+interface+by+ToF-SIMS.">In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).</li><li>Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+at+a+glance.">Fibronectin at a glance.</a> J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).</li><li>Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+the+cell-attachment+site+in+fibronectin+with+monoclonal+antibodies+and+proteolytic+fragments+of+the+molecule.">Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule.</a> Cell. 26 (2), 259-267 (1981).</li><li>Engvall, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+soluble+form+of+fibroblast+surface+protein,+fibronectin,+to+collagen.">Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen.</a> Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).</li><li>Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOF-SIMS:+Accurate+mass+scale+calibration.">TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).</li><li>Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liquids+using+microfluidic+cells.">Imaging liquids using microfluidic cells.</a> Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).</li><li>Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailing+into+uncharted+waters:+recent+advances+in+the+in+situ+monitoring+of+catalytic+processes+in+aqueous+environments.">Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments.</a> Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).</li><li>Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+biophysical+tools+to+investigate+lipid+specificity+in+the+interaction+between+bioactive+molecules+and+the+plasma+membrane:+A+review.">Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review.</a> Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).</li><li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry.">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li><li>Gilmore, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMS+of+organics-Advances+in+2D+and+3D+imaging+and+future+outlook.">SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).</li><li>Muramoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToF-SIMS+Analysis+of+Adsorbed+Proteins:+Principal+Component+Analysis+of+the+Primary+Ion+Species+Effect+on+the+Protein+Fragmentation+Patterns.">ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns.</a> J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).</li><li>Br&#252;ning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA.">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li><li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li><li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly(hydroxylethyl+methacrylate)+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

