AF wurde durch einen Starting Grant des Europäischen Forschungsrates des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft unterstützt (FP7 / 2007-2013) / ERC Finanzhilfevereinbarung Nr 203.413 und von der Minerva-Zentrum für Bio-Hybridkomplex systems.HA und AI werden unterstützt durch das Dalia und Dan Maydan Fellowship für fortgeschrittene Studierende an der Hebräischen Universität von Jerusalem.

1. Entwerfen einer Peptidarray <ol><li> Teilen die Sequenz des Zielproteins in teilweise überlappenden Peptiden 10-20 Resten. Variieren Sie die Größe der Überlappung von der spezifischen Experiment und die Ressourcen der Durchführung Labor, aber im Prinzip, je länger die Überlappung, desto besser. Bei der Gestaltung der Peptide Berücksichtigung bekannter Sekundärstrukturelemente in das Protein, das für die Interaktion verantwortlich sein kann dauern. </li><li> Bestellen Sie die entworfen Peptidarray durch kommerzielle Anbieter. Hierbei kann die Verwendung Peptide kovalent an die Anordnung durch den C-Terminus gebunden ist. </li></ol> 2. Blockieren nicht-spezifischer Bindung <ol><li> Einen 50 mM Tris oder Phosphat-Pufferlösung, enthaltend 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) und Anpassung an den gewünschten pH-Wert mit einer abgemessenen Menge von HCl oder NaOH (um die exakte Ionenstärke weiß) und die gewünschte Ionenstärke mit NaCl . Hier verwenden einen pH-Wert von 7,5 und eine Ionenstärke von 150 mM. </li><li> Machen Sie eine Blockierungslösung von2,5% (w / v) Magermilchpulver in TBST / PBST. </li><li> Um unspezifische Bindung zu vermeiden, tauchen Sie das Array in 5 ml Blockierungslösung. Inkubieren des Arrays für 2-4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ºC auf einem Schüttler. </li></ol> 3. Inkubation mit dem Protein <ol><li> Zuerst mit 5 ml Blockierungslösung für 30 Sekunden und dann zweimal mit 5 ml TBST / PBST für 5 min auf einem Schüttler bei Raumtemperatur Waschen des Arrays. </li><li> Inkubieren der gewaschenen Array mit 5 ml His-tagged Protein-Lösung, die 2,5% (w / v) Magermilchpulver zu verhindern, nicht-spezifische Bindung. Hier verwenden 4,5 &amp; mgr; M-Protein-Lösung (STIL 500-650) in der beschriebenen Blockierungslösung gelöst. HINWEIS: In der Regel 5-10 &amp; mgr; M-Protein für das Screening verwendet werden, aber die Proteinkonzentration kann sogar so niedrig wie 2-3 &amp; mgr; M, abhängig von der Bindungsaffinität und die lokalen Konzentrationen der Peptide, die auf dem Array gebunden (Effizienz der Synthese). Der Puffer, in dem das Proteinaufgelöst wird, kann variieren, ist aber üblich, die Protein verdünnt unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Blockierungslösung. </li><li> Inkubieren der Anordnung in der Proteinlösung für 3-8 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ºC. </li></ol> 4. Inkubation mit dem Antikörper <ol><li> Dreimal mit 5 ml TBST / PBST waschen Array. Die erste Wäsche wird für 30 sec, gefolgt von zwei Wäschen 5 min am Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren der gewaschenen Array mit 5 ml der verdünnten HRP-konjugiertem Antikörper (1: 1500) in einem Inkubationspuffer, der die gleichen Bestandteile enthält, in den gleichen Konzentrationen als Blockierungslösung für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Der Antikörper kann entweder das Zielprotein oder den Tag bindet. </li><li> Kontrollexperimente durchzuführen Testen der Wechselwirkung des Antikörpers mit Peptiden, die auf der Anordnung, insbesondere dann, wenn das Array Peptide von dem Zielprotein (zB zur Oligomerisierung Studien) durch Wiederholung des gleichen Protokoll ohne step 3, Inkubation mit dem Protein. </li><li> Dreimal mit 5 ml TBST / PBST waschen Array. Die erste Wäsche wird für 30 sec, gefolgt von zwei Wäschen 5 min am Schüttler bei Raumtemperatur. </li></ol> 5. Lesen Sie den Array <ol><li> Führen Sie Chemilumineszenz Entwicklung mit einer ECL-Western-Blot-Substrat-Kit. </li><li> Führen Sie die Erkennung mit einem Leucht Bildanalysators. </li><li> Analysieren Sie die Ergebnisse. Stellen Sie sicher, dass beide Duplikate auf dem Array zeigen die gleichen Signale, so dass die Ergebnisse zuverlässig sind. Wenn die Struktur der Proteinpartner bekannt ist, suchen auf der Struktur um die Bindungspeptide und nach den Bindungsstellen. Auch Peptide, die weit in der Sequenz sind nahe beieinander in der Tertiärstruktur und schaffen eine Bindungsstelle. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Peptidarray-Screening ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Identifizierung der Bindungsstellen eines Zielproteins in seine Partner. Dieser Test ist schnell und einfach durchzuführen und die Ergebnisse können in einem oder zwei Tagen erhalten werden. Peptidarray Screening ist vielseitig und kann für viele Zwecke verwendet werden. Es kann für die Charakterisierung von Übersetzungs- Modifikationen wie Phosphorylierung und Identifizieren Substrate von Kinasen eingesetzt werden. Zum Beispiel: der FLT3-Kinase, die verwandt ist mit myeloischer Leukämie akut, phosphoryliert Tyr haltigen Substrat Peptide durch ein Peptidarray Screening 6 gefunden. Die hemmenden Eigenschaften der Tyrosinkinase-Inhibitoren und pazopanib Lapatinib wurde mit Peptidanordnung 23 Screening getestet. Peptide Array kann verwendet werden, um die Websites, die Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln zu identifizieren. Beispiele für solche Proteine ​​untersucht in unserem Labor unter Verwendung dieses Verfahrens sind: die Wechselwirkung zwischen dem HIV-1-Vif-Protein und Zell A3G Protein wurde uns gekennzeichneting ein Peptidarray 24; Peptidarray Screening wurde verwendet, um die Wechselwirkungen des anti-apoptotischen BCL-2-Familie mit der pro-apoptotischen Proteins ASPP2 25 zu prüfen und zu untersuchen, die Bindung von TBID, einem Mitglied der BCL-2-Familie, mit der mitochondrialen Protein MTCH2 26; die intramolekulare Wechselwirkung zwischen Myosin IIC Domänen wurde mit Peptidarray Screening 27 analysiert. Hier präsentieren wir ein Beispiel, wie wir früher Peptidarray Screening zur Identifizierung der Websites, die den STIL-CHFR Interaktion, ein Protein-Protein-Wechselwirkung bei der Proliferation und Krebs 14 wichtig zu vermitteln. Enthüllung des genauen Bindungsstelle kann als Grundlage für das rationale Design von Inhibitoren der studierte Interaktion dienen. Die Peptidanordnung Screening keine quantitativen Assay. Es ist semi-quantitative da die Menge des Peptids in jeder Spot auf der Anordnung variiert aufgrund des Unterschieds in der Synthese-Ausbeute und Reinheit des Peptids. Dies wiederum hängt von der Peptide-Sequenz, Länge usw. die Variation in Ausbeute und Reinheit kann auch manchmal zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen. Vergleich der Intensitäten innerhalb desselben Arrays können hergestellt werden, was in semi-quantitativen Ranking. Aber solche Vergleich zwischen verschiedenen Arrays oder verschiedene Experimente mit der gleichen Anordnung ist nicht zuverlässig. Um die Bindung zu quantifizieren, sind die Peptide in der Peptidarray Screening gefunden synthetisiert und zur Bindung des Zielproteins mit biophysikalischen Methoden wie Fluoreszenz-Anisotropie, isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), Oberflächenplasmonresonanz (SPR), etc. Solche Assays getestet werden, nicht immer empfindlich gegen schwache Bindung da sie eine hohe Konzentration des Proteins zu detektieren solchen Bindung. Die Peptidanordnung Screening andererseits sehr empfindlich auf eine schwache Bindung. Somit könnten einige der in dem Array-Screening beobachteten Wechselwirkungen beobachtet oder quantifiziert werden unter Verwendung von Verfahren wie Fluoreszenz anisot<html> ropy 14. Die Tatsache, dass Peptid-Array-Screening erfordert sehr geringe Konzentrationen von Protein in Kombination mit der hohen Empfindlichkeit des Assays machen die Peptidanordnung eine nützliche Methode für das Screening von Protein-Peptid-Wechselwirkungen in einem breiten Bereich von Affinitäten. Falsch negative Ergebnisse können auch aufgrund der Tatsache, daß lineare Peptide können nicht richtig