This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.

Alle Tierprotokolle wurden überprüft und durch die Animal Care und Use Committee an der University of South Carolina (Sicherung Nummer: A3049-01) zugelassen. 1. Low-Density-embryonale neuronale Kultur <ol><li> Vorbereitung für die primäre kortikale Neuronen Kultur <ol><li> Lösungen: <ol><li> Bereiten Poly-L-Lysin-Stammlösung durch Auflösen von 5 mg Poly-L-Lysin in 10 ml Boratpuffer. </li><li> Bereiten Arbeitslösung durch Verdünnen von 1 ml Poly-L-Lysin-Lager auf 49 ml Boratpuffer. </li><li> Bereiten Boratpuffer, pH 8,4, indem sie mit 395 ml dH 2 O beginnt und dann Zugabe aller Bestandteile (1,24 g Borsäure + 1,9 g Borax). Der pH-Wert auf 8,4 bis 1 M NaOH. Passen zu 400 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li><li> Bereiten HBSS-Lösung, pH 7,2, indem sie mit 445 ml dH 2 O beginnt und das Hinzufügen alle anderen Zutaten (50 ml 10X HBSS Auf + 1,2 g HEPES). Der pH-Wert auf 7,2 mit 1 N HCl, bring bis 500 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li><li> Bereiten Plattenmedium: DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li><li> Bereiten komplette Wachstumsmedium: Zu 50 ml Neurobasalmedium, fügen Sie die Ergänzungsmittel (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glucose + 1 ml B-27 (50x) + 500 ul Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100X) + 100 ul 7,5% Natriumbicarbonat. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li></ol></li><li> Zwei Tage vor Kultur: <ol><li> Mantel zwölf 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml Poly-L-Lysin-Arbeitslösung, und halten unter der Haube O / N. </li></ol></li><li> Einen Tag vor Kultur: <ol><li> Leere Beschichtungsmittel aus den Schalen und spülen mit ddH 2 O. Lassen Gerichte für eine Stunde unter der Motorhaube zu trocknen. </li><li> Bereiten Plattenmedium (DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (10% der Gesamtlösung). Pipette 2 ml Medium injedes Gericht, und O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. Hinweis: Es ist wichtig, Kunststoff-Kulturschalen zu vermeiden, wenn die Kultivierung. Die Verwendung von Glasbodenschalen (für inverse Mikroskope) oder Deckgläser (für aufrechte Mikroskope) liefert scharfe und klare Bilder. Im Vergleich zu einem Kunststoff-Bodenschale, die Glasbodenschale verhindert unerwünschte Farbtöne oder Blendung während der Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol></li></ol></li><li> Zellkultur-Protokoll: <ol><li> Put gekühlt HBSS Puffer (100-150 ml), 100 mm-Petrischalen, Pinzetten, Scheren, 50 ml-Röhrchen und 15-ml-Röhrchen unter UV-Licht in der Haube. </li><li> Euthanize trächtigen Ratten mit tödlichen Einatmen von 5% Sevofluran unter der Haube außerhalb von Kulturraum. </li><li> Sterilisieren mit 70% EtOH, Zelt der Haut der Unterleib einer Pinzette, während aus dem Schwanz Zerschneiden in der Mitte der Bauch cavity.Open die Gebärmutter einer Schere, die Plazenta zu belichten. </li><li> Entfernen 8-10 E18 Föten. Place 8-10 Föten in Petrischalen mit HBSS-Lösung. </li><li> Halten Sie die Rückseite des Kopfes des Fötus mit einer Pinzette, dann mit einer Schere den Kopf vom Körper zu trennen. Legen Sie sie in eine andere Petrischale gefüllt mit 7.5 ml HBSS. Übertragen Gericht Kapuze. </li><li> Füllen Sie zwei weitere 