SALVI ist ein Mikrofluidik-Schnittstelle, die durch Vakuumbasierte Instrumente, wie TOF-SIMS und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dynamische Flüssigkeitsoberfläche und Flüssig-Fest-Schnittstellenanalyse ermöglicht. Durch die Verwendung von kleinen Öffnungen Flüssigkeit auszusetzen direkt im Vakuum, ist SALVI für viele fein fokussierten Spektroskopie und bildgebenden Verfahren ohne Änderungen; 22 die Portabilität und Flexibilität der Mikrofluidik es eine echte multimodale Bildgebungsplattform machen. Besondere Merkmale und die Bedeutung der SALVI im Vergleich zu anderen Techniken sind in mehreren aktuellen Übersichten zusammengefasst. 22-25 Als Entwickler des SALVI Technologie, unsere Gruppe aktiv wurde es zu einer Vielzahl von Studien die Anwendung mit dynamischer Flüssigkeitsoberflächen und Flüssig-Fest-Schnittstellen . Einige Beispiele für neue Anwendungen umfassen Säugetierzellmembranen, Bakterien Biofilm Befestigungs, 15,16 oder Nanopartikelbildung als Folge der Wasseroberflächenoxidationen. In diesem papro, präsentieren wir erste Flüssigkeit TOF-SIMS Ergebnisse des wasserhaltigen Dünnschicht-Protein auf der SiN Oberfläche adsorbiert. Es ist ziemlich kritisch, sorgfältig die markierten Schritte in dem Protokoll handhaben. Zum Beispiel, wenn die Flüssigkeit in die Spritze in den Schritten 1 und 2 zeichnen, stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Spritze. Denn wenn die Blasen in SALVI eingespritzt werden, können sie Leckage im Vakuum induzieren. 9 Wenn also keine Blasen beobachtet werden, ist es ratsam, sie los zu erhalten, indem Sie die Spritze aufrecht setzen und sanft die Blasen aus drückt. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, die SiN-Fenster in SALVI flach zur optimierten TOF-SIMS-Analyse zu machen, wie in Schritt 3 beschrieben Dies Egalität der Erfassungsbereich wirkt sich direkt auf die Datenqualität nach dem Entwurf von TOF-SIMS. 26 Es notwendig ist, um visuell das Gerät untersuchen, nachdem alles, was auf den SIMS Bühne zu sichern. Wenn die SiN-Fenster nicht horizontal ist, die Schrauben einstellen und die Höhe änderndes SALVI Vorrichtung um sicherzustellen, dass alles, was in der gleichen Ebene so weit wie möglich ist. Diese zarten Punkte brauchen Erfahrung und Sorgfalt, die den Erfolg und die Zuverlässigkeit des gesamten Experiments bestimmen. Wie in 1B gezeigt, sind die Peaks mit m / z 19, 37, 55, 73, 91 und 109 hohe Zählungen haben. Dies zeigt an, dass es eine ganze Reihe von Wassercluster sind (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + und H 13 O 6 +) in der positiven Sekundärionen. Die anderen Wassercluster mit höheren m / z-Werte (Daten nicht gezeigt) haben auch relativ starke Peaks im Vergleich zu ihren benachbarten Peaks. Diese großen Mengen von Wasser-Clustern aus dem DI Wasseroberfläche nach dem SiN punch-through emittiert. Wassercluster Signale im positiven Modus haben nicht zu beobachten gewesen im vorherigen work; und dies wurde auf die niedrigen Zählungen von Sekundärionen zugeschrieben und nicht optimierten ToF-SIMS Bedingungen in der Vergangenheit. 8 Mit der kontinuierlichen Aufwand bei der Optimierung der SALVI und ToF-SIMS Erfassungsbedingungen, wie beispielsweise der Primärionenstrahl (dh Bi + vs mit den hier vorgestellten Bedingungen. Bi 3+) und aktuellen Bedingungen während Tiefenprofilierung Impulsbreite ist es nun möglich, im positiven Modus bis 44 Wassercluster zu beobachten, auf. Hier gezeigten Ergebnisse sind vielversprechend, um die Rolle des Wassers in der Dynamik von verschiedenen biologischen Molekülen und biologischen Systemen untersuchen. Hier beispielhaft die Vorteile der SALVI und ToF-SIMS zur Veranschaulichung in biologischen Moleküldynamik zu studieren, die Hydratisierung von Fibronektin Protein präsentiert. Die Peaks von m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 und 98 gehören zu den Aminosäurefragmente nach dem letzten Bericht, 27,28, die viel stärker sind als die von DI Water in 1b gezeigt. Dieser Unterschied in der erhöhten Intensität der Aminosäure-Fragmente in der Probe Fibronektin legt nahe, dass diese Sekundärionen tatsächlich von den Proteinen selbst. Darüber hinaus sind die Peaks von Wassercluster in Figur 1a deutlich stärker als die von DI-Wasser