Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

HINWEIS: Alle Verfahren wurden von der Royal Victorian Eye and Ear Hospital Tierforschung und Ethik-Kommission genehmigt (RVEEH AEC; # 10-199AB). Die Probanden wurden nach dem National Health und Medical Research Council &quot;Australian Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken&quot; (2013) und die &quot;Prävention von Tierquälerei Act&quot; behandelt (1986 und Änderungen). Alle chirurgischen, klinische Bewertung und elektrophysiologische Verfahren wurden unter Narkose durchgeführt und alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren. 1. Enukleation und Fixierung HINWEIS: Befolgen Sie die im Detail in der Begleiter Manuskript 16 beschrieben Enukleation und Fixierung Verfahren, wobei besonders vorsichtig, um Gerätekabel oder Vitrektomie-Ports, falls vorhanden. Kurz gesagt, dies beinhaltet: <ol><li> Transkardial perfuse das Thema mit warmer Kochsalzlösung, gefolgt von kalten neutralen bufferot Formalin. </li><li> Binden Sie Nähte am Augapfel als Landmarken dienen. </li><li> Entkernen das Auge 16 unter Beibehaltung der Gerätekabel und alle Befestigungs patches / Tabs. </li><li> Post-fix das Auge in Davidsons Lösung für 18 - 36 Stunden. </li><li> Transfer zum 50% Ethanol für 6-8 Std. </li><li> Transfer zum 70% Ethanol und im Kühlschrank (4 ° C), bis Dissektion. </li></ol> 2. Elektroden-Entfernung und Dissection. HINWEIS: Nicht alle epiretinalen Implantate den gleichen Formfaktor aufweisen, aber im allgemeinen wird es eine Elektrodenanordnung und eine gewisse Form von flexiblen und anpaßbare Trägermaterial sein. Geräte, die auf der Netzhaut angeheftet sind mit einem Tack Loch, wo der Metallheft dringt das Array und den hinteren Teil des Auges, wobei diese zusammen. <ol><li> Visualisieren des Implantats und dem Punkt, wo es auf die Netzhaut befestigt. <ol><li> Mit einem 15-Grad-Klinge einen Umfangstranshornhautschnitt und entfernen Sie die Hornhautkappe zu expose der zugrunde liegenden Iris und Linse. </li><li> Mit einem 15-Grad-Klinge, disinsert die Zonulafasern der Linse und entfernen Sie die Linse in toto, Freilegung der hinteren Kammer mit dem epiretinalen Implantat und dem Metall tack in situ. </li></ol></li><li> Abhängig von dem Implantat und dem die Prüfung durchgeführt wird, zu entfernen Fremdkomponenten vor der weiteren Zerlegung. HINWEIS: Bei dem vorliegenden Beispiel ist die epiretinale Array ausgewertet bestand aus einem hermetischen Prototyp Diamantelektrode und Elektronikpaket innerhalb einer konformen Silikonträger untergebracht (im Haus hergestellt, siehe 20). <ol><li> Hier vorsichtig heraus die Diamantelektrode Paket von feinen Sezierung mit einem Skalpell. Lassen Sie das Silikon Körper des Implantats zusammen mit der Netzhauthaftung und den Überresten der Platin Verdrahtung (Bild 2). Wenn ein Embedded Array / Gehäuse ist nicht Bestandteil des Gerätes Design untersucht, dann lassen Sie diesen Schritt (2.2). </li></ol></li><li> Vorsichtigsezieren ein Beispiel, das die Klebrigkeit und das umgebende Gewebe in der gewünschten Ausrichtung umfasst. Verwenden Sie feinen Sezierung Schere gesamten Dicke Streifen von der Rückseite des Auges, einschließlich der Lederhaut, Aderhaut und der Netzhaut zu schneiden. Nehmen Sie eine Probe, die einen Längsschnitt des Tack gibt, in der alle Netzhautschichten neben dem Tack (Abbildung 2) HINWEIS: Die gewünschte Ausrichtung für die Probe kann abhängig von der speziellen gewünschten Ergebnis. Zum Beispiel, wenn man die Nähe der klebe Beschädigung der optischen Platte dann sollte die optische Platte innerhalb der Probe enthalten sein zu prüfen wünscht. </li></ol> 