100-mm-Petrischale mit kaltem HBSS. </li><li> Peel beiseite Schädel, und Schaufel Gehirn in eine neue Petrischale mit HBSS gefüllt. </li><li> Scharfe gebogenen Pinzette, separater Kleinhirn und Hirnstamm aus Gehirn, dann übertragen Gehirn auf eine neue Petrischale mit kaltem HBSS darin. </li><li> Verwenden einer Pinzette zu sichern, trennen Sie die Halbkugeln mit einer gebogenen Pinzette. Entfernen Hirnhaut; isolieren frontalen Kortex und Transfer Stücke in markierte 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Füllen Sie die 15-ml-Röhrchen mit frischem 2 ml HBSS und fügen Sie 20 ul Trypsin-EDTA (10x konzentrierte Mischung mit 0,5% Trypsin und 5,3 mM EDTA.) Zu jedem 15-ml-Tube. </li><li> Inkubieren 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. Sanft Rohr alle paar Minuten wirbeln, erlauben nicht nieder. </li><li> After 10-15 min, Pipette Verwendung Glas alt HBSS und spülen Sie zweimal mit neuen HBSS zu entfernen. </li><li> Tauchen Sie ein in Trypsin-Inhibitor (1 mg / ml, 2 mg Trypsin-Hemmstoff in 2 ml HBSS), gut mischen und lassen Sie es 5 Minuten sitzen. Zweimal waschen mit frischem HBSS. </li><li> Mit Glaspipette mit Gummiball, verreiben Gehirn Stücke 10-15 mal sehr langsam, so dass bubbles.Triturate wieder mit einem kalibrierten Pipette und eine sterile Spitze mit einer reduzierten Spitzendurchmesser sehr langsam, bis sie homogen zu vermeiden. </li><li> Transfer dissoziierten Zellen auf gewünschte Dichte vorzunehmen vorbereitet beschichteten Kulturschalen (50 Zellen / mm 2). O / N bei 37 ° C, 5% CO2 inkubiert. </li><li> Nach 24 Stunden DMEM / F12-Medium mit frisch zubereiteten kompletten Wachstum Serum-freien Neurobasalmedium ersetzen. </li><li> Pflegen der Zellen zu allen Zeiten in einem 5% CO 2/95% Raumluft befeuchteten Inkubator für mindestens 12-14 Tage vor dem Experiment. Ergänzen Sie die Zellen alle 5-6 Tage mit frischem Neurobasalmedium etwa 50% der alten Medium zu ersetzen. </li></ol></li></ol> 2. Fluoreszenzmarkierung und Immunzytochemie Hinweis: Die Immunfluoreszenz-Markierung von primären kortikalen Zellkulturen wurden in Glasboden 35 mm Zellkulturschalen mit einem Arbeitsvolumen von 1 ml durchgeführt. <ol><li> Waschen Sie die Glasbodenschale zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS). </li><li> Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit PBS und permeabilisieren mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min. </li><li> Behandlung von Zellen für 20 min bei RT mit einem F-Actin-spezifischen Farbstoffs, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40 25 ul Phalloidin in 1 ml PBS). </li><li> Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Blockieren mit 10% normalem Ziegenserum bei RT für 1-2 Std. </li><li> Verdünnen Sie das Huhn polyklonalen anti-MAP2 Antikörper (1: 2500) in PBS mit 2% normalem Ziegenserum und Inkubation O / N bei 4 o C </li><li> Nach der Inkubation spülen zweimal in PBS. </li><li> Verdünnen Sie die Sekundär-Antikörper (Alexa Red 594-konjugiertem Ziege-anti-Huhn-IgG (1: 500) mit 2% normalem Ziegenserum und 2 h bei RT inkubiert. </li><li> Spülen mit PBS und fügen Sie 10 ul / Schale von Hoechst-Farbstoff. </li><li> Inkubieren 3 min bei RT und waschen mit PBS zweimal. Hinweis: Die jetzt markierten Zellen bereit für Schritt 3 (F-Actin puncta Zählung). </li><li> Preserve