in 1b, die konnten die Eigenschaften von Wassermolekülen in der Proteinadsorption Ober- und Grenzflächen Lösung von denen sehr verschieden sein in reinem Wasser impliziert, dass. 2a zeigt repräsentative Tiefenprofilierung zeitliche Folge von zwei verschiedenen Proben: Fibronektin und DI-Wasser in der SALVI Mikrokanal. Die Tiefenprofildaten wurden gesammelt, wie die SiN-Fenster durch die mit der langen Impulsbreite Primärionenstrahl + Bi 3 bombardiert wurde. Wie in 2a zu sehen ist, wird die SiN-Fenster bei etwa 300 sec durchgestanzt. Vor dem Fenster SiN in SALVI gestanzt through, die Intensitäten ausgewählter Sekundärionen sind ziemlich gering. Sobald die SiN Fenster gestanzt wird durch steigen die Intensitäten der Sekundärionen unmittelbar als die Flüssigkeitsoberfläche durch den Primärionenstrahl beschossen begonnen wird. Beispielsweise können die Intensitäten von H + und H 3 O + zeigen eine starke Zunahme, was auf die Beobachtung der Wasseroberfläche. 8,9 Obwohl die Intensitäten instabil direkt nach dem Durchgriff oder an der Grenzfläche sind, können sie relativ stabil erreichen Werte nach einer gewissen Zeit (beispielsweise 60 sec für Fibronektin und 220 sec für DI-Wasser bzw. in Abbildung 2a). Der Unterschied in der langen Impulsbreite Bohrungen wirkt sich nicht wirklich die Analyseergebnisse hier dargestellt, wenn m / z Spektren Rekonstruktion (beispielsweise Figur 1), da die effektive m / z-Spektren nach der SiN Durchgriff erfasst werden. Jedoch kann ein Forscher wählen die gleichen Bedingungen für alle Proben zu verwenden for Konsistenz und Benutzerfreundlichkeit bei der Wahl Datenabschnitte während der Datenanalyse. Um besser war Massenauflösung, die Impulsbreite zu erhalten, anschließend reduziert und die Intensitäten wurden entsprechend im letzteren Teil des Tiefenprofilierung Experiment verringert. Das Tiefenprofil Zeitreihe wurden kontinuierlich gesammelt für weitere 200 sec genügend Daten für m / z Spektralanalyse zu schaffen. Die Segmente der Zeit, die m / z-Spektren rekonstruiert wurden, sind in grün schattierten Bereiche hervorgehoben. Fibronectin wurde Oberflächenadsorption vor der Zellkultivierungs weit verbreitet; Viele Studien haben für die Zelladhäsion und Zell-Biomaterial-Interaktionen. 19,20,29 Eine neue Studie aus der Dicke von Fibronektin adsorbiert an Poly (Hydroxyethylmethacrylat) Bürsten Ellipsometrie Fibronektin ist verantwortlich gezeigt. Die Fibronektin Dünnschicht bestimmt 3-12 nm dick. 30 Eine solche Dicke zu sein, ist angemessen für die Tiefenprofilanalyse in einer wässrigen Lötion. 8,9 Mit der Entwicklung der SALVI, ist nun eine direkte Analyse der hydratisierten Protein auf der festen Oberfläche adsorbiert möglich. Dieser Ansatz kann potentiell breite Anwendungen müssen die Wechselwirkungen von Proteinen mit festen Oberflächen dynamisch zu studieren. 2b zeigt die ausgewählten 2D-Bilder von verschiedenen Sekundärionen von Fibronektin und DI Wasserproben, respectively. 2D-Bilder werden aus den Tiefenprofilierung von Zeitdaten in grün schraffierten Bereiche in Figur 2a erhalten, die nach der SiN zur Flüssigkeitsoberfläche entsprechen Punch-Through wie zuvor beschrieben. Die Abbildungen ausgewählter Aminosäurefragment Sekundärionen CH 4 N +, C 5 H 7 O + und C 4 H 4 NO 2 + (dh, m / z 30, 83 und 98) für die Fibronektin Dünnschicht waren deutlich heller als jene für DI-Wasser. Dies zeigt, dass die Aminosäurefragment Sekundärionen f eingehalten werdenROM mit der Fibronektin-Moleküle innerhalb der 2 Mikrometer Durchmesser Öffnung. Ferner sind die Bilder der ausgewählten Peaks (zum Beispiel m / z 1, 19, 37 und 55) mit mehreren Wassercluster von Fibronektin entsprechen, sind bemerkenswert heller als die von entionisiertem Wasser. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Hydratation von Fibronectin die Wassermoleküle macht die Biomolekül Unterschied zu den Wassermolekülen in dem DI-Wasser umgibt. Zusammenfassend hat diese Arbeit schlagender Beweis auf Proteinhydratation induzierten Wassermolekül Eigenschaft Änderungen vorgesehen. Solche Ergebnisse könnten ein verbessertes grundlegendes Verständnis über die Struktur, Konformation und biologische Aktivität von Proteinen auf einer festen Oberfläche in der flüssigen Mikroumgebung adsorbiert bieten.