3. Dehydration, Einbetten, Montage, reiben, Färbung und Imaging <ol><li> Entwässern der Probe über drei Tage in progressive Ethanol Stufen: <ol><li> Dehydrieren der Probe in 70% Ethanol für 2 Stunden zweimal. </li><li> Dehydrieren der Probe in 80% Ethanol für 2 Stunden zweimal und dann O / N. </li><li> Entwässern der Probe in 90% Ethanol für 2 Stunden TWICe. </li><li> Dehydrieren der Probe in 100% Ethanol für 2 Stunden zweimal und dann O / N. </li></ol></li><li> Entwässern der Probe in 100% Aceton für 2 Stunden zweimal. <ol><li> Entfernen Sie die Probe aus dem Aceton und unter einem Lichtmikroskop, wie es Luft trocknet bei Raumtemperatur zu beobachten es. Die Probe in Epoxidharz (siehe Schritt 3.4), kurz bevor es beginnt zu rollen / verdecken. Hinweis: das Entfernen von Flüssigkeit aus den Weichteilen ergibt sich zusammengebrochen Zellen und Schrumpfung. Eine Würdigung, wenn das Gewebe Curling / verdecken tritt mit Erfahrung entwickelt. </li></ol></li><li> Bereiten medical grade Epoxidharz nach den Anweisungen des Herstellers. Um das Harz zu härten, verwenden Sie entweder 55 ° C für 1 Stunde oder 24 Stunden bei Raumtemperatur. In einer Vakuumkammer für ~ 5 min bei ~ 50 mbar zur Entfernung der Luftblasen. Manuell regeln das Vakuum als ein übermäßiges Vakuum bewirkt, dass der Epoxy Mischung zum Kochen bringen und Entgasung nicht wirksam auftreten HINWEIS: Führen Sie Schritt 3.3 gleichzeitig mit Schritt 3.2. </li><li> Betten Sie die sample in klaren Epoxidharz. Tauchen Sie die Augengewebe in entgastem Epoxy in geeigneter verschließbaren Behälter und lassen Sie O / N bei RT zu heilen. </li><li> Achten Sie darauf, um die Probe in der gewünschten Orientierung (Abbildung 2), die durch die Größenänderung und Wieder Einbettung des ausgehärteten Epoxid Block einbetten. Re-betten die Größe verändert Satz mit dem Augengewebe, so dass die lange Achse des Tack ist parallel zum Boden der Form ausgerichtet (gelbe Tasse - 3A). </li><li> Montieren Sie das Harz in einem Schleifprobenhalter und schleifen die Probe (230 bis 250 Umdrehungen pro Minute mit Wasser auf, manuelles Schleifen) mit Siliziumkarbid-Papier (beginnend mit 800 Gitter; 3C und 3E). </li><li> Zur Färbung, tauchen die Bodenoberfläche in Toluidinblau-Färbung für 3-5 min, oder bis der Fleck entwickelt (3F). </li><li> Spülen mit Leitungswasser (Abbildung 3G). </li><li> Bild die geschliffene Oberfläche der Probe mit einer hohen Leistungs Dissektion Umfang um die Zellschichten des visualisierenNetzhaut (3H). Einen Tropfen von destilliertem Wasser auf die Oberseite des Epoxy oberhalb der Probe, um die Beugung an der Luft-Epoxy-Schnittstelle zu glätten. Verwenden Sie eine optische Faser &quot;Schwanenhals&quot; Lichtquelle, um die Probe zu beleuchten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,9, bei jedem Schleifen entfernt eine vorgegebene Dicke der Probe (Mindest präzise und reproduzierbare Schleifschritt der Probenhalter ist 20 um). </li></ol>

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Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Histologischen Standardtechniken sind nicht imstande, Hartmetallimplantate in situ Prozess wegen der Beschränkungen in Schneid diese Objekte mit Metall, Glas oder auch Diamantscheiben. In unserem Begleiter Papier 16 zeigten wir, daß die Verwendung einer modifizierten Vollaugenfixierung Technik könnte artifactual retinalen Delaminierung verringern. In der aktuellen Manuskript, ein etabliertes Schleif- und Poliertechnik zur Visualisierung Cochlea-Implantate in situ 21-23 wurde für die Netzhautprothesen modifiziert. Ein Titan-tack, verwendet werden, um eine Elektrodenanordnung auf die Netzhaut zu