repräsentieren die 3D-Struktur der Bindungsstelle im Protein sein. Dies ist jedoch nicht ein Problem mit intrinsisch ungeordneten Proteinen, die auch von Peptiden vertreten sind. Falsch positive Ergebnisse können auch durch Bindung des Antikörpers an die Anordnung verursacht werden. Dies kann durch Durchführen einer Kontrollexperiment wie im Protokoll Abschnitt 4.3 beschrieben, nachgewiesen werden. Falsch negative Ergebnisse können auch erhalten werden, wenn das Protein-Epitop, das durch den Antikörper erkannt wird, werden unbelichtete bei Bindung an den Peptidarray. Dieses Problem ist nicht üblich, kann aber durch Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen das Protein, gelöst werden. jove_content &quot;&gt; Die Peptidanordnung Screening kann auch zur Verbesserung der Führung Peptide, einschließlich Alanin-Scan und SAR-Studien 7 verwendet werden. Sobald die Bindungsstelle des Ziels bekannt ist, kann eine Anordnung auf der Grundlage seiner Sequenz mit mehreren Modifikationen einschließlich Austausch der jeweils ausgebildet werden Rest durch Alanin (Ala-Scan), um die wichtigen Reste für die Interaktion zu identifizieren. In einer ähnlichen Weise kann SAR-Studien durch Änderung verschiedener Eigenschaften der Bindungspeptide durchgeführt werden. Diese umfassen Variieren der Länge des Peptids ersetzt Reste durch das entsprechende D -Aminosäuren und andere Modifikationen, wie Methylierung, Glykosylierung und Ersatz von nicht-natürlichen Aminosäuren. Solche modifizierten Peptide, die alle auf einer Zielsequenz kann auf einem Array synthetisiert und zur Bindung des Zielproteins in einem schnellen und einfachen Versuch gescreent werden, , die eine Fülle von Informationen für das Verbessern eines potentiellen Inhibitors, und das Verständnis des molekularen Mechanismus der Wechselwirkung. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Die Methode zur Peptidarray Screening ist sehr flexibel und Änderungen im Protokoll kann bei Bedarf angewendet werden. Andere blockierenden Verbindungen neben Milch, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Saccharose eingesetzt werden. Wenn die nichtspezifische Bindung festgestellt, sollten höhere Konzentrationen an Milch / BSA / Saccharose verwendet werden. Das Protein kann mit der Anordnung in jedem gewünschten Puffer inkubiert werden, aber es ist wichtig, zu dem Puffer Milch / BSA / Saccharose oder andere Blocker, die in der Blockierungslösung verwendet wird, hinzuzufügen, unspezifische Bindung zu verhindern. Die Proteinkonzentration sollte relativ niedrig bleiben, und eine starke Bindung kann sogar mit 3-5 um Protein beobachtet werden. Das Volumen der Inkubation in allen Schritten (Blockierung, die Inkubation mit dem Protein oder den Antikörper und Waschen) sollte ausreichen, um die Anordnung vollständig zu bedecken. Normalerweise 4-5 ml sind ausreichend. Ein sekundärer Antikörper kann verwendet werden, wenn der primäre Antikörper nicht nachweisbar. In diesem Fall die Schritte 6 und 7 sind mit Verdünnung und Inkubationszeiten wiederholt werdendass passen die spezifischen sekundären Antikörper. Das Nachweisverfahren ist abhängig von den Antikörper. Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte Antikörper wird Chemolumineszenz üblicherweise verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Verschiedene Alternativen für verschiedene Antikörper, wie Fluoreszenz oder elektro Chemilumineszenz 4 verwendet werden. Die hier beschriebene Peptidarray ist nur zum einmaligen Gebrauch und können nicht wiederverwendet werden. Die hier vorgestellte Protokoll zeigt die breite Verwendbarkeit der Peptidarrays. Mit einem richtig ausgelegt Array können Bindungsstellen zwischen zwei Proteinen im Detail identifiziert werden. Sobald die Bindungsstelle wird auch dadurch kann es als Medikament zur Hemmung der Zielstelle für das relevante Protein-Protein-Wechselwirkung verwendet werden. Auf der Grundlage der bindenden Peptide im Array-Screening gefunden wird, kann hemmende kleine Moleküle entworfen und als Drogen Leitungen abgeschirmt werden.

Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in der lebenden Zelle. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine ​​durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dies ist, weil Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Fokussierung auf einen bestimmten Interaktionsstelle einerseits und auf mehreren Protein-Targets in einem Hochdurch Weise auf der anderen Seite 1,2. Peptidarray Screening ist eine schnelle, einfache Verfahren zur Gewinnung einer großen Menge von Daten über die Wechselwirkungen eines Zielproteins mit zahlreichen Partnern in einer kurzen Zeit durchzuführen 3. Im Gegensatz zu anderen biochemischen oder biophysikalischen Methoden zur Detektion und Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Peptid-Array-Screening erfordert eine sehr geringe Konzentration an Protein und sehr schwache Bindung zu detektieren. Peptid-Arrays können für viele Anwendungen in der Peptid-Protein-Wechselwirkungen, wie Mapping von Protein-Protein oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstellen 4, Homo- oder Hetero-Oligomerisierung Schnittstellen verwendet werden, kennzeichn Antikörper Epitope 5, studiert Enzymaktivitäten 6 und hohen Durchsatz struktur Aktivitäts-Beziehung (SAR) studiert 7. Für eine eingehende Bewertung Peptidarray Screening siehe Katz et al. 4 Verschiedene Arten von Peptidarrays existieren derzeit. Es gibt zwei Hauptstrategien für die Herstellung von synthetischen Peptidarrays: Synthese der Peptide vor der Befestigung an dem festen Träger oder der Synthese von Peptiden direkt an den festen Träger, vor allem mit Hilfe der SPOT-Technik 4,8. DiePeptide auf dem festen Träger in der Regel von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Chemie 8 synthetisiert. Unter den gemeinsamen Syntheseschemata sind Peptid Befestigung durch den N-Terminus (zB JPT Pepstar Arrays 9) und Peptid-Anlage durch den C-Terminus (zB PEPSCAN pepchip Arrays 10, JPT pepspot Arrays 9 und INTAVIS celluspot Arrays 11) 4. Der feste Träger kann variieren und damit auch die Chemie der Peptidkupplung zu. Cys-terminierten Peptide können über die Thiolgruppe 12 auf Glasobjektträgern befestigt werden. Der N-Terminus eines Peptids kovalent an eine Hydroxylgruppe an der Cellulose-Membran, durch Veresterung der Aminosäure gebunden befestigt 8. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für das Screening von Peptid-Arrays als ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Das Array verwendeten wir die Celluspots Array, das ein Mikroarray mit großen amo istunt von Flecken (Duplikate bis 384 Spots) auf einer kleinen Cellulosemembran durch einen Glasträger unterstützt. Dies ermöglicht das Arbeiten mit geringen Mengen an Protein und Antikörper und erhalten erhebliche Menge an Daten pro einzigen Experiment. Dieses Array enthält auch eine hohe Dichte, die Peptid-Detektion mit geringer Affinität bindenden ermöglicht. Das Array wurde zur Kartierung des STIL-CHFR Interaktion, die sehr wichtig für die normale Zellproliferation 13 Steuerung verwendet wird. Unkontrollierte Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen zur Entwicklung von Krebs. Durch die Abbildung dieser Wechselwirkung fanden wir die spezifische Bindungsstelle und Bindungsreste 14. Dies ebnet den Weg für die Entwicklung rationeller Inhibitoren, die diese Protein-Protein-Wechselwirkung hemmen.

