Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08 NS061039-01A2, The Program für Neurologie Forschung &#38; Entdeckung und A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Dabei verwendet die Morphologie und die Bild-Analyse-Kern des Michigan Diabetes Research Center, finanziert durch das National Institute of Health Grant 5P 90 DK-20572 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen. Die Autoren möchte J. Robinson Singleton und A. Gordon Smith (University of Utah) danken, für ihre großzügige Spende von menschlichen Hautproben.

Haut Stanzbiopsien stammen aus Themen, die von einem großen Community-basierte Erstversorgung Netzwerk an der University of Utah Diabeteszentrum (Salt Lake City, UT) rekrutiert wurden. Diese Studie wurde von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt und erfüllt mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Schriftliche Einwilligung eingeholt wurde, aus jedem Fach vor dem Test.
 1. Fluoreszenz Immunohistochemistry <ol><li>Prepare Stanzbiopsien für Intraepidermal Nervenfaser Immunohistochemistry: <ol><li>Perform 3 mm Haut Biopsien durch medizinisches Personal und die gesamte Biopsie in 1,5 mL Zamboni &#39; s Fixativ Lösung (2 % Paraformaldehyd, 0,3 % gesättigt Pikrinsäure in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) bei 4 ° C über Nacht.</li>
		<li>Spülen Proben mit einer Lösung von 30 % Saccharose mit PBS-Puffer bei 4 ° C für 16-24 h oder bis die Probe sinkt.</li>
		<li>Embed Proben in optimale Arbeitstemperatur Verbindung (OCT) mit einem Cryomold. Legen Sie die ganze 3 mm-Biopsie mit der Epidermis nach unten in die Form und füllen Sie den Schimmel mit etwa 2 mL Okt. Freeze der Schimmel auf zerstoßenem Trockeneis. Shop bei-80 ° C bis zum Gebrauch.</li>
		<li>Cut 50 µm Dicke Querschnitte mit einem Kryostaten und speichern in einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 180 µL Frostschutzmittel Speicherlösung pro Bohrloch (30 % Ethylenglykol, 30 % Glycerin in PBS). Die folgenden Anweisungen sind für 8 Brunnen von einer 96-well-Platte. Flecken auf Abschnitte von jedem Standort der Biopsie, die 200-300 µm voneinander entfernt sind.</li>
	</ol></li></ol> Tag 1: <ol start="2"> <li>unspezifische Kennzeichnung des Stratum corneums zu stillen: <ol><li>Etikett 96-Well-Platte wie in Abbildung 1 gezeigt.</li>
		<li>Lager Signal Enhancer Lösung, um unspezifische Bindung der Sekundärantikörper 34 , 35 in jede Vertiefung Pipettieren 150 µL. Abschnitte in Signal-Enhancer-Lösung mit einer Impfkeimen Schleife übertragen. 
		Hinweis: Achten Sie darauf, während der Arbeit mit dem Gewebe beschädigen oder reißen die Gewebeschnitte zu vermeiden. Halten Sie in Signal-Enhancer-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker.</li>
		<li>Vorbereiten spülen Brunnen in den Zeilen 2 und 3 des 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung.</li>
		<li>Abschnitte sorgfältig in Zeile 2 und Spülen mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur übertragen.</li>
		<li>Spülen ein zweites Mal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (Zeile 3).</li>
	</ol></li> <li>5 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert Lösung vorbereiten: <ol><li>bereiten 5 % Lösung, die 5 % BSA enthält blockieren und 0,3 % Triton X 100 (TX-100) in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 1) während der Abschnitte sind Inkubation Signal-Enhancer-Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie blockierende Brunnen in Zeile 4 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 5 % BSA Lösung in jedem Bohrloch blockieren.</li>
		<li>Abschnitte in individuelle Vertiefungen von 5 % BSA Lösung blockiert und inkubieren Sie Abschnitte in 5 % BSA Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker blockieren.</li>
	</ol></li> <li>1 % BSA Spülung Lösung und Verdünnung der Primärantikörper vorbereiten: <ol><li>bereiten Sie 1 % Spüllösung, die 1 % BSA und 0,3 % enthält TX-100 in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 2) während der Abschnitte sind Inkubation in 5 % BSA blockierende Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.</li>
		<li>Verdünnen Primärantikörper in 1 % BSA Spüllösung während Abschnitte in 5 % BSA blockierende Lösung brüten sind.
