Name: assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells
Uploaded: 2014-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der US-Israel-BSF finanziert, um BS und EDSBS ist ein Inhaber des Hilda und Cecil Lewis Professur in Molekulargenetik.

HINWEIS: Verfahren mit tierischen Patienten wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) am Weizmann Institute of Science genehmigt worden. 1. Probenvorbereitung <ol><li> Isolierung von Pankreasazini <ol><li> Bereiten Sie 300 ml frischem Krebs-Ringer-Bicarbonat HEPES (KRBH) Medium vor dem Start. Mischen 140 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11 mM Glucose, 10 mM HEPES. Hinzufügen Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mg / ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI) (Resuspensionsmedium). Bereiten 5 - 10 ml Resuspensionsmedium mit Kollagenase (~ 0,75 mg / ml) (Digestionsmedium) ergänzt. </li><li> Oxygenieren die KRB Medium für ~ 30 min. Fügen BSA nach Sauerstoffblasenbildung zu verhindern. Bringen Aufwirbelung und Verdauung Medien bis 37 ° C. HINWEIS: Sauerstoffanreicherung des Mediums reduziert Zellmortalität und verbessert Reaktionsfähigkeit auf die Sekretion. Die Wirkung der Oxygenierung mindestens 6 h deutlich. </li><li&gt; Opfer der Maus durch Genickbruch oder CO 2 Erstickung, nach institutionellen Tierpflege-Richtlinien. Legen Sie das Tier geopfert auf dem Rücken, verbinden Sie es mit einer Dissektion Pad und reinigen Sie die Bauchdecke mit Ethanol. HINWEIS: Um Verunreinigungen zu vermeiden, Autoklaven werden die Dissektion Werkzeuge und die für KRBH Medium vor Gebrauch verwendete Wasser. Filtern KRBH Medium durch ein 0,2 um-Filter. Vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse die Dissektion Werkzeuge mit 70% Ethanol spülen und durchzuführen Dissektion auf eine saubere Bank. Durchführung von Virusinfektionen in einem Level 3 Bio-Sicherheitsschrank. Fügen Antibiotika auf den O / N Kulturmedium (siehe Abschnitt 4). </li></ol></li><li> Ausschneiden des murinen Pankreas <ol><li> Schnitt weit die Bauchhaut und Unterhaut. Identifizieren Sie die Leber, Magen, Darm, Bauchspeicheldrüse und Milz (Abbildung 1). HINWEIS: In den folgenden Schritten, behandeln die Pankreasgewebe vorsichtig und vermeiden Sie übermäßigen mechanischen force auto-Verdauung des Gewebes und Zelltod verhindert. </li><li> Durch die Verwendung von zwei stumpfen Pinzette, ziehen Sie den Dünndarm. Beginnen an den Dünndarm proximalen Ende, nahe dem Ausgang aus dem Magen. Trenne die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm und bewahren Sie sie in der Körperhöhle. Nach Erreichen des Dickdarms, bemerken eine rosa / weiß Bindegewebe. Nicht zu verwechseln mit der Bauchspeicheldrüse. </li><li> Zu löschen, so viel Pankreasgewebe wie möglich, ohne das Sammeln Fett oder Bindegewebe. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse durch Lösen aus der Milz und Magen und Schneiden der Bauchblutgefäße darunter (Abbildung 1A-C). HINWEIS: Da die Ausbeute an Pankreasazini von einem einzigen Tier hoch ist, kann man von Sammeln aller Pankreasgewebe um das Sammeln anderer Gewebe zu verhindern, zu unterlassen. </li></ol></li><li> Collagenaseverdau <ol><li> Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse ein paar Mal in Resuspensionsmedium auf 37 ° C erhitzt und entfernen übrigen Teile des nicht-Pankreas-Gewebe. Tauchen Sie in die Bauchspeicheldrüse ~ 5 ml vorgewärmten Verdauung Medium in einem 20 ml Szintillationsfläschchen. Hackfleisch in der Bauchspeicheldrüse an Stücke von 1-3 mm. Legen Sie sie in einem beheizten Wasserbad (optimal unter Rühren von ~ 100 rpm). , Um die Verdauung zu beschleunigen, Pipette der verdauten Gewebe auf und ab, wenn alle paar Minuten. HINWEIS: Die Dauer Collagenaseverdau hängt hauptsächlich von der Kollagenase-Konzentration und der Menge der mechanischen Kraft auf das Gewebe aufgebracht. Verwendung von 0,75 mg / ml Collagenase für ungefähr 15 min