We would like to thank Dr. Alengo Nyamay'antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Primäre Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten isoliert werden seit langem verwendet, um Funktionen Kardiomyozyten in vitro zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von neonatalen Herzmuskelzellen aus Rattenjungen mit einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren wird zunächst Verdau mit Trypsin O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Kollagenase. Ein Vorteil der Verwendung des gereinigten Kollagenase Schritt ist, dass der gleiche Grad von Enzym wird für alle Isolierungen eingesetzt. So ist die Qualität und Menge der isolierten Zellen konsistent von Versuch zu Versuch. Angesichts der höheren Transduktionswirksamkeiten mit Adenovirus assoziiert, wenn eine hohe Effizienz der Transduktion der Zellkultur für einen gegebenen Experiment notwendig ist, ist es besser, ein Adenovirus zu verwenden. Wenn jedoch hohe Transduktion nicht erforderlich, kann ein lentiviraler Vektor verwendet werden. Nachdem die Wahl, entweder die Adenovirus-oder lentiviralen Vektoren macht es einfacher, geeignete TRANSD erreichenuction und Expressionsniveaus für die verschiedenen Arten von Genen. Wenn die Fluoreszenzintensität mit Hilfe der konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop oder ICC mit Live-Cell-Imaging nachgewiesen ist sehr gering nach lentiviralen Transduktion, mit einem anderen lentiviralen Transfervektor, der einen anderen Promoter verwendet, um das Gen von Interesse exprimieren, kann dieses Problem beheben. Mit Adenovirus-Vektoren, wenn die von WB erkannt Band ist schwach nach adenoviraler Transduktion, kann dies bedeuten, eine niedrige Titer Virus Lager. In diesem Fall ist es besser, einen höheren Titer adenoviralen Lösung durch Vermehrung in den Zellen, bevor vorzubereiten. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Ausbeute von lebensfähigen isolierten Herzmuskelzellen nicht sehr konsistent von Versuch zu Versuch, selbst bei Verwendung von gereinigter Collagenase. Um reproduzierbare Bild Experimente ist es am besten, um lebensfähige Zellen nach der Auswahl von isolierten Kardiomyozyten im Überstand bei Schritt 1.2.13 zählen. in der Protokollabschnitt. Dann seed Kardiomyozyten auf Glasboden Gerichte in verschiedenen Verdünnungen. Sobald die Zellen gebunden, wählen Schalen mit den entsprechenden Zellkonzentration für das Experiment geplant. Es gibt viele Vorteile der Verwendung von neonatalen Herzmuskelzellen, aber es gibt auch einige Nachteile. Der größte Nachteil ist ihre klaren Unterschied von adulten Kardiomyozyten. Ausdifferenzierten adulten Kardiomyozyten sind stäbchenförmig und isolierten adulten primären Kardiomyozyten behalten ihre stäbchenförmige Morphologie, während isolierten neonatalen primären Kardiomyozyten in alle Richtungen 36 zu verbreiten. Die phänotypische Unterschiede zwischen adulten und neonatalen Kardiomyozyten auch in ihrer Muster der Genexpression 37 reflektiert. Daher ist für Experimente, in denen differenzierten Kardiomyozyten erforderlich sind, wird ein Protokoll für die Isolierung von adulten Kardiomyozyten benötigt 4 beschrieben. Der Einsatz Adenovirus und lentivirale Transduktion von rekombinantenProteine ​​in primären Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen in Kombination mit konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk ermöglicht es uns, die Funktionen der Proteine ​​in kultivierten primären Zellen Live analysieren. Relativ zu bestehenden Verfahren, die Transfektion zu verwenden, um das Gen von Interesse in Zellen einzuführen, ist ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls, die Lentiviren, Adenoviren und sehr effizient von den Zellen, was zur Expression des Gens von Interesse in fast allen Zellen aufgenommen die Kultur. Weiterhin ermöglicht die Verwendung von zwei verschiedenen Arten von Viren, die für die Genexpression erleichtern, geeignete Übertragungsraten und die Expressionsniveaus für mehrere Gene zu erreichen. siRNAs und chemische Agonisten und Antagonisten können in diesem System verwendet, um weiter zu stören, und die Funktionen der Gene und die Proteine, die sie kodieren, zu analysieren. Präparation der Herzen ist ein äußerst wichtiger Schritt im Protokoll. So schnell wie möglich entfernen, die Herzen aus dem Körper. Achten Sie darauf,legte sie sofort auf Eis, um die Lebensfähigkeit der Zellen hoch zu halten. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Herstellung von hoher Qualität, und Titer, lentiviralen / Adenovirus-Aktien. Wenn schlechte Qualität Virus Aktien verwendet werden, wird Übertragung und Expressionsniveaus des Gens von Interesse gering sein. Daher kann sie nicht geeignet für bildgebende Untersuchungen sein. Eine wichtige zukünftige Anwendung dieser Technik wird seine &quot;Verwendung in Maus-Kardiomyozyten sein. Pilotstudien zu testen, ob diese Methode für die Isolierung von Maus neonatalen Kardiomyozyten verwendet werden haben vielversprechende Ergebnisse erzielt. Aufgrund der relativ geringen Größe der Mäuseherzen im Vergleich zu denen von Ratten, weniger Gewebe zunächst anfallen. Somit sind weniger Zellen in einem einzigen Verfahren isoliert unter Verwendung der gleichen Anzahl von Tieren, sondern lediglich die Verwendung von mehr Mäuse zur Isolierung sollte dieses Hindernis zu beseitigen. Die Möglichkeit, mit der Maus zu isolieren Kardiomyozyten ermöglicht es den Forschern, die Funktionen der Zellen, die aus gentechnisch veränderten m isoliert untersuchenEis (transgene, Knock-Out-, Knock-in), die um eine bestimmte Form des Gens von Interesse zu studieren produziert wurden. Eine der Haupthürden für kardiovaskuläre Forschung war die Schwierigkeit, mit der Untersuchung der Expression und Funktion eines bestimmten Gens in Herzgewebe in Echtzeit ausgedrückt in vivo assoziiert. Die Fähigkeit, funktionale schlagen Kardiomyozyten zu isolieren, zu modulieren Zellfunktionen unter Verwendung viraler Transduktion, und dann studieren sie in Echtzeit mit Hilfe des konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop hilft jedoch, um Licht auf die Rolle der Herzmuskelzellen in vivo zu vergießen und diese Lücke zu schließen. Dieses Verfahren stellt ein vereinfachtes System für das Verständnis Kardiomyozyten Funktion auf zellulärer Ebene. Es ermöglicht die Echtzeit-Analyse, wie Störungen in der Genexpression verändern Kardiomyozyten-Funktion. Live-Cell-Imaging von Kardiomyozyten wird weitere Einblicke in Kardiomyozyten Funktion bereitzustellen. Solche Erkenntnisse werden die Fortschritte in der Grundlagenherzkreislauf führenr Forschung, was zu neuen Therapien für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen.

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen haben lange für die Untersuchung von Herzmuskelzellen in vitro Funktion 1 verwendet. Sie sind leicht zu von Rattenjungen von mehreren etablierten Methoden 4.2 zu isolieren. Das häufigste Verfahren verwendet Kollagenase oder Trypsin Bindegewebe des Herzens vor der Zellisolierung zu verdauen. Die Forscher haben auch Methoden zur Isolierung von Herzmuskelzellen aus adulten Nagetieren 5-8 sowie 9,10 neugeborenen Mäusen entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von Kardiomyozyten aus neonatalen Ratten-Jungtieren unter Verwendung einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren. Trypsin wird zuerst verwendet, O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Collagenase bei 37 ° C. Inkubation des Herzgewebes mit Trypsin O / N bei 4 ° C reduziert die notwendigen Schritte Ernten der Zellen im Vergleich zu Verfahren mit sequentieller Inkubation in einem warmen Enzymlösung 2. Zusätzlich kann durch Verwendung von gereinigtem Collagenase anstatt rohe Enzyme können von Los zu Los-Variabilität eliminiert werden, wodurch eine verbesserte Reproduzierbarkeit. Funktionsstudien eines bestimmten Proteins verwenden oft ein Protein-Expressionssystem unter Verwendung eines Adenovirus, 11-13 und / oder ein Lentivirus 14-16. [WARN HINWEIS] Die Virusproduktion und Manipulation sollte nach den NIH-Richtlinien durchgeführt werden. Das Adenovirus nicht in das Wirtsgenom zu integrieren. Es hat einen sehr hohen Transduktionseffizienz in den meisten Zelltypen, einschließlich teilende Zellen und nicht-teilende Zellen, wie auch primäre Zellen und etablierten Zelllinien. Dies macht das Adenovirus eine zuverlässige Vektor zur Genexpression. Hohe Konzentrationen des Proteins von dem Adenovirus-Vektor codiert entwickeln innerhalb von 48 Stunden nach Transduktion, und sie für 17 Wochen dauern. Ein Nachteil der Verwendung eines Adenovirus für die Proteinexpression ist jedoch, daß die Entwicklung eines