		<ol><li>1.500 µL Primärantikörper Lösung machen und fügen Sie jeweils gut in Zeile 5.</li>
			<li>Verdünnen die primären Antikörper: verwenden Sie das Nerven-spezifische Beschriftung, Kaninchen polyklonale Anti-Protein Genprodukt 9.5 (PGP9.5) auf 1:1 000. Verwenden Sie die Mitochondrien-spezifische Bezeichnung, Maus monoklonalen Anti-Pyruvat-Dehydrogenase E2/E3bp Antikörper (PDH) bei 1: 100 in 1 % BSA Spüllösung.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Primärantikörper vorbereiten: <ol><li>Pipettieren 150 µL Primärantikörper in jede Zeile auch in 5 von 96-Well-Platte.</li>
		<li>Mit der Loop-Werkzeug Abschnitte aus der blockierenden Lösung (Zeile 4) in der Zeile 5 enthält den primären Antikörper übertragen.</li>
		<li>Wickeln Sie die Platte fest mit Parafilm zu halten vor dem Austrocknen.</li>
		<li>Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.</li>
	</ol></li></ol> Tag 2: <ol start="6"> <li>spülen Proben: <ol><li>Prepare spülen Brunnen in Reihen 6, 7 und 8 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 % BSA Spüllösung in jede Vertiefung.</li>
		<li>Abschnitte in ersten 1 % BSA Spüllösung (Zeile 6) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Spülungen durch Inkubation Abschnitte in 1 % BSA Spüllösung in den Zeilen 7 und 8 für 1 h bei Raumtemperatur noch zweimal zu wiederholen.</li>
	</ol></li> <li>Sekundärantikörper in 1 % BSA Spüllösung zu verdünnen: <ol><li>machen 1.500 µL Sekundärantikörper Lösung während Abschnitte in den letzten Spülgang 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) Inkubation werden.</li>
		<li>Sekundärantikörper verdünnen: für PGP9.5 (grün-fluoreszierende konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, 1: 1000), für PDH (rot-fluoreszierend konjugierten Ziege Anti-Maus, 1:1 000) in 1 % BSA Spüllösung.</li>
	</ol></li> <li>Sekundärantikörper vorbereiten: <ol><li>Pipettieren 150 µL Sekundärantikörper in Zeile 9 von 96-Well-Platte.</li>
		<li>Sanft übertragen die Abschnitte von 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) in Sekundärantikörper Vertiefungen (Zeile 9).</li>
		<li>Mit Parafilm, wickeln Sie die Platte fest zu halten vor dem Austrocknen. Mit Alufolie abdecken. Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.</li>
	</ol></li></ol> Tag 3: <ol start="9"> <li>vorbereiten reinigen 1 X PBS durch Filterung durch einen 0,22 µm-Filter: <ol><li>Pipettieren 150 µL gefiltert 1 X PBS in Zeile 10, 11 und 12.</li>
		<li>Proben auf Zeile 10 übertragen und spülen Sie mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Decken Sie 96-Well-Platte mit Alufolie ab und auf einen flachen Rocker beim Spülen. Wiederholung gefiltert 1 x PBS spülen zwei weitere Male für 1 h bei Raumtemperatur in den Zeilen 11 und 12.</li>
	</ol></li> <li>Montage Gewebeschnitte Objektträger vorbereiten: <ol><li>Ort 50 µL 1 X PBS auf einer Folie gefiltert.</li>
		<li>Transfer-Abschnitt von 1 X PBS (Zeile 12) in den 50 µL Tropfen. Positionieren Sie sorgfältig Abschnitt in der Dropdownliste der PBS durch Entfaltung des Gewebes und Abflachung es sanft auf dem Objektträger. Entfernen Sie überschüssige PBS mit einer Glaspipette um das Montage-Reagenz Verdünnung zu vermeiden. Abschnitte mit der Glaskolben nicht berühren.</li>
		<li>Pipettieren 1 - 2 Tropfen Montage Reagenz mit DAPI direkt auf den Abschnitt über das Mikroskop Folie mit Sorgfalt um die Ausrichtung des Abschnitts nicht zu stören. Sanft lege ein 50 mm x 24 mm #1.5 Mikroskop Glas Deckglas über Abschnitt.</li>
		<li>Klare Luftblasen gebildet, indem man das Deckglas und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Kanten des Deckglases. Bereiten Sie eine neue Folie und wiederholen Sie die Montage-prdet für jeden Abschnitt.</li>
		<li>Heilung/trockene Montage Medien indem man die Folien in der dunklen Nacht bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Folien auf 4 ° C für kurzfristige (1-2 Wochen) oder-20 ° C für die Langzeitspeicherung (mehr als 2 Wochen). 