und Pipettieren der Gewebe mit einer 5 ml Polystyrolpipette mit einer 2 mm Düse alle 3 - 5 Minuten, was zu Acini 10-30 Zellen. Nach der Verdauung, wird die Suspension trübe, die sichtbare Gewebestücke. Seit Collagenasen Effizienz variiert zwischen verschiedenen Handelstypen und viele, bestimmen den Zeitpunkt der Verdauung empirisch. </li><li> Waschen und Filtrieren <ol><li> Übertragen Sie das verdaut Gewebe in einem 50-ml-Tube und beenden digestion durch Zugabe von 45 ml Medium resuspendiert. Filtern der Suspension durch ein grobes (~ 1 mm) Metallnetz in ein frisches Röhrchen. Zentrifugieren des Durchflusses bei 100 × g für 3 min. </li><li> Überstand verwerfen und suspendiert die Bauchspeicheldrüse verdaut in 50 ml Resuspensionsmedium. Filtern der Suspension durch ein 70 oder 100 um Nylonnetz. Zentrifuge vor. </li><li> Um schwimmende, beschädigte Acini zu entfernen, den Überstand verwerfen und resuspendieren Pankreasgewebe in 3-5 ml Resuspensionsmedium. Es wird 1 ml der Pankreas-Acini in 15 ml konischen Röhrchen mit 7 ml Resuspensionsmedium gefüllt. Lassen Sie die Acini für 2 beigelegt - 3 min. Sammeln Sie die Acini, die am Boden der Röhre mit einer 1 ml Pipette angesiedelt haben, und wiederholen Sie diesen Schritt 2 - 3 mal. </li><li> Sehen Sie sich die Pankreasazini unter einem Lichtmikroskop oder sezieren, um ihren Zustand zu prüfen. In Abbildung 2, beobachten die Reinheit der Isolation und der Schäden auf die Zellen Duri zugefügtng Isolation. Verwenden Sie diese Acini sofort oder Kultur für bis zu 20 Stunden. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Amylase Sekretion Assay HINWEIS: Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß für die sekretorische Kapazität von Pankreasazini. Dies wird durch Sammeln des Mediums, in dem das Pankreas-Acini wurden inkubiert, und die Bestimmung der Amylaseaktivität des Mediums, in der Regel unter Verwendung eines kommerziellen Kits erreicht. <ol><li> Bestimmen der Anzahl von experimentellen Bedingungen untersucht werden (zB nicht-stimulierten versus stimuliert). Verwenden Sie mindestens drei Wiederholungen für jede Bedingung. Außerdem fügen Sie eine Reihe von Wiederholungen, um die Gesamtzell Amylase-Gehalt (&#39;Total&#39; Probe) und einen Satz für die Amylase-Aktivität des Mediums (&quot;Null&quot;-Probe) zu bestimmen. Label eine Multi-Well-Platte, in der der Assay durchgeführt werden, und zwei Sätze von Mikroröhrchen für jede der Wiederholungen verwendet werden. HINWEIS: 12 oder 24-Well-Plattes kann zur Überwachung 1 und 0,5 ml acinar Suspensionen, bzw. werden. </li><li> Zweimal waschen Sie die Acini in 30 ml KRBH Resuspensionsmedium und Inkubation sie in Resuspensionsmedium für 30 min bei 37 ° C. Um die Multi-Well-Platte fügen Sie ein 10 ul Tropfen secretagogue die angemessene endgültige Konzentration zu erreichen. </li><li> Pankreasazini reagieren auf eine Steigung von secretagogue in einem zweiphasigen Weise. Die Konzentrationen optimale Sekretion Werte von 50 bis 100 pM von Cholecystokinin (CCK) und 1 uM Carbachol (3A) 5. </li><li> Waschen und resuspendieren Acini in Resuspensionsmedium. Stellen Sie sicher, dass die Acini sind homogen in der Suspension und aliquoten gleiche Mengen von Suspension in die Multi-Well-Platte und in die &#39;total&#39;-markierten Mikroröhrchen verteilt. Inkubiere die Platte für 30 min bei 37 ° C aufweist. (Vorzugsweise in einem Wasserbad unter leichtem Schütteln (~ 50 min)). HINWEIS: Die genaue Zahl der Acini zwischen experimen variierents sollte aber ähnlich in Wiederholungen innerhalb der einzelnen Experiment. So ist präzise Aliquotierung der Acini Suspension entscheidend für den Vergleich zwischen den verschiedenen Wiederholungen und Bedingungen. </li><li> Während der Inkubation produzieren die &quot;Gesamt&quot; und &quot;Null&quot;-Proben. Zentrifugieren Sie die &quot;Gesamt&quot; Mikroröhrchen für ein paar Sekunden bei 5.000 × g und entfernen 50 ul aus dem Überstand