rekombinanten adenovirus ist sowohl kompliziert als auch zeitaufwendig. Dieser Nachteil erklärt zum Teil, warum viele Forscher Lentiviren worden Drehen für rekombinante Genexpression. Im Gegensatz zu adenoviralen Konstrukte, wodurch eine lentiviralen Konstrukt ist schnell und einfach. Obwohl Lentiviren haben geringere Effizienz der Transduktion als Adenoviren, in beiden Teilen und nicht-teilende Zellen, sie in das Wirtsgenom zu integrieren. Folglich ist die Expression des transduzierten Gens für Lentiviren als für Adenoviren stabiler. Aufgrund technologischer Fortschritte in der Mikroskopie, ist es viel einfacher, lebende Zellbilder von Zellen, die rekombinanten Proteine ​​zu erfassen. Dies gilt auch bei Videorate Geschwindigkeiten des Erwerbs. Dies ermöglicht dem Prüfer, um festzustellen, wie bestimmte Veränderungen in dem Protein von Interesse in funktioneller Einfluss auf die Zelle in Echtzeit. Das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop hat mehrere Eigenschaften, die es eine optimale Technik für liv machenE-Cell-Imaging 18,19. Die Yokogawa Spinning Disc ermöglicht viel schnellere Bildaufnahme, während zur gleichen Zeit nutzen weit weniger Strom als Laserpunkt konfokalen Mikroskopen. Beide dieser Besonderheiten sind aufgrund der sich drehenden Scheibe, die eine Vielzahl Löcher, durch die konfokale Laser gelangt gleichzeitig an die Proben enthält. Während der Erwerb, die Festplatte selbst dreht sich schnell und kontinuierlich 18-20. Durch die Verwendung des Autofokus-Systems des Mikroskops wird eine stabile Fokus über lange Zeiträume aufrechterhalten. Diese ermöglicht es Forschern, gut fokussierte Bilder Live Cell nehmen. Erworbene Bilder werden als Filmdatei gespielt. Die Bilder werden mit Bildanalyse-Software wie ImageJ 21,22, FIJI 23 oder anderen im Handel erhältlichen Software analysiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 scissors for decapitation</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501749</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 fine scissors for heart isolation and chopping</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14393</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 fine forceps (Dumont No. 5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three sterilized 10 cm plastic dishes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td>for hearts isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0.17-14-C</td>
			<td>for TIRF or high resolution image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70 % (v/v) in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One sterilized 10 cm plastic dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td>for trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 10 cm plastic cell culture dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td>for selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto pipette</td>
			<td>Drummond Scientific&#160;</td>
			<td>4-000-300</td>
			<td>for trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; Cellometer, automated cell counter</td>
			<td>nexcelom</td>
			<td></td>
			<td>to check and count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; Microscope and Hematocytometer</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>to check and count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-19AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubating orbital shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z673129</td>
			<td>to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/ml BrdU solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>41965039</td>
			<td>Mix medium as indicated in the protocol and warm before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>31095029</td>
			<td>Mix medium as indicated in the protocol and warm before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section 2 lentiviral transduction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three packaging plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfection reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; polyethyleneimine&#8220;Max&#8221;, (Mw 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)&#160;</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-2</td>
			<td>It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365779001</td>