Hydratation ist entscheidend für die Struktur, Konformation 1, 2 und 3 der biologischen Aktivität von Proteinen. Proteine ​​ohne Wassermoleküle um sie herum wäre nicht lebensfähig biologischen Aktivitäten haben. Genauer gesagt, interagieren Wassermoleküle mit der Oberfläche und die innere Struktur von Proteinen und verschiedenen Hydratationszustände von Proteinen machen solche Wechselwirkungen deutlich. 4 Die Wechselwirkung von Proteinen mit festen Oberflächen ist ein grundlegendes Phänomen mit Auswirkungen im Bereich der Nanotechnologie, Biomaterialien und Prozesse Tissue Engineering. Studien haben darauf hingewiesen, dass lange Konformationsänderungen eintreten können als ein Protein mit einer Oberfläche trifft. ToF-SIMS wurde als ein Verfahren, vorgesehen, dass das Potenzial, die Protein-fest-Grenzfläche zu untersuchen hat. 5-7 ist es wichtig, die Hydratation von Proteinen auf festen Oberflächen zu verstehen, die möglicherweise ein grundlegendes Verständnis des Mechanismus ihrer Struktur liefert, Konformation und biologischeal Aktivität. Allerdings sind große Oberflächenanalysetechniken meistens vakuumbasierten und direkte Anwendungen für flüchtige Flüssigkeit Studien sind schwierig aufgrund der raschen Verdampfung der flüchtigen Flüssigkeit unter der Vakuumumgebung. Wir entwickelten ein Vakuum kompatibel mikrofluidische Schnittstelle, System zur Analyse auf dem Liquid Vacuum Interface (SALVI), direkte Beobachtungen von Flüssigkeitsoberflächen und Flüssig-Fest-Interaktionen zu ermöglichen mit Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). 8- 11 die einzigartigen Aspekte schließen die folgenden ein: 1) das Detektionsfenster eine Öffnung von 2-3 um im Durchmesser direkte Abbildung der Flüssigkeitsoberfläche ermöglicht, 2) Oberflächenspannung wird die Flüssigkeit in der Öffnung zu halten, und 3) ist SALVI tragbaren zwischen mehreren Analyseplattformen. 11,12 SALVI besteht aus einem Siliziumnitrid (SiN) Membran als dem Erfassungsbereich und einem Mikrokanal aus Polydimethylsiloxan (PDMS). Es ist fabrcated im Reinraum, und die Herstellung und die wichtigsten Designfaktoren wurden in früheren Veröffentlichungen und Patenten ausführlich dargestellt. 8-12 Die Anwendungen der TOF-SIMS als analytisches Werkzeug wurden gezeigt, eine Vielzahl von wässrigen Lösungen und komplexen Flüssigkeitsmischungen verwenden, einige der die Nanopartikel enthalten. 13-17 Insbesondere SALVI Flüssigkeit TOF-SIMS ermöglicht der flüssig-Fest-Grenzfläche von lebenden biologischen Systemen Rammsondierung (dh Biofilme), Einzelzellen und Festelektrolyt-Schnittstelle, für neue Möglichkeiten öffnen in situ kondensierten Phase Studien einschließlich Flüssigkeiten TOF-SIMS verwenden. Allerdings ist der aktuelle Entwurf noch nicht Gas-Flüssigkeits-Interaktionen ermöglichen. Dies ist eine Richtung für die zukünftige Entwicklung. SALVI wurde verwendet, um den hydratisierten Proteinfilm in dieser Arbeit zum ersten Mal zu studieren. Fibronectin ist ein häufig verwendetes Protein-Dimer, bestehend aus zwei nahezu identischen Monomeren durch ein Paar Disulfidbindungen verbunden sind, 18, ​​die is für seine Fähigkeit, bekannte Zellen zu binden. 19,20 Sie als Modellsystem ausgewählt wurde zu veranschaulichen, dass die hydrierten Proteinfilm dynamisch die SALVI Flüssigkeit mit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden konnte. Die Proteinlösung wurde in den Mikrokanal eingeführt. Nach Inkubation für 12 Stunden, ein hydratisiertes Proteinfilm auf der Rückseite des SiN-Membran gebildet. Deionisiertes Wasser (DI) wurde verwendet, um den Kanal nach der Protein Einführung abzuspülen. Die Informationen wurden in der SALVI Mikrokanal mit dynamischen TOF-SIMS aus hydrierten Fibronektin Proteinmolekülen gesammelt. DI-Wasser wurde ebenfalls als Kontrolle untersucht mit den Ergebnissen aus hydrierten Fibronektin Dünnschicht erhalten zu vergleichen. Deutliche Unterschiede zwischen dem hydratisierten Proteinfilm und DI-Wasser beobachtet. Diese Arbeit zeigt, dass die Proteinadsorption an der Oberfläche in der flüssigen Umgebung können mit dem neuartigen SALVI und Flüssigkeit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden. Die Video-Protokoll ist für den Menschen eine technische Anleitung zur Verfügung zu stellen, die daran interessiert sindin diese neue Analysewerkzeug für vielfältige Anwendungen von SALVI mit TOF-SIMS zu nutzen und unnötige Fehler in Liquid Handling sowie TOF-SIMS Datenerfassung und -analyse zu reduzieren.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF.SIMS 5</td><td>Resolution: &gt;10,000 m/&amp;Delta;m for mass resolution; &gt;4,000 m/&amp;Delta;m for high spatial resolution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td><td>Pacific Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>for connecting the inlet and outlet of SALVI</td></tr><tr><td>5 Axes Sample Stage</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Range: 100 to 1,000 ml</td></tr><tr><td>Pipette Tip</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1,000 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td>95% Denatured</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