Zellprobe mit 100 ul Antifade-Reagenz als Eindeckmittel und halten bei 4 ° C im Dunkeln für langfristige Lagerung. Anmerkung: Phalloidin ist relativ stabil in PBS bei +4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Woche und Fluoreszenz kann mit Antifade Eindecken Reagenzien konserviert werden. Allerdings sind optimale Bilder von 1-3 Tagen nach der Färbung erhalten seit Phalloidin kann mit längerer Lagerung zu diffundieren beginnen. </li></ol> 3. F-Aktin Puncta Zählen <ol><li> Schalten Sie Fluoreszenzmikroskop und wechseln Sie in 20 × Ziel. Offene Mikroskop-Software und Programm bei 1280 × 960 Pixel Bildgröße einrichten und 0,17 um / Pixel Bildauflösung bei 1-facher Zoom. </li><li> Erwerben Sie Bilder von Co-markierten F-Actin / MAP2 Neuronen unter Grün (495 nm) / Rot (613 nm) Fluoreszenz-Kanäle. </li><li> Wählen Sie 5 Green (F-Actin) / Rot (MAP2) immun / Blue (Hoechst) Fluoreszenzbilder der einzelnen Neuron mit klar definierten dendritischen Dornen. </li><li> Identifizieren Sie die F-Actin reichen Strukturen in zweiter Ordnung dendritischen Segment (Längenbereich von 25 bis 75 &amp; mgr; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz. </li><li> Drehen Sie den ausgewählten Bereich der Bilder auf einer horizontalen Ebene. Kopieren und Einfügen als neues Bild. </li><li> Ziehen Sie den Hintergrund der Bilder, eine konsistente Einstellungen für jedes Gericht verwenden. </li><li> Zählen Sie die hellgrüne F-Actin puncta und Spuren die Länge der ausgewählten dendritischen Segment manuell durch geschultes unabhängige Beobachter. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei. </li><li> Berechnen der Dichte durch Dividieren Gesamt F-Aktin gekennzeichnet puncta (N) durch die Länge (L) der MAP2 Dendriten bezeichnet. Express-Daten als Anzahl von F-acZinn puncta pro 10 &amp; mgr; m von Dendriten Anmerkung: Puncta (Größe ≤1.5 um) von F-Actin-Fluoreszenz mit einer Spitzenintensität von mindestens 50% über dem durchschnittlichen Intensität der Färbung in den dendritischen Welle wurden in jedem ausgewählten dendritischen Segment enthalten. </li></ol>

<ol>
	<li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses.">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572 (2012).</li><li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters.">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li><li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation.">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li><li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines.">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li><li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities.">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li><li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin.">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li><li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat+protein+variants:+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury.">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure:+neurorestoration+by+phytoestrogens.">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li><li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration.">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li></ol>

None of the authors have conflicts of interest to declare.