			<td>substitute for PEI as transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628</td>
			<td>dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 &#956;M Chloroquine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Luer-Lok syringe, sterilized</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 um filters</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8677</td>
			<td>use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glicol 6000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section 3 Adenoviral transduction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Some 10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>for titration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>3122 000.035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section 4 live cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microspopy</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>L7267000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a temperature controlled chamber</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>to keep temperature at 37 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a CO2 environmental system</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>optional to maintain CO2 concentration optimal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; CO2 Independent Medium, No Glutamine</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18045-054&#160;&#160;</td>
			<td>for long time time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>21063-029</td>
			<td>for long time time-lapse imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen sind bei der Grundlagenforschung in vitro Herz-Kreislauf, weil sie leicht in großen Stückzahlen getrennt werden, in einem einzigen Verfahren. Aufgrund der Fortschritte in der Mikroskoptechnik ist es relativ einfach, Live-Cell-Bilder für die Zwecke der Untersuchung zellulärer Ereignisse in Echtzeit mit minimaler Besorgnis über Phototoxizität zu den Zellen zu erfassen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Live-Cell-Zeitrafferbilder von primären Ratten-Herzmuskelzellen nehmen Neugeborenen mit einem konfokalen Mikroskop Spinning-Disk folgende lentiviralen und adenovirale Transduktion, um die Eigenschaften der Zelle zu modulieren. Die Anwendung von zwei unterschiedlichen Arten von Viren macht es einfacher, eine geeignete Übertragungsrate und die Expressionsniveaus für zwei unterschiedliche Gene zu erreichen. Nun konzentriert Lebendzell Bilder können mit Autofokus-System des Mikroskops, die stabile Fokus für lange Zeiträume beibehält, erhalten werden. Gemäss dieser Methode werden die Funktionen von exogen Ingenieured Proteinen in kultivierten primären Zellen exprimiert werden, können analysiert werden. Zusätzlich kann dieses System verwendet, um die Funktionen von Genen durch die Verwendung von siRNAs sowie von chemischen Modulatoren zu untersuchen.

Die Technik, ein Lentivirus-Codierung EGFP (enhanced green fluorescent protein)-markierten Cx43 (Connexin43) oder eine mutierte Cx43 32 wurde verwendet, um EGFP-markierte Proteine ​​in Zellen zu exprimieren, und ein Adenovirus-Codierung FGFR1DN (Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 dominant negative illustrieren ) wurde verwendet, um in der Zelle 33-35 heruntergefahren FGF-Signalisierung. Drei Tage nach der Trennung von Kardiomyozyten wurden die isolierten Kardiomyozyten mit Lentiviren, um EGFP-markierte Proteine ​​in den Zellen exprimieren transduziert. Dann nach 3 Tagen der lentiviralen Transduktion, die isolierten Herzmuskelzellen wurden weiter mit einem Adenovirus-Codierung FGFR1DN FGF-Signalisierung in den transduzierten Zellen zu eliminieren. Nachdem man genug Zeit, um die Zellen transduziert exogene Gene exprimieren, wurde ein konfokales Mikroskop Spinning-Disk verwendet werden, um Live-Cell-Bilder aufzunehmen. Erworbene Bilder werden als Filmdatei abgespielt und mit Bildanalyse-Software analysiert. Nähere Vertretertive Ergebnisse finden Sie Sakurai et al 32. Die Expression von EGFP-markierte Proteine ​​folgenden lentiviralen Transduktion wurde durch konfokale Mikroskopie drehenden Scheibe 72 Stunden nach lentiviralen Transduktion den 1A-B bestätigt. Die Expression von FGFR1DN durch adenovirale Transduktion wurde von WB und ICC nach 24 Stunden von adenoviralen Transduktion 1C-D