sichern, epiretinal wurde in Epoxidharz zusammen mit dem umgebenden Augengewebe eingebettet. Diese Harzblock wurde dann in geeigneter Weise, um die Gewebemorphologie unmittelbar angrenzend an die Metall tack offenbaren orientiert und schrittweise geschliffen / poliert. Bilder von der polierten Oberfläche des Blocks in verschiedenen Tiefen wurden mit einem leistungsstarken Dissektionsmikroskop gemacht. Diese Technik ist nützlich für: Visualisieren und evaluating die Gewebereaktion neben dem epiretinalen Implantats; um das Operationstrauma mit der Implantation des Implantats verbunden sind, bewerten; die biologische Reaktion auf die Hartmetallkomponenten zu bestimmen; und um den Abstand zwischen dem Implantat und der Oberfläche der Netzhaut zu messen. Diese Technik wird in situ Visualisierung der Bereich in der Nähe einer Netzhaut-Tack oder andere harte (zB metallischen) Gegenstände in die Augen, die in Zukunft Sicherheitsstudien sein. Dies hat direkte Anwendung bei der Beurteilung der präklinischen Sicherheits Prothesen an der Netzhaut angeheftet epiretinal. Es kann auch nützlich für die Bewertung Gewebeschäden bei Retinabereiche in Kontakt mit Implantaten im subretinalen Stelle angeordnet sein. Es gibt mehrere Möglichkeiten, um sicherzustellen, daß das Verfahren korrekt durchgeführt wurde. Bei jedem Schritt sollte die Netzhaut zu den äußeren Schichten des Auges befestigt bleiben. Wenn es Brutto artifactual Netzhautablösung kann dieser indischenaß ein Problem bei der Fixierung. Wenn die Probe eingebettet ist, und in der endgültigen Harz umorientiert blockieren die Retina sollte in der Nähe der Schleiffläche des Blocks orthogonal sein; dies Schrägschneid minimieren. Es ist nützlich, um zu überprüfen, dass die Anzahl der inkrementellen Schleifschritte (bekannter Schrittgröße), die für ein Objekt (wie ein Retina Klebrigkeit) durchlaufen entsprechend korrelieren mit den Abmessungen des Objekts. Die Technik kann auf verschiedene Weisen optimiert werden. Kratzer auf der Oberfläche des mit der Schleifprozess verbunden Epoxydblock kann mit zunehmend feineren Poliergrad reduziert werden. Für die vorliegende Studie verwendeten wir 800, 1000, 1200, 2400, und 4000 Grad Siliciumcarbidpapier. Diamantpaste könnte auch verwendet werden, um die Oberflächenqualität zu verbessern. Eine feinere Oberflächengüte ergibt eine höhere Bildqualität, aber auf Kosten einer zusätzlichen Polierzeit. Ein weiterer kritischer Betrachtung zur Verbesserung der Ergebnisse dieser Technik ist die Auswahl und Qualität des optics und Beleuchtung für die Bildaufnahme verwendet. Andere histologische Grundflecken - besonders Nissl Flecken, kann anstelle von Toluidinblau verwendet werden, jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich. Einige Flecken wird das Harz als auch das Gewebe (zB Eosin), daher kann eine flache Lack nach der Färbung erforderlich ist, um Hintergrundfärbung zu entfernen Fleck. Spezialisierte Flecken, Fluoreszenzfarbstoffe und immunhistochemischen Färbung wurde nicht versucht, aber wenn ein sehr spezifisches Ergebnis erwünscht ist, ist die erforderliche Zeit, um diese Flecken an jedem Schleifebene ausführen wahrscheinlich unerschwinglich. Jedoch kann es möglich sein, das Gewebe als Ganzes vor dem Einbettungsschritt (Schritt 3.4) 24 zu färben. Die Haupteinschränkung dieser Technik ist, dass, sobald der interessierende Bereich wurde abgeschliffen, nicht wiederhergestellt werden können, ist es daher ratsam, viele (möglicherweise redundant) Bilder mit einer Vielzahl von Vergrßerungen in jeder Stufe des Schleifens und Polierens zu erfassen. Es istauch wichtig, in kleinen Schritten für jeden Schleiftiefeneinstellung zu verwenden. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass von der optischen Vergrßerung und Auflösung im Vergleich mit dem Gewebe auf einem Glasträger befestigt und mit einem Standard (Transmission) Lichtmikroskop betrachtet. Für die Zwecke des Prototyping und Bewertung der Sicherheit eines neuartigen Implantatvorrichtung ist von primärem Interesse der pathologische Auswertung. Dieses Verfahren stellt eine effiziente Methode zur Beobachtung der klinisch relevanten Schäden mit einer Retina Klebrigkeit verbunden. Mit etwas Übung die Gesamtzeit zum schleifen, polieren zu sammeln und zu fotografieren eine gegebene Probe (einmal eingebettet) ist vergleichbar mit der Zeit würde es dem Kapitel einen Paraffinblock oder Gefrierschnitt zu nehmen. Es besteht auch das Potential für die vorliegenden Techniken auf Anwendungen außerhalb des Bereichs der Netzhautimplantate verlängert. Diese Technik ist für die Bewertung des Gewebes angrenzend an eine Fest Implantat gegebenen Implantat Extraktion nicht geeignet feasible oder würde die Schnittstelle beschädigt werden. Zum Beispiel könnte diese Technik erweitert werden, um Implantate aus Metall (beispielsweise Platin, Nitinol, etc.), die nicht mit herkömmlichen histologischen Verfahren geschnitten werden können, hergestellt werden, zu bewerten, wie einige tiefe Gehirn oder peripheren Nervenelektroden, Kanülen für die Arzneimittelabgabe, Gefäßstents oder orthopädische Prothesen.

Retinitis pigmentosa (RP) ist eine erbliche Erkrankung, die weitverbreitete Verlust von Photorezeptoren, die die Zellen in der äußersten Schicht der zur Transduktion Licht verantwortlich Retina verursacht, in der Form von Photonen, in neuronale Aktivität. Wichtig ist, dass Patienten mit RP haben typischerweise Rest Neuronen in den anderen Schichten der Netzhaut, die noch funktionsfähig sind. Netzhautprothesen zur Wiederherstellung einige begrenzte Vision für diese Patienten, indem sie auf diese überlebenden Neuronen mit elektrischer Stimulation ihrer Sehbahn 1,2 zu aktivieren. Perceptual Ergebnisse aus klinischen Studien haben gezeigt, viel versprechende erste Ergebnisse und vor kurzem einige Geräte sind für den kommerziellen Gebrauch zugelassen ist. Derzeit gibt es drei Haupt anatomischen Stellen, in denen klinische retinalen Prothesen positioniert worden: epiretinal 3,4, subretinal 5,6 und suprachoroidally 7,8. Verschiedene Geräte verwenden unterschiedliche Materialien und deren Form angepasst wirdan den Ort, in dem sie implantiert werden. Jedoch alle schaffen visuelle Wahrnehmungen durch Aktivieren der Rest Neuronen der Retina mit elektrischen Impulsen. Es besteht die Möglichkeit für jede medizinische Prothese beschädigen umliegende Gewebe durch mechanische Einwirkungen des anfänglichen Platzierung oder die späteren laufenden Kräfte. Im Falle von implantierbaren Stimulatoren, wie Netzhautprothesen besteht die zusätzliche Überlegung, dass die elektrischen Parameter sollten innerhalb sicherer Grenzen liegen. Die Sicherheit der Patienten ist von größter Bedeutung, so dass Geräte müssen konsequent in präklinischen Studien, bevor zum klinischen Bereich 9-15 getestet werden. In unserem Begleiter Artikel beschrieben wir eine Methode zur Bewertung der lokalisierten Histopathologie des Auges ein Implantat in der Suprachoroidalraum 16 positioniert Umgebung. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung von umgebenden eine Elektrodenanordnung an der Netzhaut angeheftet epiretinal, in einem präklinischen Augengewebe (zBLinie) Modell (Abbildung 1). Die epiretinalen Lage ist die am häufigsten verwendete Position zur Lokalisierung eines Sehprothese. Elektrodenanordnungen hier entfernt werden typischerweise an der Netzhaut mit einer Metall Klebrigkeit, die alle Schichten des Auges eindringt 17-20 befestigt. Vor den in der vorliegenden Handschrift beschriebenen Techniken, war es schwierig, genau zu beurteilen die Netzhaut und anderen Geweben eine Wende in unmittelbarer Umgebung. Standard-Augenfixierung mit neutral gepuffertem Formalin führte artifactual Netzhautschäden durch die unterschiedliche Bewegung der Netzhaut und Lederhaut gegen die feste Spitze des Stifts. Daher ist jede tatsächliche Schaden durch die Klebrigkeit und epiretinalen Array verursacht nicht genau eingehalten werden. Zusätzlich könnte Schneiden des Augengewebes nicht mit der retinalen Klebrigkeit in situ durchgeführt werden, wie Metallgegenständen kann nicht ohne weiteres mit herkömmlichen histologischen Vorrichtung geschnitten werden; Entfernen der Heft vor histologische Verarbeitung war auchunerwünscht, da dies führte auch zu artifactual Netzhautschäden. Das Ziel der vorliegenden Studie war zweifach: 1) zu einer Netzhautablösung Artefakt zu reduzieren, so dass keinerlei Einfluss auf die Klebrigkeit und das epiretinale Implantat Array verursacht verlässlich bewertet werden; und 2), um die Netzhautarchitektur benachbart zur Klebrigkeit, ohne es zu visualisieren. Um Ziel 1 zu erreichen, wurde eine neue Befestigungstechnik verwendet, die Artefakt retinale Ablösung reduziert (wie in der Begleiter Artikel 16 beschrieben). Um Ziel 2 zu erreichen, modifizierten wir eine Einbettung, Schleif-, und Poliertechnik, die ursprünglich für in situ Beobachtung der Cochlea-Implantat-Elektroden 21 bis 23 entwickelt. Die in dieser Handschrift beschriebenen Verfahren ermöglichen die Visualisierung der Netzhaut umgeben und grenzt an einer Wende in situ bei gleichzeitiger Minimierung artifactual Netzhautschäden und ermöglicht so eine genaue Abschätzung der möglichen Schäden, die durch die Klebrigkeit und epiretinalen Array verursacht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Die Fixierung Protokoll erheblich reduziert artifactual Ablösung und Delamination der Netzhaut 16. Orientierung der Probe innerhalb des Epoxydblock wurde durchweg unter Verwendung der beschriebenen zweistufigen Einbettungsprozess erreicht. Die inkrementelle Schleifvorgang erforderlich eine moderate manuelle Geschicklichkeit, um optimale Ergebnisse zu erzielen, wurde aber durch die einstellbare Probenhalter, die Feineinstellung der Schrittauflösung vorgesehen unterstützt. In allen Fällen (n = 5) der Klebrigkeit wurde entfernt und Boden / mit erwünschten und konsistente Ergebnisse poliert. Die Netzhaut neben den Reißzwecken wurden aufgelöst und entsprechend gefärbt. Polieren der Oberfläche der Epoxidharz-Block mit der Note P # 800 Siliciumcarbidpapier war ausreichend, um Bild die zelluläre Makrostruktur der eingebetteten Gewebe. Schleifpapier höher oder Diamantsuspension verwendet werden, um die Oberfläche weiter zu polieren zu einem bestimmten Tiefe, falls gewünscht. Ein Dissektionsmikroskop und Glasfaser &quot;Schwanenhals&quot; light Quelle wurde als geeignet für die Abbildung der Oberfläche der Masseblock und der eingebetteten Gewebeprobe sein. Die Position der Lichtquelle wurde durch Versuch und Irrtum variiert, um eine Position und Winkel, die die beste Ausleuchtung und Kontrast durch das Mikroskop ergab finden. Indem ein Tropfen destilliertes Wasser auf die Oberfläche des Blocks, oberhalb der Probe, war nützlich für Lichtweg Beugung und / oder glatte Verzerrungen am Epoxy-Luftschnittstelle zu verringern, Fig. 4 zeigt beispielhafte Bilder von Retinagewebe sichtbar unmittelbar neben einer Titan retinalen tack mit dieser