in &#39;zero&#39;-markierten Mikroröhrchen und legen Sie sie bei 4 ° C. Lyse der Acini in den &quot;Gesamt&quot;-Proben durch Zugabe von Triton X-100 zu den Mikroröhrchen, um eine endgültige Konzentration von 1% zu erreichen. Mischen Sie den Mikroröhrchen kräftig. HINWEIS: Aliquote &quot;Insgesamt&quot; repliziert ähnlich wie bei den Wiederholungen des Experiments. Lyse der Azini, führt zur Freisetzung des gesamten Amylase-Gehalt. Alternativ erfassen die Acini zu jedem Zustand und Lyse am Ende des Experiments, um den zellulären Gehalt an jede Wiederholung zu bestimmen. </li><li> Sammeln Sie die meisten der acinar Suspension inin der ersten Reihe von den pre-markierten Mikroröhrchen. Zentrifugieren der Mikroröhren für einige Sekunden bei 5000 × g auf. Den Überstand in den zweiten Satz der vorge markierten Mikroröhrchen. </li><li> Assay des Überstands für die Amylase-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit. Berechnen Sie den Prozentsatz der Amylase sezerniert. Hinweis: Es ist entscheidend, die Amylase-Aktivität in seinem linearen Bereich zu lesen. Präsentieren der Prozentsatz der Amylase als Prozentsatz der Amylase von der anfänglichen Gesamtgehalt freigesetzt sezerniert. Subtrahieren Sie die Hintergrundebene Amylase des Mediums aus jeder dreifacher Ausfertigung und teilen sie durch die ebenfalls normierten Anfangsgesamtgehalt. </li></ol> 3. Live-Imaging von Pankreas-Sekretion Sekretion aus Pankreasazini kann direkt durch Live-Bildgebung überwacht werden. Mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen und Sensoren ermöglicht die Live-Darstellung die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung. <ol><li> Frisch herstellen Sauerstoff angereichert Resuspensionsmedium wie ichSchritt n 1.1 und bringen es auf 37 ° C. Stellen Sie das Mikroskop, und wenn mit einem Temperaturregler ausgestattet, passen sie auf 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Azinuszellen in 30 ml Resuspensionsmedium und legen Sie sie in einem Glas oder Kunststoffrutsche. Hinweis: Wenn lipophile Farbstoffe verwendet werden, um Label für Plasmamembran mit lipophilen Farbstoffen markiert, färben die Acini für nicht mehr als 5 min auf die Kennzeichnung von internen Membranen, die durch Endozytose zu verhindern. Während der Arbeit, übernehmen die Acini vorsichtig und vermeiden Pipettieren. </li><li> Einmal am Mikroskop ist die Bild Acini, deren Morphologie klar, und Bildgebung von Acini die basolaterale Bläschen oder intrazelluläre Vakuolen Display zu vermeiden. Hinzufügen Sekretagogum tropfenweise oder mit Hilfe einer Perfusionskammer, entweder während oder unmittelbar vor dem Beginn der Bilderzeugung. Hinweis: Ein hoher Vergrößerung Objektive mit hoher numerischer Aperturen (zB × 63 / 1,4 × 100 oder / 1.4) wird empfohlen, subzellulärer Strukturen zu beobachten. </li></ol> 4. O / N Kultur Pankreasazini (Alternate Zellkulturtechnik) HINWEIS: O / N Kultivierung wird oft für Adeno-Virus-Infektion eingesetzt. 16 h vor der Untersuchung - Infektion wird bei 10 6 bis 10 7 pfu / ml für 9 durchgeführt. <ol><li> Kultur Pankreasazini für bis zu 20 Stunden. Aus einer einzigen Pankreas in 25 ml Kulturmedium (DMEM resuspendiert erhalten Acini mit fötalem Kälberserum (FCS) (5%), Natrium-Pyruvat (1%), Antibiotika (1%), L-Glutamin (0,5%), BSA ergänzt (10 mg / ml) und STI-(0,2 mg / ml), und geteilt zu fünf 10cm-Platten. infizieren die Acini mit Virus in einer Ebene 3 Bio-Sicherheitsschrank. </li><li> Inkubiert Pankreasazini bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchtete Luft. Ermöglichen Acini in sauerstoffhaltigen Resuspensionsmedium 30 min zu erholen, bevor nachfolgende Untersuchung 3,8. </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Neben der Ex-vivo-Kultur, alternative Setups für das Studium der exokrinen Sekretion gehören Intravitalmikroskopie und die Messung von Flüssigkeiten aus dem Pankreasgang. Intravitalmikroskopie wurde gezeigt, dass in