in situ characterization of hydrated proteins in water by salvi and tof-sims

Diese Arbeit zeigt, in-situ-Charakterisierung von Protein Biomolekülen in der wässrigen Lösung in dem Liquid Vacuum-Schnittstelle des Systems für die Analyse unter Verwendung von (SALVI) und Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). Die Fibronektin Proteinfilm wurde auf dem Siliziumnitrid (SiN), die die Membran immobilisiert SALVI Erfassungsbereich bildet. Während ToF-SIMS-Analyse wurden drei Arten der Analyse durchgeführt, einschließlich hoher räumlicher Auflösung Massenspektrometrie, zweidimensionale (2D) Bildgebung und Tiefenprofilierung. Massenspektren wurden im positiven und negativen Modus erworben. Entionisiertes Wasser wurde als Referenzprobe analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fibronektin Film in Wasser hat deutlicher und stärker Spitzen Wassercluster zu Wasser allein verglichen. Charakteristische Peaks von Aminosäure-Fragmente sind ebenfalls zu beobachten in der hydratisierten Protein TOF-SIMS-Spektren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Proteinmolekül Adsorption an einer Oberfläche dynamica sucht werden könnenlly Verwendung SALVI und ToF-SIMS in der flüssigen Umgebung zum ersten Mal.

Einige repräsentative Ergebnisse sind die Vorteile des vorgeschlagenen Protokolls zu demonstrieren. Durch die Verwendung der Mikrofluid-SALVI Schnittstelle der Primärionenstrahl (Bi 3 +) auf dem hydratisierten Film Fibronektin in DI Wasser direkt bombardieren. So ist die molekulare chemische Kartierung der Flüssigkeitsoberfläche erfolgreich erworben werden kann. 1a und 1b zeigen die positive TOF-SIMS-Massenspektren des hydrierten Fibronektin Film und DI-Wasser auf. Die Peaks von Interesse, einschließlich Wassercluster (dh, m / z 19, 37, 55, 73, 91 und 109) und Aminosäure-Fragmente (dh, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 und 98) werden durch die roten Pfeile angedeutet. Zusätzlich zu den charakteristischen Peaks von Aminosäure-Fragmente, die allgemein mit trockener Proteinproben berichtet worden sind, werden die Peaks von Wassercluster in der beobachteteMassenspektren von hydrierten Fibronektin Film in DI-Wasser. Darüber hinaus sind die Intensitäten dieser Wassercluster Spitzen sehr verschieden von denen in den Massenspektren von DI-Wasser. Dieses Ergebnis liefert den direkten Beweis für das Eigentum von Wassermolekülen umgeben und innerhalb der hydratisierten Proteinmoleküle, die eine Rolle in ihrer Adsorption auf einer Oberfläche spielen. 2a zeigt das Tiefenprofil Zeitreihe des hydratisierten Fibronektin Film und DI-Wasser. Wenn die Probe unter dem SiN-Membran ist, werden die Intensitäten der ausgewählten zweiten Ionen vernachlässigbar sind, bevor der SiN-Membran durchstanzt (dh 280 sec für Fibronektin und 340 sec für DI Wasser). Sobald die SiN-Membran durchstanzt wird, erhöhen sich die Intensitäten dieser Sekundärionen signifikant. Wenn die lange Impulsbreite verwenden, ist die Massenauflösung relativ gering. Daher ist die kurze Impulsbreite Verfahren zur Gewinnung von Daten mit einer besseren Massenauflösung verwendetfür Bild und Spektrum Rekonstruktionen, wie in Figur 2a markiert. Nach einem Zeitraum (dh 60 sec für Fibronektin und 220 sec für DI-Wasser) wird das reduzierte Impulsbreite verwendet, um m / z Spektren mit besseren Massenauflösung erhalten. Die endgültigen m / z-Spektren wurden von 200 sec Messungen rekonstruiert grün hervorgehoben schattierten Bereiche im Tiefenprofil zeitliche Serie. 2B zeigt die 2D-Bilder aus dem hydratisierten Fibronektin Film und DI-Wasser, die in 2a zu dem grünen schraffierte Fläche entsprechen. Diese 2D-Bilder stellen die Grafen von ausgewählten Sekundärionen aus der Probe: je heller das Bild, desto höher ist die Sekundärionenzahl. Solche intuitive Bilder geben einen klaren Vergleich ausgewählter Sekundärionen zwischen verschiedenen Proben, die in der Datenanalyse nützlich ist. Nach unseren Erfahrungen, ändert sich der Unterschied in der SiN Punch-Through-Zeit von Charge zu Charge des SiN-Membranen. Allerdings hat dies keine Auswirkungen der WiederErgebnisse des dynamischen TOF-SIMS-Analyse. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53708/53708fig1.jpg" /> Abbildung 1: Vergleich des ToF-SIMS positive Spektren des hydratisierten Fibronektin Film und DI-Wasser in den SALVI Mikrokanal (a) Das rekonstruierte m / z-Spektrum von Fibronektin.. (B) Die DI-Wasser-Spektrum. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53708/53708fig2.jpg" /> Abb. 2: Tiefenprofile und 2D-Bilder aus hydriertem Fibronektin und DI-Wasser (a) Die Tiefenprofilierung Zeitreihe von Fibronektin und DI-Wasser im positiven Modus. (B) 2D-Bilder rekonstruiert grünen entsprechenden schattierten 200 sec Zeitsegmente entlang der Tiefenprofil Zeitreihe in (a). Mehrere charakteristische Massenverhältnisse von Bedeutung für Wassercluster zu laden(ZB m / z 1, 19, 37, 55) werden neben bekannten Aminosäure Fragmente gezeigt (zB m / z 30, 83, 98). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53708/53708fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Flüssigkeitshandhabung und Probenaufgabe zu einem Mikrokanal zur in situ-Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Analyse von Protein Biomolekülen in einer wässrigen Lösung.