In diesem Protokoll beschreiben Züchten wir Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns Dendriten von einzelnen Neuronen zu identifizieren. Als nächstes benutzen wir Phalloidin und MAP2 Färbung zu dendritischen Änderungen erkennen. Dann haben wir spezialisierte Software-Änderungen in F-Actin puncta zu quantifizieren. Um Änderungen in F-Aktin puncta bestimmen, muss das gesamte neuronale Netzwerk eines einzelnen Neurons deutlich sichtbar, ermöglicht diese Auswahl entsprechender zweiter Ordnung dendritischen Segmente aus einem einzelnen Neuron. Low-Density-Überzug ist kritisch, um sowohl an einzelnen Neuronen visualisieren sowie das Vorhandensein von Gliazellen zu minimieren. Astrozyten enthalten auch F-Actin und ohne neuronalen Marker könnte die Analyse von F-Actin positive puncta verwechseln. Low-Density-Kulturen und die Verwendung von Neurobasal Medium sind nützlich in Astrozyten Proliferation in den Zellkulturen zu verringern. Allerdings ist die Einschränkung, dass die F-Aktin-Protein gegeben istnicht spezifisch für Neuronen spezifische neuronale Proteinmarker, wie beispielsweise MAP2, sollten zusammen mit Phalloidin verwendet werden. Andere Protein-Antikörper können auch in Verbindung mit Phalloidin wie TH (Tyrosinhydroxylase) zur Identifizierung von spezifischen neuronalen Populationen in Kultur verwendet werden. Eine allgemeine Technik für Synapsen und synaptische Morphologie des Studiums ist Immunzytochemie (ICC). ICC populär ist, da viele Antikörper für synaptische Proteine ​​leicht verfügbar sind, einschließlich PSD 95, NMDAR (post-synaptischen) sowie Synaptophysin, Fagott und Synapsin I (präsynaptischen) 11. Allerdings sind einige Strukturen nicht durch ICC erkannt werden (wie dünne Filopodien), sondern eine Kombination von F-Actin Phalloidin Kennzeichnung mit den Antikörpernachweis (oder Doppelmarkierung mit zwei verschiedenen Antikörpern) kann für spezifische und komplexe Untersuchung der synaptischen Subpopulationen und unterschiedlichen Reaktionen auf experimentelle Behandlungen ermöglichen. F-Actin puncta kann partic seinders empfindlich auf experimentelle Behandlungen. Wir berichteten kürzlich, dass die Behandlung mit HIV-1 Tat-Proteins eine Abnahme der F-Actin puncta (24 h) vor jeder Evidenz für offene neuronalen Tod hergestellt (48 h) 10. Es ist bemerkenswert, dass experimentelle Behandlungen entweder ansteigen (Memantin) oder verringern (Methamphetamin + HIV-1-Tat) F-Actin puncta. Wir fanden auch, dass F-Actin puncta Verlust einer reversiblen Reaktion folgenden spezifischen experimentellen Behandlungen ist 10. Als solches ist F-Aktin puncta Quantifizierung ein wertvolles Werkzeug zur Überwachung nicht nur akute Synaptopathie, sondern auch synaptische Rückgewinnung und experimentellen neurorestoration Verfahren zu studieren.

Das primäre Ziel dieser Studie ist es, eine zuverlässige Methode zur Messung (Schätzung) der synaptischen Integrität der neuronalen dendritischen Netzwerk zu entwickeln. Hier beschreiben wir die Quantifizierung von F-Actin puncta in primären Ratten kultivierten Neuronen eine Kombination von Phalloidin-Färbung verwendet und immunzytochemische (ICC) Erkennung von Dendriten mit anschließender Analyse mit speziellen (NIS-Elements) Software. Markierten Phallotoxine haben ähnliche Affinität für sowohl große als auch kleine Filamente (F-Actin), aber binden nicht an monomeren globulären Actin (G-Actin), im Gegensatz zu einigen Aktin Antikörper 1. Die unspezifische Bindung von Phalloidin vernachlässigbar ist, so minimal Hintergrund während der zellulären Bildgebung bietet. Phalloidin ist viel kleiner als Antikörper, die normalerweise verwendet werden würde zelluläre Proteine ​​für Fluoreszenzmikroskopie zu kennzeichnen, die durch Phalloidin für viel intensiver Markierung von F-Aktin ermöglicht. So detaillierte Bilder von F-Actin-Lokalisierung in Neuronen seindurch die Verwendung von markiertem Phalloidin erhalten. Phalloidin (F-Actin) Färbung der neuronalen Dendriten erzeugt diskrete &quot;Hot Spots&quot; oder hell &quot;puncta&quot;, die eine Vielzahl von dendritischen Strukturen darstellen, einschließlich reifen Stacheln, nicht stachelig Synapsen 2 und unreif Stacheln. Unreife Stacheln sind dünn Filopodien und einige Formen von Patch-Morphologie und kann die Einleitung spinogenesis 3 darstellen. Unreife Stacheln und nicht stachelig Patches fehlen PSD95 4. Veränderungen in der Produktion von F-Aktin führen zu Änderungen in nachfolgenden nicht nur Stacheln sondern auch zusätzliche dendritischen Strukturen, wodurch Phalloidin ein wichtiges Werkzeug für synaptodendritic Integrität 5-7 untersucht. In der Regel Zahlen von Phalloidin-positive (F-Actin) puncta reflektieren ein Gleichgewicht unter den aktiven Synapsen (erregenden und hemmenden), Aktindynamik und Synapse Stabilität 8. Zwar ist es wichtig, spezifische t zu studierenypen von Synapsen (dh exzitatorischen Stacheln), wenn das Ziel der Behandlung ist es notwendig, nicht bekannt ist, zuerst die allgemeine Integrität einer Vielzahl von dendritischen Strukturen schätzen. Da F-Aktin ist eine Hauptkomponente von dendritischen Dornen und anderen Strukturen, einschließlich hemmende Synapsen, einer veränderten Anzahl von F-Aktin puncta eine Synaptopathie hinweisen. Diese Synaptopathie kann dann weiter für mehr spezifische Veränderungen untersucht werden. Unsere Quantifizierungsmethode mehrere synaptischen Arten / Strukturen zum Nachweis ergibt eine Gesamtschätzung von dendritischen synaptischen Veränderungen (Zunahmen und Abnahmen) nach verschiedenen experimentellen Behandlungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass</td>