der Maus Speicheldrüsen 10 gut bedienen. Dieses Verfahren kann die Sekretion in Echtzeit in dem intakten Tier aufnehmen, wird aber in der Auflösung und durch die Einrichtung zum Manipulieren des exokrinen Gewebe beschränkt. Beurteilung Sekretion durch Sammeln von Flüssigkeiten aus dem Pankreasgang wurde an narkotisierten Ratten 11 erreicht. Da Kanülierung des Pankreasganges ist extrem schwierig, dieses Verfahren wird selten verwendet. Verglichen mit diesen Einstellungen ist der Ex-vivo-Kultur von Pankreasazini einfache, schnelle und ermöglicht zugängliche Mittel zur Überwachung und Manipulation der Zellen, ohne sich mit der Organisation des intakten Gewebes 4,5. Dennoch hat dieses Setup seine Mängel. Bauchspeicheldrüsen-Azinuszellen sind zart in der Natur und sehr empfindlich auf Veränderungen der Kulturbedingungen. Da die Zellen mit proteolytischen Enzymen beladen, sie sind anfällig für die Lyse und Zelltod. Infolgedessen ist diese Kultur von kurzer Dauer und in der Regel nicht mehr als 20 Stunden dauern. Es ist immer gut zu erkennen und Probleme zu beheben, wie sie entstehen. Die wichtigsten methodischen Schritt ist intakt Pankreasazini ohne signifikante Anzeichen von Zellschäden und Mortalität zu isolieren. Solche Zeichen sind leicht erkennbar und umfassen übermäßigen Zelltrümmer und Acini mit basolateralen Bläschen oder intrazelluläre Vakuolen. In der Amylase-Sekretion Assay wird Zellschäden auf einen niedrigen angeregt / nicht-stimulierten Sekretion Verhältnis führen. Um solche Schäden zu vermeiden, ist es empfehlenswert, um das Gewebe schonend zu behandeln, fügen BSA und STI auf das Medium, und es mit Sauerstoff anzureichern. Beispielsweise und ohne Sauerstoffzufuhr, übermäßiger Entladung der Zelle von Amylase Masken die stimulierende Wirkung des Sekretagogum (Abbildung3C). Doch wegen der Zerbrechlichkeit der exokrinen Gewebe, einige Gewebeschaden fast unvermeidlich - solche Präparate sollte verworfen werden. 2 Tage - für die Amylase-Sekretion-Assay, der Überstand, der die sekretierten Amylase enthält, aber frei ist von Zellen, bei 4 ° C für 1 gehalten werden. Dieser Überstand ist dann mit einem kommerziellen Kit getestet werden. Vielen verfügbaren Kits basieren auf einer Spaltung einer künstlichen Amylase Substrat und die anschließende Freisetzung eines Chromophors. So, höhere Konzentrationen führen Amylase zu einer schnelleren Änderung in der Farbe der Lösung. Da das sekretierte Amylase wird letztendlich alle Chromophor von dem Substrat, ist es wesentlich, die Reaktion über die Zeit verfolgen, und nur die während der linearen Phase gesammelten Daten. Live-Darstellung von Pankreasazini kann eine frustrierende Erfahrung für den Forscher sein. Einige Zellpräparate, vor allem die von infizierten Acini, möglicherweise nicht geeignet für Live seinBildgebung aufgrund beeinträchtigt Morphologie der Acini oder unzureichende Höhe der Fluoreszenzsensoren. Auch in geeigneten Zubereitungen kann es einige Zeit dauern, geeignete Proben zu finden. So Bildgebung erhebliche Zeit in Anspruch. LifeAct-GFP, ein F-Actin-Sonde, ist bemerkenswert, 12. Dieses Tool erlaubt es uns, die Dynamik des F-Aktin während Pankreas-Sekretion für bis zu 16 Stunden nach der Infektion zu folgen, auf einem Niveau von Auflösung, die nicht in festen acinar Proben erreicht werden konnte. Zusätzlich Einsatz der Sonde aktiviert LifeAct Verfolgung von Einzel Exozytose Ereignisse, wie Bauchspeicheldrüsen Zymogen Vesikel Aktin-Beschichtung unterziehen kurz vor Exozytose 3,13. Kollektiv, wenn gemeistert, die hier beschriebenen Techniken bieten die Forscher bedeutet, Pankreas-Sekretion zu bewerten und durch Baum sie neue Teilnehmer in diesem mehrstufigen Prozess zu identifizieren. Zusätzlich im Hinblick auf die strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten zwischen den Pankreas und anderen Organen exokrinen,Diese Techniken können auch auf andere exokrinen Gewebe und 3 angewendet werden.