		Hinweis: Negativkontrollen Primärantikörper für PGP9.5 oder PDH in Schritt 1.4.2.2 weggelassen und angezeigt, keine unterscheidbare Kennzeichnung von Nerven oder Mitochondrien in der Epidermis. Positiv, dass Kontrollen wurden Etiketten für die PDH Antikörper zu beweisen alle Mitochondrien (Daten nicht gezeigt). Positivkontrollen wurden auf kultivierten primäre Maustaste Dorsal Root Ganglion Neuronen durchgeführt, die mit einem Baculovirus zum Label Mitochondrien mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Signal ausgestrahlt wurden und dann fixiert und befleckt mit dem PDH-Antikörper und rot fluoreszierende Sekundärantikörper. Alle Mitochondrien, die GFP zum Ausdruck zu bringen, wurden gemeinsam mit dem roten Etikett für PDH Immunohistochemistry (Daten nicht gezeigt) beschriftet wurden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal Imaging <ol><li>konfokale Bildgebung durchführen: <ol><li>sammeln Bilder mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop mit einem 40 X Ölimmersion (1,25 numerische Apertur (N.A)) Ziel auf einem inversen Mikroskop.
		<ol><li>Bei jedem Brennebene sequenziell erwerben fluoreszierende Signale: Kerne: Erregung λ = 405 nm, spektrale Emission Filter λ = 420-480 nm Nervenfasern: Erregung λ = 488 nm, spektrale Emission Filter λ = 505-560 nm Mitoch Ondria: Erregung λ = 543 nm, spektrale Emission Filter λ = 606-670 nm</li></ol></li> <li>die folgenden Scan-Parameter in die Mikroskop-Software eingeben: Scan-Rate von 600 Hz mit 2 Rahmen mit durchschnittlich und Zoom von 2,2; Intensität 12-Bit Auflösung (4096 grau Ebenen).
		<ol><li>Stellen die Mikroskop-Software für optimierte laterale Auflösung (scan-Auflösung = 1.024 x 1.024) und axiale Auflösung/optische-Schnitt (konfokale Blende = 1 luftig Einheit (AU) mit Z-Schrittweite von 210 nm). 
			Hinweis: Die resultierende XYZ-Auflösung ist 172,2 nm x 172,2 nm X 210 nm mit einer Bildgröße von 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.</li>
		</ol></li> <li>Aktivieren Sie ein live-Bild für das Nervensignal (grün-Fluoreszenz) und stellen Sie die Z-Fokus-Regler zu finden und einstellen den oberen und unteren Brennweite Flugzeuge in der Mikroskop-Software, die das Nervensignal im Abschnitt Gewebe umfassen. Z-Gesamtreichweite beträgt in der Regel 30-50 µm für einen 50 µm Gewebe Abschnitt.</li>
		<li>Feld Scan mit der Mikroskop-Software während einer live-Bild drehen, so dass die Epidermis in das Bild horizontal oder vertikal positioniert ist.</li>
		<li>Scannen jedes Signal getrennt und passen Sie den Detektor (Photomultiplier Röhre, PMT) Spannung und Offset zu minimieren/über und unter gesättigten Pixel entfernen. 
		Hinweis: Die Scan-Zeiten mit den oben genannten Parametern dauern ca. 20-40 min je nach Anzahl der Z-Scheiben.</li>
	</ol></li></ol> 3. 3D Visualisierung und Analyse der Mitochondrien innerhalb menschlicher Intraepidermal Nervenfasern <ol><li>3D Epidermis zu isolieren: <ol><li>duplizieren Sie das Originalbild und verwenden Sie die maximale Intensität Projektion (erweiterte Fokusansicht) des Bildes zu identifizieren und isolieren die Epidermis.</li>
		<li>Verwenden eine Region von Interesse-Werkzeug, um Spur entlang der oberen und unteren Kanten der Epidermis, um unerwünschte Bereiche wie das Stratum Corneum und Dermis zu entfernen, das Fehlen von Intraepidermal Nervenfasern. Auf diese Auswahl zuschneiden.</li>
	</ol></li> <li>Verwendung Dekonvolution auf die Nerven und mitochondriale fluoreszierende Signale: Hinweis: Dekonvolution hilft, die Integrität der fluoreszierenden Signale wieder herzustellen. Die Wiederherstellung, die in diesem Protokoll verwendeten wird blind Deconvolution genannt, weil es die fluoreszierenden Signale in den Bildern nutzt um zu bestimmen, wie viel die Signale von ihrer ursprünglichen Quelle verbreiten (Punkt spread Funktion). Der Prozess verbessert Signal Auflösung durch die Neuzuweisung des Signals zurück in seine Ursprungsposition verbreitet.
