Die Autoren danken der Ellison Medical Foundation für ihre Unterstützung. Wir möchten auch die Mitglieder der Abby Dernburg Labor für die Unterstützung bei Verwendung des wormsorter danken.

1. Die Erteilung einer Synchronized Kultur Junger Erwachsener Tiere <ol><li> Würmer wachsen auf mehreren NGM-Platten mit OP50-1 E. ausgesät coli-Bakterien (aus einer gesättigten Kultur 10x konzentriert), bis viele Würmer haben die schwangeren Stadium erreicht. </li><li> Gönnen trächtige Tiere mit Ei-Prep-Lösung, um eine synchronisierte Kultur (Eier) zu erhalten. </li><li> Platte Eier auf mehrere 60-mm NGM-Platten ausgesät mit 10x konzentrierter OP50-1 mit einer Dichte von etwa 150-200 Eier / Platte. </li><li> Platten bei 25 ° C für 2 Tage (bis Würmer haben die L4 erreicht - Young Adult Stufe). </li></ol> 2. Vorbereiten Pseudomonas aeruginosa infiziert Platten und Worms <ol><li> Am Tag des Ei-Prep (Schritt 1.1) beimpfen eine PA14 :: GFP Kultur in 2 ml King-B-Medium, das Rifampicin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml. Inkubieren der Kultur bei 37 ° C unter Rühren O / N. </li><li> Platte der PA14 :: GFP Kulturtur auf so viele Slow-Killing-Platten (SKP), die für den Test benötigt. Auf jeder SKP 150 mm Petrischale Pipette 75-100 ul gesättigten Kultur und mit einem sterilen Glasverteiler gleichmäßig verteilt. Die Inkubation bei 37 ° C für 20-24 Stunden. </li><li> Platten entfernen Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf RT (~ 20 min) zu kühlen. Mit M9 Puffer, Wasch Würmer aus Schritt 1.4 auf PA14 :: GFP-Platten in einem minimalen Volumen der Flüssigkeit. Bei Verwendung von 150-mm-Platten, kann mehrere hundert Würmer auf einer einzigen Platte angeordnet sein. </li><li> Platten bei 25 ° C für 18-21 Stunden. Für P. aeruginosa-exponierten jungen erwachsenen Würmer, ist dies die Zeit Fenster, die optimale Verteilung der kolonisierten vs noncolonized Tiere. </li></ol> 3. Einrichten des Wormsorter Vor der Durchführung der Proben Art, sicherzustellen, dass die Maschine richtig funktioniert. Details finden Sie in http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43 erhalten werden kann, und the wesentlichen Schritte sind unten aufgeführt. <ol><li> Stellen Sie den Mantel Ventildruck auf ca. 5 psi (4,5-5,5 Bereich). </li><li> Um zu überprüfen, dass Mantel Fluiddurchsatz geeignet ist, legen Sie eine 15 ml konischen Röhrchen unter dem Spender, schalten Sie den Mantel-Ventil, und schalten Sie den Sorter-Ventil. Halten Sie das Röhrchen unter dem Spender für 60 Sekunden. Das Volumen in dem Rohr sollte 9-10 ml betragen. Wenn es außerhalb dieses Bereichs ist, passen Sie die Hülle Ventildruck. </li><li> Um sicherzustellen, dass Mantel Fluiddurchsatz (wie in Schritt 3.2 festgelegt) werden genaue Sortierung zu ermöglichen, testen Sie die Sortierrate mit 40 um Steuer Partikel: </li><li> Schalten Sie den Mantel Ventil. In etwa 25 ml der Kontrolle Partikellösung zum Stausee. </li><li> Schalten Sie den Ventilmantel und dem Probenventil. </li><li> Auf der Computer-Software, gehen Sie zum &quot;Steuerpartikel Modus&quot; und klicken Sie erwerben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Partikeldurchflussrate ~ 5-8 Teilchen / sec, mit einem TOF (Time Of Flight) in etwa der Breitedes Teilchens, 40 um. Solch ein TOF bedeutet, dass nur ein einziges Objekt 40 um durchläuft in einer Zeit. Wenn die Werte außerhalb dieses Bereiches, passen Sie die Einstellungen (nach der Beschreibung oben) entsprechend. </li></ol> 4. Die Sortierung kolonisiert vs Noncolonized Worms <ol><li> Mit M9, waschen Würmer in 15 ml konischen Röhrchen. Lassen erwachsenen Würmer auf den Boden der Röhre durch die Schwerkraft sinken, und entfernen Sie den Überstand. Das Rohr wird mit frischem M9. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4x. Dies entfernt einen großen Anteil der Larven sowie überschüssige Bakterien und dauert etwa 10 min. </li><li> In Würmer an die wormsorter Behälter mit einem sanft-Mischen kleiner Rührstab. </li><li> Stellen anfänglichen Signalverstärkung durch Einstellen der Grün PMT auf 600 und die rote und gelbe PMT 200. </li><li> Start der Datenerfassung, um die Einstellungen anzupassen. </li><li> Ziel für eine Art Rate von 25 bis 30 Veranstaltungen (Würmer) pro Sekunde. Wenn die Anzahl Rate zu hoch ist, verdünnte die Würmer in dem Reservoir mit M9 entsprechend. Wenn die Rate ano niedrig ist, mehr Würmer in einem kleinen Volumen M9. </li><li> Wenn das Experiment erfordert eine sehr strenge Trennung der kolonisierten vs noncolonized Würmer, stellen Sie die &quot;Koinzidenzprüfung&quot; auf &quot;reine&quot;. Dies gewährleistet, dass im Falle zweier Objekte zu nahe aneinander auftreten oder in der gleichen Tropfen, die Maschine weist die Tropfen nicht gesammelt wird. </li><li> Um die Bevölkerung von Interesse zu sortieren, ziehen Toren um die Achsen der Größe anzeigt (zu erwachsenen Würmern zu erhalten) und Fluoreszenz-Intensität (dh hoch für kolonisiert, niedrig für noncolonized). Die Werte für die Fluoreszenz Gating muss empirisch ermittelt werden. </li><li> Legen Sie ein Multi-Well-Platte oder eine Petrischale unter dem Spender, um Würmer zu sammeln öffnen Sie dann die Art Ventil Sortier Würmer zu beginnen. </li><li> Sammeln Sie eine kleine Population von Tieren, die unter dem Mikroskop, dass die Bevölkerung sortiert ist die Bevölkerung von Interesse zu überprüfen. Wenn nicht, passen Sie die Gating-Parameter und weiterhin mit Probenentnahme. </li></ol>

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D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Methode, die wir beschreiben, nutzt Fluoreszenzmarkierung von Einrichtungen außerhalb der Schnecke, um Wechselwirkungen zwischen der Schnecke und ihrer Umgebung zu folgen. In dem Fall, wir präsentieren, wurde die Trennung über die Kennzeichnung von einem Krankheitserreger und wurde zu trennen Würmer mit schweren Krankheitserreger Last von diejenigen, die keine (oder Licht) Last eingesetzt. Nachfolgende Genexpressionsanalyse fanden keinen Unterschied in der Immunantworten zwischen den beiden Gruppen nahe legt, dass sie unabhängig von der Keimmenge waren. Das Signal, das die Reaktion initiiert wurde an anderer Stelle gezeigt, um physisch mit den Bakterien assoziiert werden, anstatt ausgeschieden wird, was darauf hindeutet, dass dieses Signal kann ein PAMP sein. Gemeinsam unterstützten diese Ergebnisse die Hypothese, dass PAMP Anerkennung spielt eine Rolle bei der Initiierung Immunantwort in C. elegans 19. Ein Vorteil der oben beschriebenen Sortierprotokolls ist, dass sowohl besiedelt und noncolonized Würmer aus einer Population isoliert. Thist, hängt mit einer Bevölkerung mit einer optimalen Verteilung der Tiere, die gegen noncolonized besiedelt sind. Wir haben festgestellt, dass bei jungen Erwachsenen infiziert, Wildtyp-Würmer mit P. aeruginosa, das entsprach einer Belichtungszeit von etwa 18 Stunden. Diese Belichtungszeit erzeugt eine Bevölkerung, wo die Mehrheit der Tiere wurden einem &quot;Zwischen&quot;-Grad besiedelt, aber mehrere hundert Würmer zeigten vollen Kolonisation, und eine ähnliche