Exokrinen Pankreas bildet den größten Teil der Masse des Säugerpankreas und arbeitet an der Produktion und Sekretion von Verdauungsenzymen 1. Die Funktionseinheit des exokrinen Pankreas, Azinus, ist ein Cluster von Epithelzellen, die ein gemeinsames Lumen bildet und Anteile. Auf hormonelle oder neuronale Stimulation werden Vesikel mit Enzymen gefüllt, um der apikalen Zelloberfläche transportiert mit ihm, Sicherung und vertreiben ihre Inhalte in das Lumen 1-3. Die sekretierten Enzyme werden dann durch einen Koaleszenz-Satzes von Kanälen in den Dünndarm, wo sie den Abbau von Lebensmitteln in Nährstoffe katalysieren abgelassen. Dieses Video zeigt, wie intakt Azini werden von der ganzen Bauchspeicheldrüse isoliert und wie ihre sekretorischen Kapazität beurteilt werden kann. Mit diesem Setup wird Pankreas-Sekretion durch Messung der relativen Menge an Amylase, die nach Stimulation veröffentlicht wurde quantifiziert. Alternativ kann die Sekretion Live durch die Verwendung von verschiedenen abzubildendenSensoren und Farbstoffe. Die Ex-vivo-Setup Pankreasazini ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften der intakten Bauchspeicheldrüse behalten, manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier 4-6 werden. Dieser Aufbau wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und da bei der Untersuchung der verschiedenen exokrinen Gewebe ausgedehnt wie der Speichel und Brustdrüsen 3-7. Bemerkenswerterweise ermöglicht es die Untersuchung der Sekretion mit minimaler Störung der komplexen Zellverbände dieser polarisierten Epithelien.