	<ol><li>Berechnen einen Punkt verteilen Funktion (PSF) für das grün fluoreszierende Nervensignal (grün-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern: <ol><li>stellen berechneten PSF auf konfokalen. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Stellen Sie Detektor Lochkamera auf 1 luftig Einheit (AE). Set Laser Erregung Wellenlänge 488 nm und Emissions-Wellenlänge 515 nm.</li>
		</ol></li> <li>Ein PSF für rote mitochondriale Fluoreszenzsignal (rot-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern zu berechnen: <ol><li>Set PSF auf konfokalen berechnet. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Detektor Lochkamera auf 1 gesetzt AU. Eingestellten Erregung Laserwellenlänge 543 nm und Emissions-Wellenlänge, 617 nm.</li>
		</ol></li> <li>Optimieren die Nerven- und Mitochondrien fluoreszierende Signale von Dekonvolution unter Verwendung der entsprechenden PSFs oben aufgeführten und iterative Wiederherstellung Feature auf 100 % Vertrauen und einer Iteration-Grenze von 10 Zyklen festgelegt.</li>
	</ol></li> <li>Nerv-spezifische Oberflächen zu schaffen: <ol><li>Gebrauch der &#34; DGM erstellen &#34; Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Nerven von den deconvolved grün-fluoreszierende sekundäre Kennzeichnung von der PGP9.5 identifiziert Nerven.</li>
		<li>Uncheck die &#34; glatt &#34; verfügen und absolute Intensität-Funktion verwenden, um die Schwelle für das Nervensignal gesetzt, denn es ist deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz.</li>
		<li>Funktion zum setzen Sie den Schwellenwert für das Nervensignal, da es deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz ist die absolute Intensität. Legen Sie Schwellenwert niedrig genug, um die Nerven genau zu identifizieren.</li>
		<li>Filter, kleinen, nicht-Nerv Oberflächen basierend auf Größe. 
		Hinweis: Manuell bearbeiten Sie ggf. zusätzliche nicht-Nerv Oberflächen innerhalb der &#34; bearbeiten &#34; Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte markieren und dann mit der Entf-Taste löschen.</li>
	</ol></li> <li>Isolieren Nerv-spezifische mitochondriale Fluoreszenzsignal: <ol><li>Wählen Sie die Registerkarte "Bearbeiten" der Nerv Oberfläche zum Anzeigen der &#34; Maskeneigenschaften &#34; Funktion. Die Nerv-Oberfläche in Schritten 3.3 erstellt wird verwendet, um die Mitochondrien in die Nerven weg von mitochondrialen Signale zugeordnet die Keratinozyten isolieren.</li>
		<li>Als die &#34; Maske alle &#39; Taste öffnet sich ein &#34; Maskenkanal &#34; Fenster, wählen Sie das deconvolved rot-fluoreszierend-Signal aus dem Pull-down-Menü unter &#34; Kanalwahl &#34; für das mitochondriale Signal.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ein Häkchen setzen der &#34; doppelten Kanal vor dem Auftragen der Maske &#34; Option.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Radio-Taste an der &#34; konstant innen/außen &#34; Möglichkeit, die Maskeneinstellungen und klicken Sie im Feld ein Häkchen setzen die &#34; Voxel Außenfläche zu setzen &#34; Option und geben Sie für den Wert 0,00. Klicken Sie auf "OK"-Taste, um den neuen Kanal erstellen, die mitochondriale Signale innerhalb der Nerv Oberfläche darstellt.</li>
	</ol></li> <li>Mitochondrien-spezifische Oberflächen zu schaffen: <ol><li>Gebrauch der &#34; DGM erstellen &#34; Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Mitochondrien aus dem neu geschaffenen fluoreszierende Kanal der Nerv-spezifische mitochondriale Signale von 3.4 Schritte.</li>
		<li>Uncheck die &#34; glatt &#34; verfügen, und wählen Sie den &#34; Hintergrund Subtraktion &#34; Funktion, um den Schwellenwert festlegen. Diese Funktion nutzt lokale Kontrast um das mitochondriale Signal Mitochondrien aus Hintergrund identifizieren.</li>
		<li>Set-Schwellenwert ist niedrig genug, um die Mitochondrien genau zu identifizieren. In diesem Beispiel wurde der untere Grenzwert auf 2.000 für einen 16-Bit (65.536) Maßstab festgelegt.</li>
		<li>Filtern mitochondriale Oberflächen basierend auf Größe. In diesem Beispiel wird das Voxel-Limit auf 1,0 Voxel festgelegt wurde, ist die niedrigste möglich zu begrenzen. Bearbeiten Sie ggf. manuell nicht Mitochondrien Oberflächen innerhalb der &#34; bearbeiten &#34; Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte auswählen und dann mit der Entf-Taste löschen. 