<table><tbody><tr><td>Peptide array</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe Antibody (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biological industries</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 camera&amp;nbsp;</td><td>FUJI film</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays

Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in lebenden Zellen und die Kontrolle der Homöostase des Organismus. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine ​​durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu studieren, da Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Konzentration auf bestimmte Interaktionsstellen. Peptidarrays ermöglichen die Identifizierung der Interaktionsstellen zwischen zwei Proteinen sowie Screening nach Peptiden, die das Zielprotein für therapeutische Zwecke binden. Sie erlauben auch einen hohen Durchsatz SAR-Studien. Zur Identifizierung der Bindungsstellen, eine typical Peptidanordnung enthält in der Regel teilweise überlappenden Peptiden 10-20 Resten der vollen Sequenzen von einem oder mehreren Partnerproteine ​​der gewünschten Zielprotein. Screenen des Arrays zur Bindung des Zielproteins zeigt die Bindungspeptide, die den Bindungsstellen in den Partnerproteine, in einer einfachen und schnellen Verfahren mit nur geringen Menge an Protein. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für das Screening von Peptidarrays für die Abbildung der Interaktionsstellen zwischen einem Zielprotein und seine Partner. Die Peptidanordnung ist auf der Basis der Sequenzen der Partnerproteine ​​unter Berücksichtigung ihrer Sekundärstruktur ausgebildet. Die in diesem Protokoll verwendeten Arrays waren Celluspots Arrays INTAVIS Bioanalytische Instrumente vorbereitet. Das Array wird blockiert, um unspezifische Bindung zu verhindern und anschließend mit dem untersuchten Protein inkubiert. Nachweis unter Verwendung eines Antikörpers offenbart die Bindungspeptide, die den spezifischen Wechselwirkungsstellen zwischen den Proteinen.