			<td style="width:155px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:121px;">P35G-1.5-20-C</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">10565-018</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:211px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">15400-054</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P9155</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:211px;">Boric acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B0252</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:211px;">Borax</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B9876</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">35050-061</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">101174Y</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:211px;">HBSS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H4641</td>
			<td style="width:139px;">10X</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">21103-049</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">17504-044</td>
			<td style="width:139px;">50X</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td style="width:155px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">30004CI</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">25080</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Vannas Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500086</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500216</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Iris Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">15914</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:211px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14097</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14095</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:211px;">ProLong Gold</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">P36930</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P6148</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">Cover glass</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">631-0137</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">AlexaFluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A12379</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">26050-070</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">Chicken polyclonal anti-MAP2</td>
			<td style="width:155px;">abcam</td>
			<td style="width:121px;">Ab92434</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A11042</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">R37605</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:211px;">NIS-Elements software package</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:211px;">Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:211px;">0.2 &#956;m Nalgene nylon membrane filter</td>
			<td style="width:155px;">Fishersci</td>
			<td style="width:121px;">151-4020</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of filamentous actin (f-actin) puncta in rat cortical neurons

Filamentösen Aktin-Protein (F-Actin) spielt eine wichtige Rolle in spinogenesis, synaptischer Plastizität und synaptischen Stabilität. Änderungen in dendritischen F-Actin-reichen Strukturen deuten darauf hin, Veränderungen der synaptischen Integrität und Konnektivität. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Kultivierung von primären Ratten-kortikalen Neuronen, Phalloidin-Färbung für F-Actin puncta und anschließende Quantifizierung Techniken. Zuerst werden die frontalen Kortex von E18-Rattenembryos dissoziiert in Low-Density-Zellkultur, dann die Nervenzellen in vitro gezüchtet mindestens 12-14 Tage. Folgenden experimentellen Behandlung werden die kortikalen Neuronen gefärbt mit AlexaFluor 488 Phalloidin (die dendritische F-Aktin puncta zu markieren) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2; die neuronalen Zellen und dendritischen Integrität zu validieren). Schließlich wird spezielle Software zu analysieren und zu quantifizieren zufällig ausgewählten neuronalen Dendriten verwendet. F-Actin reichen Strukturen sind auf zweiter Ordnung dendritischen Verzweigungen (Längenbereich 25-75 identifiziert &amp;# 181; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz. Das Protokoll hier vorgestellt wird eine nützliche Methode zur Untersuchung von Veränderungen in dendritische Synapse Strukturen im Anschluss an experimentellen Behandlungen.