		Hinweis: Gelegentlich wird die Software Oberflächen erstellen, die keine unterscheidbare mitochondriale Fluoreszenzsignal zugeordnet sind. In diesen Fällen ist es möglich, entfernen sie mit dem &#34; bearbeiten &#34; tab.</li>
	</ol></li> <li>Exportieren und morphometrische Werte für die Analyse berechnen: <ol><li>Werte für Nerven- und mitochondriale Oberflächen aus exportieren der &#34; Statistik &#34; Registerkarte zur weiteren Analyse mit elektronischen Tabellenkalkulations-Software.</li>
		<li>Exportieren die Volumenwerte für die Nerven und die mitochondriale Oberflächen.</li>
		<li>Die Anzahl der einzelnen Nervenfasern vorhanden in jedem Bild und notieren Sie den Wert in der elektronischen Tabellenkalkulation.</li>
		<li>Für jedes Bild die folgenden möglichen Werte für die Analyse in der elektronischen Tabellenkalkulation berechnen: <ol><li>Sum Volumes für alle Nerven Oberflächen.</li>
			<li>Filter, Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen unter einem Volumen von weniger als 0,02 µm 3 und bin Größe Oberflächen durch. Z. B. Behälter z. B. 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1.28 1.28-2,56, größer als 2,56 µm 3. 
			Hinweis: Die untere Grenze der mitochondrialen Volumen wurde gegründet um 0,02 µm 3 anhand der bisher erschienenen Bände der Mitonchodria 36 , 37 , 38.</li>
			<li>Zählen die Anzahl der Nerven-spezifische mitochondriale Flächen in jedem Lagerplatz und die Gesamtzahl der Flächen über die Lagerplätze (0,02 - mehr als 2,56 µm 3).</li>
			<li>Berechnung des Anteils der Nerv-spezifische mitochondriale Oberflächen in jedem Lagerplatz. Verwenden Sie die Anzahl die pro bin dividiert durch die Gesamtzahl der Mitochondrien Oberflächen.</li>
			<li>Summe der Volumina für alle Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen.</li>
			<li>Berechnet den Anteil des Nervs mit mitochondrialen Signal dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch die Summe aller mitochondriale Oberfläche Volumes.</li>
			<li>Berechnen Sie die Anzahl der Mitochondrien pro Nerv Volumen dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch den Grafen von allen mitochondriale Oberflächen.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte zu erklären.

Dieses Protokoll soll zu isolieren, zu quantifizieren und zu analysieren, die Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien innerhalb von IENFs in 3D aus Menschenhaut Biopsien. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die frei schwebenden Fluoreszenz Immunohistochemistry soll beflecken und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung44,45analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht für die Penetration...

Mitochondrien dienen wichtige Zellfunktionen, die Produktion von Zellenergie, Pufferung, Kalzium, und Regulierung der nekrotischen und Apoptotic Zelle Tod1,2,3enthalten. Das Nervensystem hat eine hohe metabolische Rate im Vergleich zu den Körper4 darauf hindeutet, dass Neuronen ein hohes Maß an zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP erzeugen) durch mitochondriale Atmung. Eine Menge Beweise dokumentiert, dass neuronale Funktionen ATP5, vor allem bei den Synapsen6abhängig sind. Die Verteilung der Mitochondrien innerhalb von Neuronen sind deshalb wichtig.