<table><tbody><tr><td>ICR mice</td><td>Harlan</td><td></td><td>Any strain will do</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264</td><td>Can substitude for KRB</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>Fraction V</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>70-100&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Amylase infinity reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>TR25421</td><td></td></tr><tr><td>CCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2175</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Lifetechnologies</td><td>F34653</td><td>Diluted to 16&amp;micro;M</td></tr><tr><td>20mL scintillation vial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision system&amp;nbsp;</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td></tr><tr><td>Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>ELx808</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Azinuszellen des Pankreas produzieren und sezernieren Verdauungsenzyme. Diese Zellen werden als Cluster, die eine gemeinsame Lumen bildet und Aktien organisiert. Diese Arbeit zeigt, wie die sekretorische Fähigkeit dieser Zellen durch Kultur von isolierten Acini bewertet. Das Setup ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften des intakten exokrinen Pankreas behalten können manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier werden. Die richtige Isolierung von Pankreasazini ist eine wesentliche Voraussetzung, so dass der Ex-vivo-Kultur wird die in-vivo Natur der Acini darstellen. Das Protokoll zeigt, wie intakt Acini von der Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. Anschließend werden zwei komplementäre Verfahren zur Bewertung Pankreassekretion dargestellt. Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß, während die direkte Abbildung von Pankreas-Sekretion ermöglicht die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung. Gemeinsam presen die TechnikenTed hier ermöglichen ein breites Spektrum von Experimenten zur exokrinen Sekretion studieren.