In den vorliegenden Verfahren haben wir zunächst Kultur Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns die Dendriten der einzelnen Neuronen zu identifizieren. In 1 zeigt das Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder, um die morphologischen Veränderungen an den Tagen fötalen Ratte kortikalen Neuronen Entwicklungs 4, 6, 10, 14, 21 und 27 in vitro. Beachten Sie, dass die Länge und Anzahl der Dendriten erhöhen mit der Reifung von kultivierten Ratten primären Neuronen. Neuronen sind nur nach 14 Tagen Reifung in Experimenten verwendet. Um dendritische und synaptische Veränderungen erfassen, kombinieren wir die Phalloidin F-Actin-Kennzeichnung mit MAP2 Antikörper-Nachweis von Dendriten. Da Phalloidin Markierung von F-Aktin ist sehr schnell (20-30 min), ist es möglich, visuell die Integrität synaptodendritic Netz abzuschätzen, bevor mit ICC Antikörpermarkierung (Abbildung 2 fortfahren </strong&gt;). MAP2 zeigt die intakte Dendriten und liegt über der Phalloidin-Färbung. Dies ermöglicht die Bestätigung, dass das F-Actin puncta auf neuronalen Dendriten befinden und nicht an andere Zellen lokalisiert, wie beispielsweise Astrozyten. Als nächstes erwerben wir hochauflösende Bilder von Co-markiertem Phalloidin (F-Actin) / MAP2 Neuronen und zufällig ausgewählten Nervenzellen untersucht. Feine Filopodien, Wirbelsäule Vorsprünge und F-Actin Patches wurden als F-Actin-reichen Strukturen und wurden in unseren Studien (Abbildung 3) enthalten. Segmente der zweiten Ordnung Dendriten (MAP2 positiv) wurden für die Analyse von F-Actin puncta Dichten ausgewählt. MAP2 positive Färbung verwendet, um den neuronalen Lokalisierung des F-Actin puncta zu bestätigen. Computergestützte Erkennung und Zählung von Phalloidin (F-Actin) markiert (grüne Fluoreszenz-Kanal) synaptischen puncta wurde durch den Einsatz von spezieller Software durchgeführt. Es ist ein Schritt für Schritt detaillierte Protokoll in Abbildung 4 </strong&gt; Beschreibung der Verwendung des Softwarepakets. Wir haben zwischen zwei geschulten Beobachtern in F-Aktin puncta zählt F-Aktin Zählung sehr gut mit manuelles Zählen von F-Aktin korreliert und dass die Interkorrelations Beobachter computergestützten ist sehr hoch (r 2 = 0,97), daß. Zuvor verwendeten wir Quantifizierung von F-Aktin puncta synaptodendritic Verletzung beurteilen, induziert durch HIV-1-Tat-9 und Erholung von HIV-1 Tat-induzierte Synaptopathie 10. In Abbildung 5 wurden Ratte kortikalen Neuronen-co markiert mit Phalloidin und MAP2 Antikörper nach 50 nM HIV-1-Tat-Behandlung. MAP2 Färbung ergab weniger dendritische Zweige und verminderte F-Actin folgenden HIV-1-Tat-Behandlung. Wir fanden, dass F-Aktin puncta kann entweder Anstieg oder Abfall in Reaktion auf experimentelle Behandlungen. In 6 wurden kultivierten Neuronen mit th behandeltene wettbewerbsfähig NMDA-Rezeptor-Antagonist Memantin, nimmt stark zu F-Actin-positiven puncta. Dagegen führte die Behandlung mit einer Kombination von Methamphetamin + HIV-1-Tat führte zu signifikanten Verlust an F-Aktin puncta. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fetal Ratte kortikalen Neuronen in der Zellkultur Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bilder von fetalen Ratte kortikalen Neuronen zwischen 4 -. 