Technik. Nicht artifactual Netzhautablösung und Faltung kann auf beiden Seiten des Silikon (4A) gesehen werden. Die Klebrigkeit Welle sichtbar ist in Silikon eingebettet ist; der Leiter der Wende hat sich die Netzhaut und Lederhaut eingedrungen. Es ist nicht artifactual Netzhautablösung im ungefärbten Retina beiden Seiten des Silikon (4C). Die Technik hat sich gezeigt, daß in diesem Fall there Netzhaut Desorganisation neben dem Tack und Kompression der Netzhaut auf der einen Seite durch eine schräge Einführungswinkel. Beachten Sie, dass die gezeigten Bilder sind lediglich Illustrationen der Erfolg der Technik, nicht repräsentativ für klebe Schäden Histopathologie im Allgemeinen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Platzierung eines epiretinalen Elektrodenarray. (A) Schematische Darstellung des Auges zeigt eine vergrößerte Querschnitt des hinteren Lederhaut, Aderhaut und Netzhaut degeneriert (ohne Photorezeptoren). Eine Elektrodenanordnung ist in blau dargestellt, epiretinal angebracht. (B) den computergestützten Darstellung einer epiretinalen Elektrodenarray. a, integrierten Schaltungen (&quot;Chip&quot;) und Elektrodenpaket; b, Titan Netzhaut Tack; c, medizinischem Silikon Gehäuse; d, Blei Austrittsstelle. Panel A geändert von ursprünglich illustratiauf zur Verfügung gestellt von Bionic Vision Australia, Copyright Beth Croce. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Elektrodenentfernung und Präparation des Auges. Hoher Dynamikbereich Makroaufnahmen einer entkernten Katzenauge mit epiretinalen tack in situ. (A) Beitrag Fixierung mit Davidsons Fixiermittel, die mit Retina-Architektur 16 zu erhalten, wurde die entkernte Auge seziert. Die Elektrodenanordnung Paket wurde von dem Siliconträger entfernt (gestrichelte quadratischen Umriss zeigt ursprüngliche Position Elektrodenanordnung) mit der Klebrigkeit (Pfeil) und Silikonkörper des verbleibenden Implantats. (B) Das Auge wurde mit der Längsquerschnitt angrenzend an die seziert Stift(Gestrichelte Linie). Die Klebrigkeit bleibt in der hinteren Wand der Augenmuschel (Pfeil) eingebettet ist, stabilisiert überwiegend von der Lederhaut. Der Gewebeschnitt, der die Klebrigkeit wurde zur Harzeinbettung und Schleifen (rechtes Segment) erstellt, während der Abschnitt, der die Netzhaut unter dem entfernten Elektroden-Array wurde für Standard-histologische Verarbeitung 16 (linkes Segment) erstellt. Ein Herrscher mit 0,5-mm-Raster ist an der Unterkante jeder Platte angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Epoxy Einbettung und Schleifen der Klebrigkeit und Netzhautgewebe. Fotos der Epoxy eingebettet und ausgerichtet Gewebeprobe, Schleifen, Beizen und Bildgebung des Tack und Netzhautgewebe. (A) Die tac<html> k Probe wurde in ein Epoxyharz Block eingebettet. Unter Verwendung der Form wurde die Probe so ausgerichtet, die Längsebene parallel zum Boden der Form ist. (B) Die ausgehärtete Epoxid Block die Klebrigkeit Probe enthält. (C) Das Epoxid Block wurde in einem Schleifprobenhalter montiert, bereit zum Schleifen . (D) Die Probe wurde die Bodenoberfläche der so orientiert abgebildeten Teile der Grundgewebe enthalten die Netzhautzellschichten und Längsachse des Tack. (E) Die Probe wurde gemahlen mit Siliziumkarbid-Papier auf einem Rotationsschleifer. (F) der Block mit Toluidinblau, um die Netzhautschichten zu identifizieren gefärbt. (G) Der Block wurde in Leitungswasser gespült, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. (H) Die Toluidinblau gefärbten Netzhautschichten und Tack wurden mit einem Hochleistungs-Dissektion Umfang abgebildet. ad / 52.348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4: Hohe und