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

in-situ-characterization-hydrated-proteins-water-salvi-tof

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

8.2K Aufrufe.  Pacific Northwest National Laboratory.  Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Flüssigkeitshandhabung und Probenaufgabe zu einem Mikrokanal zur in situ-Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Analyse von Protein Biomolekülen in einer wässrigen Lösung. 

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Forschung

Krebsforschung

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the time-profile volume and enthalpy changes of light induced conformational changes in proteins on microsecond to millisecond time-scales that are not accessible using traditional stop-flow instruments. In addition, since overall changes in volume and/or enthalpy are probed, these techniques can be applied to proteins and other biomacromolecules that lack a fluorophore and or a chromophore label. To monitor dynamics and energetics of structural changes associated with Ca2+ binding to calcium transducers, such neuronal calcium sensors, a caged calcium compound, DM-nitrophen, is employed to photo-trigger a fast (&#964; &#60; 20 &#956;sec) increase in free calcium concentration and the associated volume and enthalpy changes are probed using photothermal beam deflection technique.

Here we report an application of the photothermal beam deflection technique in combination with a caged calcium compound, DM-nitrophen, to monitor microsecond and millisecond dynamics and energetics of structural changes associated with the calcium association to a neuronal calcium sensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator.

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Chemie

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using conventional synthesis techniques. Coupling soft landing with in situ characterization using secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS) enables analysis of well-defined surfaces under clean vacuum conditions. The capabilities of three soft-landing instruments constructed in our laboratory are illustrated for the representative system of surface-bound organometallics prepared by soft landing of mass-selected ruthenium tris(bipyridine) dications, [Ru(bpy)3]2+ (bpy = bipyridine), onto carboxylic acid terminated self-assembled monolayer surfaces on gold (COOH-SAMs). In situ time-of-flight (TOF)-SIMS provides insight into the reactivity of the soft-landed ions. In addition, the kinetics of charge reduction, neutralization and desorption occurring on the COOH-SAM both during and after ion soft landing are studied using in situ Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)-SIMS measurements. In situ IRRAS experiments provide insight into how the structure of organic ligands surrounding metal centers is perturbed through immobilization of organometallic ions on COOH-SAM surfaces by soft landing. Collectively, the three instruments provide complementary information about the chemical composition, reactivity and structure of well-defined species supported on surfaces.

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of novel materials. Coupled with analysis by in situ secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS), soft landing provides unprecedented insights into the interactions of well-defined species with surfaces.

In-situ-SIMS und IR-Spektroskopie von gut definierten Oberflächen durch weiche Landung der Messe-Ionen ausgewählt Vorbereitet

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Beurteilung der bordotierten Diamantelektrode Qualität und Anwendung auf<em&gt; In-situ-</em&gt; Änderung des Local pH durch Elektrolyse von Wasser

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Biochemie

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

In-situ-SIMS und IR-Spektroskopie von gut definierten Oberflächen durch weiche Landung der Messe-Ionen ausgewählt Vorbereitet

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine mit hydrophober Pigments

Beurteilung der bordotierten Diamantelektrode Qualität und Anwendung auf

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Physiologische Herstellung von Haarzellen aus dem Sacculus der American Bullfrog (

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

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Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

In-situ-SIMS und IR-Spektroskopie von gut definierten Oberflächen durch weiche Landung der Messe-Ionen ausgewählt Vorbereitet

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Beurteilung der bordotierten Diamantelektrode Qualität und Anwendung auf

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Physiologische Herstellung von Haarzellen aus dem Sacculus der American Bullfrog (

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine mit hydrophober Pigments