In die letzten 10 Jahren, die eine Vielzahl von Informationen, dass gezeigt hat der Handel und das Andocken des neuronalen Mitochondrien, ist streng reglementiert. Motorproteine sind bei der Verteilung der Mitochondrien zu spezifischen zellulären Fächer in das Neuron beteiligt. Handel mit Mitochondrien ist besonders wichtig, weil Neuronen Axone und Dendriten fernab der Soma-Projekt. Motorproteine Kinesin direkt in erster Linie Anterograde (Weg von der Soma) Handel mit Mitochondrien entlang der Mikrotubuli während Dynien Motorproteinen direkte retrograde (in Richtung der Soma) Motilität7,8,9 , 10. Zelluläre Signale gibt es solch eine mitochondriale Membranpotential und Impuls-Leitung, die Einfluss auf das Vorhandensein und die Richtung der mitochondrialen Menschenhandel11,12,13.
Neben Mitochondrien zu transportieren, gibt es spezielle Proteine, Mitochondrien zu spezifischen zellulären Kompartimenten zu lokalisieren, die hohen Energiebedarf, wie Knoten von Ranvier und Synapsen8,14, 17. In der Tat, die meisten von Mitochondrien in Axonen sind nicht bewegliche9,13,18. Spezielle Proteine wie Syntaphilin Anker Mitochondrien Mikrotubuli entlang der Axone während andere Proteine Anker Mitochondrien an den Aktin-Zytoskelett19–21. Wachstumsfaktoren und Ionen wie Calcium wurden berichtet, um die Einstellung der Mitochondrien Bewegung sie Regionen lokalisieren wo sie benötigte21,22,23sind zu unterstützen.
Zusammengenommen, sind Menschenhandel und docking der Mitochondrien entscheidend für die richtige Funktion der Neuronen. Zur Unterstützung dieser wurde Unterbrechung des mitochondrialen Handel mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit, Huntington Krankheit, erbliche spastische Paraparese und Optikusatrophie15,24,25,26,27. Neuere Studien konzentrierten sich auf mitochondriale Dysfunktion und Pathologie als ein möglicher Mechanismus für diabetische Neuropathie, die sensorische Verlust im Zusammenhang mit Diabetes28,29,30,31 ,32,33. Die Hypothese ist, dass Diabetes die Verteilung der Mitochondrien innerhalb der sensorischen Projektionen der kutanen Nervenendigung verändert. Daher wurde eine Technik entwickelt, um zu visualisieren und zu quantifizieren Mitochondrien innerhalb der Intraepidermal Nervenfasern (IENFs), die distalen Spitzen der Dorsal Root Ganglion sensorischen Afferenzen. Die Technik kombiniert Fluoreszenz Immunohistochemistry spezifische mitochondriale und Nervenfaser Etiketten mit konfokalen Mikroskopie Z-Serie Erwerb von Signalen mit leistungsstarken 3D Bildanalyse-Software zur Messung der Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien von menschlichen kutanen Stanzbiopsien zur Erreichung dieses Ziels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Das Ziel dieses Protokolls ist, Mitochondrien innerhalb Intraepidermal Nervenfasern zu studieren. Daher wurden 3D Bildgebung und Analysetechniken entwickelt, um Nerv-spezifische Mitochondrien zu isolieren und Krankheit verursachten Veränderungen der Mitochondrien in der distalen Spitze der sensorischen Nerven zu bewerten. Das Protokoll verbindet Fluoreszenz Immunohistochemistry, konfokale Mikroskopie und 3D-Bild Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Detaillierte Parameter sind im gesamten Verfahren definiert, um ein konkretes Beispiel, wie man diese Techniken verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien isolieren zu bieten. Antikörper wurden verwendet, um Nerven zu beschriften und mitochondriale Signale in Gewebeschnitten der Haut Punsch Biopsien, die folgte indirekte Immunfluoreszenz, Nerven und Mitochondrien mit grünen und roten Fluoreszenzsignal bzw. zu visualisieren. Z-Serie-Bilder wurden mit der konfokalen Mikroskopie erworben und 3D Analyse-Software wurde zur Verarbeitung und Analyse der Signale. Es ist nicht notwendig, die genauen Parameter innerhalb beschrieben folgen, aber es ist wichtig, die konsistent mit denen, die in der Färbung, Erfassung und Analyse Schritten gewählt werden. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es auf eine Vielzahl von Umständen anwendbar ist, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um andere Signale zu isolieren, die sonst unmöglich, allein zu studieren.