Pankreasazini, die ordnungsgemäß isoliert wurden zeigen eine stereotypische Morphologie bei Durchlicht betrachtet. Ihre basolateralen Domänen sollten rund und frei von Blasen erscheinen. Die apikale Domäne wird von Hunderten von sekretorischen Vesikeln umgeben und erscheint dunkler in der Farbe (Abbildung 2a, b). Die Kerne sind basal an die Bläschenbereich. Zelltrümmer und Komponenten des Pankreasgangsystems und des endokrinen Pankreas, die in frühen Stadien der Acini Isolation (2C, D) festgestellt werden kann, sollte außerhalb des endgültigen Azinuszellen Suspension (2A, B). Unsachgemäße Isolierung kann bei der Erzeugung von basolateralen Bläschen und Bruch von Zellen, die Entladung ihr Verdauungsenzymen in das Medium (2E, F) führen. Amylase-Freisetzung aus Pankreasazini zeigt eine zweiphasige Kurve, wenn gegen die Konzentration der Sekretagogen (3A) aufgetragen. Whne Stimulation über 5% des Anfangsgehalts wird während 30 min Inkubation freigesetzt. Nach Stimulation wird diese Zahl bis zu 5-fache erhöht. Acini, die kultiviert O / N waren, zeigen ein niedrigeres Verhältnis der stimulierten gegen basale Amylasefreisetzung im Vergleich zu frisch isolierten Acini. Wichtig ist, kultiviert, die Acini durch Adeno-Viren infiziert waren, zeigen eine hohe basale Amylase-Sekretion und ein sensibilisiertes stimulierte Sekretion (3B, C). Es ist daher entscheidend, um die Kontrolle Acini mit einer ähnlichen Dosis von Kontrollvirus zu infizieren. Live-Darstellung von Acini sollten klare Identifizierung der basolateralen und apikalen Domänen von Azinuszellen ermöglichen. Lipophile Farbstoffe Instrumental zur Unterscheidung zwischen dem schmalen Bereich und der apikalen und basolateralen lateralen Aspekte der Zellen (Abbildung 4). Unter physiologischen Stimulation wird die Sekretion ausschließlich auf der apikalen Oberfläche 1,9 gerichtet. Verwendung des F-Actin-Sonde LifeAct-GFPErmöglicht Live Visualisierung von sekretorischen Vesikeln, da Pankreas Zymogen Vesikel Aktin Beschichtung unterzogen werden kurz vor der Exozytose (Abbildung 4). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig1highres.jpg" width="400" /> Abbildung 1. Lokalisation der Bauchspeicheldrüse und benachbarten Organen. (AC) Die Bauchspeicheldrüse und benachbarte Organe nach dem Einschnitt der Bauchhaut und der Unterschicht (A), vor und nach der Trennung von Pankreasnachbarorgane, (B) und (C) sind. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51799/51799fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Isolierung von Pankreasazini. (A) und (B) Pankreasazini isoliert richtig ein stereotypes Morphologie anzuzeigen; ihre basolateralen Domains rund und frei von Blasen erscheinen, während ihre apikale Domäne von Hunderten von sekretorischen Vesikeln umgeben und erscheint dunkler in der Farbe (Pfeil). (C) und (D) Zelltrümmer und Komponenten s des Pankreasgangsystem nachgewiesen werden können in frühen Stadien der Acini Isolierung (Pfeil zeigt auf eine exokrine Kanal). (E) und (F) Falsche Isolation führt zur Erzeugung von Bläschen basolateralen (E, Pfeil), und ein Bruch von Zellen, die ihre Entladung Verdauungsenzyme in dem Medium ( F, Pfeil). Maßstabsbalken repräsentieren 100 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51799/51799fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </p&gt; <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Messung der Amylase-Freisetzung aus isolierten Acini. (A) Amylase-Freisetzung aus Pankreasazini zeigt eine zweiphasige Kurve, wenn gegen die Konzentration eines secretagogue aufgetragen. Acini wurden isoliert und für 30 min vor Stimulation mit den angegebenen Konzentrationen von Cholecystokinin (CCK) wiederherzustellen. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert und SEM von drei unabhängigen Experimenten. (B), die Acini kultiviert O / N, zeigen ein geringeres Verhältnis der stimulierten gegen basale Amylasefreisetzung im Vergleich zu frisch isolierten Acini waren. Kultiviert Acini, die durch Adeno-Viren infiziert waren, zeigen eine hohe basale Amylase-Sekretion und eine sensibilisierte stimuliert Sekretion. (C) Nicht-Sauerstoffanreicherung Kulturbedingungen, um übermäßige di führenscharge von Amylase, die Masken der stimulierende Effekt der secretagogue. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51799/51799fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4. Live-Bildgebung des Pankreas-Sekretion. Live-stimulierten Azinuszellen, ausdrücken LifeAct-GFP (LA, grün, grau) und mit dem lipophilen Farbstoff FM4-64 (rot) gefärbt. Verwendung der Sonde ermöglicht LifeAct Live-Visualisierung der einzelnen Fusionsereignisse von Aktin-Vesikel (Pfeile). Die Zellen wurden O / N mit Adenovirus-LifeAct-GFP (Ad-LifeAct-GFP) infiziert, gebeizt und stimuliert kurz mit 100 pM CCK vor Beginn der Bildgebung. Maßstab repräsentiert 5 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51799/51799fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isoliert Pankreasazini behalten ihre in-vivo-Morphologie und Aktivität und bieten leistungsfähige Möglichkeiten zur Überwachung und Manipulation Sekretion. Diese Arbeit zeigt, wie Acini von der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert werden, und wie die sekretorischen Fähigkeiten beurteilt werden kann.