niedrige Strom Bilder der Klebrigkeit und Netzhaut. An verschiedenen Stellen während des Schleifprozesses Bilder wurden mit einem Binokular aufgenommen wurde, die Längsschnitte der Tack (Sternchen) durchdringt das Auge und Verlassen der Lederhaut (&#39;S&#39; ), angrenzende Silikon (Hash) und Toluidinblau gefärbt und ungefärbt Netzhaut (&quot;R&quot;). Beachten Sie, das sind lediglich Beispiele, die vorliegende Visualisierungstechnik zu demonstrieren und sind nicht repräsentativ für alle epiretinalen Implantat oder tack Einsetzen Histologie Ergebnisse. Boden Reste der Platin Verdrahtung sind sichtbar in Platten AD (&quot;W&quot;). (A) Niedriger Stromverbrauch, ungefärbten Bild des Tack Eindringen in die Netzhaut und Lederhaut. (B) Leistungsstarke Bild der Netzhautablösung und Falten in ungefärbten Netzhaut angrenzenden an den Silikonträger Bild A. (C) Low Bildleistung in der Mitte am Bolzenschaft. <strong&gt; (D) Hohe Leistungsbild der Mitte des Tack in Bild C (E) In einer separaten Probe, ohne Silikonträger wird ein Hochleistungs-Bild der Toluidinblau gefärbten Netzhaut unter dem Tack Griff gezeigt, unmittelbar vor Schleifen der tack Welle (F) Normale Toluidinblau gefärbten Netzhaut Architektur (GCL: retinalen Ganglienzellschicht; INL: innere Körnerschicht; ONL: äußere Körnerschicht; PR: Photorezeptoren; T: Katzen Tapetum lucidum). mit dem gleichen Schleiftechnik visualisiert . Maßstabsbalken in jeder Platte sind: A und C = 2 mm; B und D = 500 um; E = 200 um; F = 100 um.

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

11.5K Aufrufe.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Serie: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Forschung

Medizin

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

Quantitative Fundus-Autofluoreszenz für die Beurteilung von Netzhauterkrankungen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Retinale Bildgebung bei der Demenz zu studieren

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are now available for the shoulder, hip, ankle and the first metatarsalphalangeal joint. While providing pain reduction and clinical improvement, progressive degenerative changes of the opposing cartilage are observed in many patients. The mechanisms leading to this damage are not fully understood. This protocol describes a tribological experiment to simulate a metal-on-cartilage pairing and comprehensive analysis of the articular cartilage. Metal implant material is tested against bovine osteochondral cylinders as a model for human articular cartilage. By applying different loads and sliding speeds, physiological loading conditions can be imitated. To provide a comprehensive analysis of the effects on the articular cartilage, histology, metabolic activity and gene expression analysis are described in this protocol. The main advantage of tribological testing is that loading parameters can be adjusted freely to simulate in vivo conditions. Furthermore, different testing solutions might be used to investigate the influence of lubrication or pro-inflammatory agents. By using gene expression analysis for cartilage-specific genes and catabolic genes, early changes in the metabolism of articular chondrocytes in response to mechanical loading might be detected.

This protocol describes the preparation, biotribological testing, and analysis of osteochondral cylinders sliding against metal implant material. Outcome measures included in this protocol are metabolic activity, gene expression and histology.

Biotribologische Prüfung und Analyse von Gelenkknorpel gleiten gegen Metall für Implantate

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...