Visualisierung und Quantifizierung der Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs
Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Signalen innerhalb menschlicher Hautbiopsien, Nerven, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Eine 96-Well-Platte ist eine komfortable Möglichkeit, die Schritte des Verfahrens Immunohistochemistry zu organisieren. A...

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Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

three-dimensional-imaging-analysis-mitochondria-within-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Aufrufe.  University of Michigan Medical School. Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Serie: Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the vestibular organ results in mild to severe equilibrium problems, such as vertigo, dizziness, oscillopsia, gait unsteadiness nausea and/or vomiting. A good and frequently used measure to quantify gaze stabilization is the gain, which is defined as the magnitude of compensatory eye movements with respect to imposed head movements. To test vestibular function more fully one has to realize that 3D VOR ideally generates compensatory ocular rotations not only with a magnitude (gain) equal and opposite to the head rotation but also about an axis that is co-linear with the head rotation axis (alignment). Abnormal vestibular function thus results in changes in gain and changes in alignment of the 3D VOR response.
Here we describe a method to measure 3D VOR using whole body rotation on a 6DF motion platform. Although the method also allows testing translation VOR responses 1, we limit ourselves to a discussion of the method to measure 3D angular VOR. In addition, we restrict ourselves here to description of data collected in healthy subjects in response to angular sinusoidal and impulse stimulation.
Subjects are sitting upright and receive whole-body small amplitude sinusoidal and constant acceleration impulses. Sinusoidal stimuli (f = 1 Hz, A = 4&deg;) were delivered about the vertical axis and about axes in the horizontal plane varying between roll and pitch at increments of 22.5&deg; in azimuth. Impulses were delivered in yaw, roll and pitch and in the vertical canal planes. Eye movements were measured using the scleral search coil technique 2. Search coil signals were sampled at a frequency of 1 kHz.
The input-output ratio (gain) and misalignment (co-linearity) of the 3D VOR were calculated from the eye coil signals 3.
Gain and co-linearity of 3D VOR depended on the orientation of the stimulus axis. Systematic deviations were found in particular during horizontal axis stimulation. In the light the eye rotation axis was properly aligned with the stimulus axis at orientations 0&deg; and 90&deg; azimuth, but gradually deviated more and more towards 45&deg; azimuth.
The systematic deviations in misalignment for intermediate axes can be explained by a low gain for torsion (X-axis or roll-axis rotation) and a high gain for vertical eye movements (Y-axis or pitch-axis rotation (see Figure 2). Because intermediate axis stimulation leads a compensatory response based on vector summation of the individual eye rotation components, the net response axis will deviate because the gain for X- and Y-axis are different.
In darkness the gain of all eye rotation components had lower values. The result was that the misalignment in darkness and for impulses had different peaks and troughs than in the light: its minimum value was reached for pitch axis stimulation and its maximum for roll axis stimulation.
Case Presentation
Nine subjects participated in the experiment. All subjects gave their informed consent. The experimental procedure was approved by the Medical Ethics Committee of Erasmus University Medical Center and adhered to the Declaration of Helsinki for research involving human subjects.
Six subjects served as controls. Three subjects had a unilateral vestibular impairment due to a vestibular schwannoma. The age of control subjects (six males and three females) ranged from 22 to 55 years. None of the controls had visual or vestibular complaints due to neurological, cardio vascular and ophthalmic disorders.
The age of the patients with schwannoma varied between 44 and 64 years (two males and one female). All schwannoma subjects were under medical surveillance and/or had received treatment by a multidisciplinary team consisting of an othorhinolaryngologist and a neurosurgeon of the Erasmus University Medical Center. Tested patients all had a right side vestibular schwannoma and underwent a wait and watch policy (Table 1; subjects N1-N3) after being diagnosed with vestibular schwannoma. Their tumors had been stabile for over 8-10 years on magnetic resonance imaging.

A method is described to measure three-dimensional vestibulo ocular reflexes (3D VOR) in humans using a six degrees of freedom (6DF) motion simulator. The gain and misalignment of the 3D angular VOR provide a direct measure of the quality of vestibular function. Representative data on healthy subjects are provided

Dreidimensional Vestibuläre Ocular Reflex-Test mit Six Degrees of Freedom Bewegung Platform

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Dreidimensionale Formmodellierung und Analyse von Gehirnstrukturen

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...