Beurteilung der sekretorischen Kapazität von Azinuszellen des Pankreas

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science.  Isoliert Pankreasazini behalten ihre in-vivo-Morphologie und Aktivität und bieten leistungsfähige Möglichkeiten zur Überwachung und Manipulation Sekretion. Diese Arbeit zeigt, wie Acini von der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert werden, und wie die sekretorischen Fähigkeiten beurteilt werden kann. 

Serie: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Forschung

Krebsforschung

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

Cokultur Analyse der extrazellulären Protein Wechselwirkungen, die Insulinsekretion durch Betazellen des Pankreas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Medizin

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Dezellularisierung der humanen Bauchspeicheldrüse ohne Detergenzienz zur Herstellung löslicher extrazellulärer Matrix EZM

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Dezellularisierung der humanen Bauchspeicheldrüse ohne Detergenzienz zur Herstellung löslicher extrazellulärer Matrix (ECM)

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

Biotechnik

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologie

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologie und Infektion

Induktion einer Pankreasschädigung bei Mäusen durch intraperitoneale Medikamenteninjektion

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological changes associated with SAP using animal models can aid in identifying potential therapeutic targets and exploring novel treatment approaches. Previous studies primarily induced pancreatic injury through retrograde bile duct injection of sodium taviaurocholate, but the impact of surgical damage on the quality of the animal model remains unclear. In this study, we employed various frequencies of intraperitoneal Caerulein injections combined with different doses of LPS to induce pancreatic injury in C57BL/6J mice and compared the extent of injury across five intraperitoneal injection protocols. Regarding inducing acute pancreatitis in mice, an intraperitoneal injection protocol is proposed that results in a mortality rate as high as 80% within 5 days. Specifically, mice received ten daily intraperitoneal injections of Caerulein (50 &#181;g/kg), followed by an injection of LPS (15 mg/kg) one hour after the last Caerulein administration. By adjusting the frequency and dosage of injected medications, one can manipulate the severity of pancreatic injury effectively. This model exhibits strong controllability and has a short replication cycle, making it feasible for completion by a single researcher without requiring expensive equipment. It conveniently and accurately simulates key disease characteristics observed in human SAP while demonstrating a high degree of reproducibility.

Autor im Rampenlicht: Identifizierung der therapeutischen Ziele für die Entwicklung neuer Behandlungen für schwere akute Pankreatitis bei Mäusen

Intraperitoneal drug administration is a safe and effective non-invasive approach for inducing pancreatic injury. This study compared five distinct intraperitoneal injection protocols on mice to induce varying degrees of pancreatic injury and established a model of severe pancreatic injury to investigate the pathological changes and treatment strategies for severe acute pancreatitis (SAP).

Vorbereitung eines Mäusemodells für schwere akute Pankreatitis durch eine Kombination aus Caerulein und Lipopolysaccharid intraperitoneale Injektion

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

Beurteilung der sekretorischen Kapazität von Azinuszellen des Pankreas

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

Cokultur Analyse der extrazellulären Protein Wechselwirkungen, die Insulinsekretion durch Betazellen des Pankreas

Dezellularisierung der humanen Bauchspeicheldrüse ohne Detergenzienz zur Herstellung löslicher extrazellulärer Matrix (ECM)

Dezellularisierung der humanen Bauchspeicheldrüse ohne Detergenzienz zur Herstellung löslicher extrazellulärer Matrix (ECM)

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Vorbereitung eines Mäusemodells für schwere akute Pankreatitis durch eine Kombination aus Caerulein und Lipopolysaccharid intraperitoneale Injektion

Vorbereitung eines Mäusemodells für schwere akute Pankreatitis durch eine Kombination aus Caerulein und Lipopolysaccharid intraperitoneale Injektion