STIL ist ein sehr wichtiger zentrosomalen Protein. Es steuert die normale Zellteilung und Zellproliferation 13,15 - 19. STIL interagiert mit mehreren Proteinen, 18,20,21, und die meisten Interaktionen durch seinen zentralen Teil, die ein intrinsisch ungeordneten Bereich (IDR) 14 auf. Wir haben eine Reihe von Peptiden aus dem STIL Bindungsprotein CHFR abgeleitet sind. CHFR ist ein Tumorsuppressor, der in Reaktion auf Stress induzierten mitotischen 22. Da die Struktur der Bindungsdomäne von STIL CHFR unbekannt war zu dem Zeitpunkt, teilten wir die Proteindomäne zu 15 Reste langen Peptiden mit Überlappung von 7 Resten, wie im Schritt 1.1 in dem Protokoll beschrieben. Wir führten eine Peptidarray Screening zur Identifizierung der CHFR-STIL Bindungsstellen, wie in dem obigen Protokoll beschrieben und in 1 dargestellt. Wir verwendeten eine INTAVIS Celluspot Array von 384 Peptiden in Duplikaten zusammengesetzt, die eine liefern kann<html> riesige Informationsmenge, wie in Figur 2 gezeigt. Unter Verwendung dieser Peptidanordnung fanden wir die Bindungsstellen für STIL in seinem Bindungsprotein CHFR (Abbildung 3). Jeder schwarze Punkt im Array stellt eine CHFR abgeleitetes Peptid, das STIL gebunden. Beachten Sie, dass jedes Peptid erscheint zweimal, da es in zweifacher Ausfertigung, die die Zuverlässigkeit der Ergebnisse überprüft existiert. Die Wechselwirkung zwischen STIL und CHFR wurde zuvor auf der Proteinebene nachgewiesen 13,14. Die Peptidanordnung Screening ergab 7 CHFR abgeleitete Peptide, STIL IDR gebundenen Resten 500-650 (Abbildung 3, Amartely et al. 14). Diese Ergebnisse konnten wir die Bindungsstelle von STIL auf CHFR abzubilden. Trotz der Entfernung von diesen 7 Peptide auf CHFR Primärsequenz schaffen sie eine wohldefinierte Bindungsstelle für STIL in CHFR (Abbildung 4) 14. <html> 7 / 52097fig1highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Ein Schema der Peptidarray Screening A- Entwerfen einer Peptid-Array, das von teilweise überlappenden Peptiden aus einer oder mehreren Partner Proteinen abgeleitet besteht, unter Berücksichtigung ihrer Sekundärstrukturen;. B- Inkubation mit dem Zielprotein; C- Inkubation mit einem Antikörper für den Nachweis; D- Erkennung (durch Chemilumineszenz, Fluoreszenz, usw. durchgeführt werden); E- Analyse der Ergebnisse der Proteinbindungsstellen zu offenbaren. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52097/52097fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52097/52097fig2highres.jpg" /> Abbildung 2:. Ein Beispiel Peptidarray Screening Erkennung anhand Chemilumineszenz erreicht Die Folie enthält zwei identische Arrays als Duplikate..es / ftp_upload / 52.097 / 52097fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52097/52097fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Screening einer Peptidarray für die Bindung von STIL IDR zu CHFR Protein: 4,5 um His-STIL 500-650 wurde für die Bindung des Array gescreent. Jeder schwarze Punkt weist auf die Bindung zwischen dem STIL-Fragment und dem CHFR abgeleitetes Peptid 14. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52097/52097fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52097/52097fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Die STIL-Bindungsstelle in CHFR über die Struktur des CHFR Cys reiche Domäne gezeigt (Reste 424-661, PDB ID: 2XPO) Die sieben.Peptide, STIL in der Peptidarray Screening gebunden werden können, um drei Bereiche farbig rosa, orange und rot, die ferne in der Primärsequenz sind, aber nahe beieinander in der 3D-Struktur schaffen eine Bindungsstelle eingeteilt werden. Das Full-Region bildet eine Bindungstasche für STIL im Dimer CHFR 14. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52097/52097fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem. Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Serie: Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Forschung

Biochemie

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates approaching 85% are common. Unfortunately, patients often become refractory to the treatment by altering their signal transduction pathways. An implementation of the expression profiling with microarrays can identify the overall mRNA-level changes, and proteomics can identify the overall changes in protein levels or can identify the proteins involved, but the activity of the signal transduction pathways can only be established by interrogating post-translational modifications of the proteins. As a result, the ability to identify whether a drug treatment is successful or whether resistance arose, or the ability to characterize any alterations in the signaling pathways, is an important clinical challenge. Here, we provide a detailed explanation of antibody arrays as a tool which can identify system-wide alterations in various post-translational modifications (e.g., phosphorylation). One of the advantages of using antibody arrays includes their accessibility (an array does not require either an expert in proteomics or costly equipment) and speed. The availability of arrays targeting a combination of post-translational modifications is the primary limitation. In addition, unbiased approaches (phosphoproteomics) may be more suitable for the novel discovery, whereas antibody arrays are ideal for the most widely characterized targets.

Here, we present a protocol for antibody arrays to identify alterations in signaling pathways in various cellular models. These changes, caused by drugs/hypoxia/ultra-violet light/radiation, or by overexpression/downregulation/knockouts, are important for various disease models and can indicate whether a therapy will be effective or can identify mechanisms of drugs resistance.

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Krebsforschung

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Immunologie und Infektion

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Biologie

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Source: Cornett, E. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55912">Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody&#39;s specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

Eine Peptid-Microarray-Technologie zur Erstellung von Spezifitätsprofilen von Antikörpern

1. Designing the Array Slide and Source Plate Layout

	Under the &#39;Plan a slide layout&#39; heading on the ArrayNinja interface, click on the link that ...