27 Tage in vitro (20X). Neuronen erscheinen reifen nach 14 Tagen in vitro. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig2.jpg" /> Abbildung 2. Phalloidin / MAP2 Co-Kennzeichnung in Ratte kortikalen Neuronen. Kultivierten Neuronen mit MAP beschriftet2-Antikörper (rot) und Phalloidin (grün). Zusammengeführt Bilder ermöglichen die Bestimmung, dass die Phalloidin-Färbung zu neuronalen Dendriten lokalisiert ist (20X). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig3.jpg" /> Abbildung 3. F-Actin synaptischen Strukturen der Ratte kortikalen Neuronen. (A) Linke - F-Actin-positiven Strukturen mit Phalloidin (60X) markiert. Die Pfeilspitzen zeigen F-Actin-markierten Strukturen umfassen Pilz Stacheln (lila), pflasterartigen Morphologie (blau) und lange Filopodien (orange). Mitte - Fusionsbild diese F-Actin-Strukturen demonstriert werden lokalisiert Dendriten (20X). Rechts - Box in der rechten unteren zeigt die zweite dendritischen Verzweigung, um für die Analyse ausgewählt (20X) (B) Dendritische Segmente von Phalloidin (F-Actin) (Grün) / MAP2.<html> (Rot) co-markierten kortikalen Neuronen (20x) werden verwendet, um neuronalen Ursprungs von F-Aktin puncta verifizieren. Die grüne nur Bild (Phalloidin / F-Actin) weiterverarbeitet wird. (C) Phalloidin / F-Aktin (grün) Bilder von drei dendritischen Segmente für puncta Zählen ausgewählt. Dichten errechnet sich, indem N / L bestimmt. N = Anzahl der puncta, L = Länge der dendritischen Segment. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig4.jpg" /> Abbildung 4. Demonstration der Software-Paket. Schritt für Schritt Anleitung <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> /53697fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. HIV-1-Tat synaptodendritic Verletzung in Ratten kortikalen Neuronen vermittelt. Die Zellkulturen wurden co-gefärbt F-Actin und MAP2 nach HIV-1-Tat-Protein-Behandlung (50 nM). Ober Panels- unbehandelten Neuronen zeigt robuste F-Actin, komplexe Verzweigungsmuster und umfangreiche Fein neuronalen Prozesse. Niederplatten - HIV-1-Tat-Protein behandelt Neuronen mit verminderter F-Actin und verringert dendritischen Verzweigung. (20x) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig6.jpg" /> Abbildung 6. F-Actin puncta in Ratte kortikalen Neuronen. Unterschiedliche Wirkungen von Memantine gegen Methamphetamin + Tat Behandlung Images (20X) von unbehandeltem kultivierten Neuronen, Neuronen, behandelt mit Memantine (10 uM) und Neuronen mit Methamph behandeltEtamine (20 uM) 10 nM von Tat (10 nM). Memantine Behandlung erhöhte sich die F-Actin-Färbung, während Methamphetamin + HIV-1-Tat-Behandlung F-Actin-Färbung verringert und dendritischen Verzweigung verringert. Memantin-Behandlung deutlich erhöht F-Actin puncta Dichte, bezogen auf unbehandelte Kontrollkulturen. Im Gegensatz dazu verringert Methamphetamin + HIV-1-Tat-Behandlungen signifikant F-Aktin puncta Dichte, bezogen auf unbehandelte Kontrollkulturen. Mittelwert + SEM, * p &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

12.0K Aufrufe.  University of South Carolina. Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Serie: Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

Labeling F-Aktin Barbed Endet mit Rhodamin-Aktin in permeabilisierten Neuronale Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...