bestätigt. Die Zeit des adenoviralen neben 3,5 cm-Schalen wurde als Zeitpunkt 0 und Zeitraffer definierte Bilder wurden mit einem 40x Luft NA 0,9 Objektivlinse mit einer Kammer Heizer, um die Temperatur bei 37 ˚ C zu halten erworbenen alle 5 Minuten für 6 Stunden Zeitraffer-Bilder von EGFP-markierte Proteine ​​in den primären Kardiomyozyten durch konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie sind in Supplemental Filme 1-2. In Fällen, wo der Temperaturausgleich nicht ausreichend war, oder die Mehrfachaufnahmemodus nicht richtig funktioniert,Bilder ausgelesen werden, sich in der xy-Ebene STADT Film 1 zu bewegen. Allerdings, wenn richtig arbeitet die Autofokussystem stabil gehalten Fokus und dies nicht auf. Wie in Supplemental Movie 2, wenn der Temperaturausgleich war ausreichend und nur eine Region von Interesse erworben wurde gezeigt, sind die aufgenommenen Bilder von sehr hoher Qualität. Das Schlagen der Herzmuskelzellen wurde nach langfristigen Zeitraffer-Live Cell Imaging, um die Lebensfähigkeit der Zellen bestätigen bewertet. Auch nach 16 Stunden von Zeitraffer-Imaging EGFP exprimierenden Kardiomyozyten behielten ihre funktionellen Eigenschaften und schlagen rhythmisch STADT Movie 3. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51666/51666fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Bestätigung der Protein-Expression nach lentiviralen oder adenovirale Transduktion. </strong&gt; (A) Isolierte Ratten neonatalen Kardiomyozyten exprimieren Cx43-WT-EGFP mit Ad-FGFR1DN transduzierten 3 Tage nach Transduktion. Siehe auch Zusatz Film ein. (B) Isolierte Ratten neonatalen Kardiomyozyten exprimieren Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP mit Ad-FGFR1DN 3 Tage nach Transduktion transduziert. Siehe auch Zusatz Movie 2. (C) Protein-Expression nach adenoviraler Transduktion durch ICC 24 Stunden nach Transduktion nachgewiesen. Hämagglutinin (HA)-Proteins markiert FGFR1DN wurde durch Anti-HA-Antikörper unter Verwendung konventioneller Methoden ICC erkannt wurde alpha-Actinin als Marker für Herzmuskelzellen verwendet werden. (D) Expression von Protein FGFR1DN folgenden adenovirale Transduktion von WB 24 Stunden nach der Transduktion detektiert. HA-markierte FGFR1DN wurde von Anti-HA-Antikörper, der von WB erkannt wurde beta-Tubulin als Ladekontrolle verwendet. STADT Film ein. Zeitraffer-Bildgebung von isolierten Ratten Neugeborenen Auto<html> diomyocytes exprimieren Cx43-WT-EGFP mit Ad-FGFR1DN transduziert. Die Zeitraffer-Aufnahmen wurden mit einem 40x Objektiv alle 5 min für 6 Stunden mit einem konfokalen Mikroskop Spinning-Disk erworben. Erworbene Bilder wurden wieder als Film mit 10 Bildern pro Sekunde abgespielt. Dieser Film wurde von Sakurai et al 32 geändert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51666/s_movie1_2.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a> STADT Movie 2. Zeitraffer-Bildgebung von isolierten Ratten neonatalen Kardiomyozyten exprimieren Cx43-S325/328/330E-EGFP mit Ad-FGFR1DN transduziert. Die Zeitraffer-Aufnahmen wurden mit einem 40x Objektiv alle 5 min für 6 Stunden mit einem konfokalen erworben Spinning-Disk-Mikroskop. Erworbene Bilder wurden wieder als Film mit 10 Bildern pro Sekunde abgespielt. Dieser Film wurde von Sakurai et al 32 geändert.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. STADT Movie 3. Zeitraffer-Bildgebung von isolierten Ratten neonatalen Kardiomyozyten spielte zurück zu Ist-Geschwindigkeit. Die Zeitraffer-Aufnahmen von isolierten Ratten neonatalen Kardiomyozyten exprimieren Cx43-EGFP mit Ad-FGFR1DN wurden mit einem 40x Objektiv alle 200 ms für 10 erworben transduzierten s mit einem konfokalen Mikroskop Spinning-Disk folgenden 16 Stunden von Zeitraffer-Akquisition. Erworbene Bilder wurden wieder als Film mit 5 Bildern pro Sekunde bei tatsächlichen Geschwindigkeit wiedergegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51666/s_movie3.MOV" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy at JoVE.com

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

live-cell-imaging-primary-rat-neonatal-cardiomyocytes-following

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Aufrufe.  Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology. This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Serie: Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...