Anzahl noncolonized wurden. Obwohl damit eine optimale Verteilung für unsere Zwecke, andere können ihre eigene optimale Verteilung zu definieren. Bei Sortierung, ist es ratsam, &quot;Qualitätskontrolle&quot; in jedem Experiment gebaut haben. Wir haben das in zweierlei Hinsicht. Eins, für Genexpressionsstudien, die wir handverlesen eine kleine Anzahl von (kolonisiert und noncolonized) Würmer unter einem Fluoreszenz-Binokular, die für die qRT-PCR auf eine begrenzte Anzahl von Genen verwendet werden kann. Diese dienen als &quot;Goldstandard&quot; für das, was Gen expressiauf in einem wirklich reinen Population aussehen würde. Zweitens ist es gute Praxis, 20 oder mehr Würmer an einer Platte für jede automatisch sortiert Bevölkerung unter einem Fluoreszenz-Mikroskop, dass das Gerät wie erwartet überprüfen zu sortieren. Je nach vorhandener Downstream-Anwendung können unterschiedliche Grade der &quot;Treue&quot; des Sortier-Protokoll erforderlich. Wenn sortiert Würmer nicht zu dem gewünschten Grad der Besiedelung entsprechen sollte Gating-Parameter (Schritt 4.7) eingestellt werden. Es sei darauf hingewiesen, dass die strengere die Gatter, je höher die Anfangszahl der Würmer benötigt und Experimente sollten entsprechend skaliert werden. Das hier beschriebene Experiment konnte mit jedem Krankheitserreger von Interesse (solange es fluoreszierend markiert ist) durchgeführt werden. Nach der Sortierung, keine weiteren Analysen nicht brauchen, um zu Genexpressionsanalyse haften und könnte auf das Überleben oder gar Verhaltensanalyse konzentrieren. Darüber hinaus könnten ähnliche Protokolle für analytische Zwecke verwendet werden,, Um Stoffwechselabsorption zu folgen, oder Keimmenge, letztere um eine einfachere Alternative zu Keimzahlen, die sehr unterschiedlich sind 20,21 quantifizieren. Die Zunahme der Zahl und Geschwindigkeit erleichtern könnte Quantifizierung Erreger Last unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich genetischer Störungen in der Host-oder den Erreger und verschiedene Umweltbedingungen. Darüber hinaus müssen, da die wormsorter ausgestattet, um mehrere fluoreszierende Moleküle nachzuweisen, Tracking Besiedlung werden nicht auf eine einzige Art von Bakterien begrenzt. Diese Fähigkeit würde nützlich für ökologische Studien sein, so dass verschiedene Mikroben für die Besiedlung zu konkurrieren. In Laborstudien der Pathogenese, C. elegans ist typischerweise auf einem Bakterienmonokultur. Allerdings ist die Untersuchung der Mechanismen der angeborenen Immunität in der Wildnis, wo Krankheitserreger unter Hunderten von anderen Mikroorganismen, die Immunität beeinflussen können, gibt es ab 22,23, die Aufmerksamkeit zu sammeln. Zusammenfassend using der wormsorter für eine Vielzahl von Anwendungen ermöglicht Experimente in kurzer Zeit durchgeführt werden, und / oder in großem Maßstab. Die Erweiterung des Repertoires für solche Anwendungen könnten unser Verständnis von C voran elegans Physiologie. Insbesondere im Bereich der C elegans angeborenen Immunität, ist Überleben eine oft verwendete Metrik für die Prüfung der Beiträge verschiedener Gene. , Ist die Besiedlung jedoch mehr proximal zu den Ereignissen, die Immunität zu initiieren, während immer noch ein Funktionsausgang. Verwendung von Protokollen, wie hier beschrieben, zu isolieren und / oder zu analysieren Populationen von Interesse ist ein wertvolles Werkzeug, um verschiedene Aspekte der frühen Ereignisse von Immunantworten in der Schnecke zu studieren.

Automatische Sortierschnecke ist ähnlich wie FACS, Betriebs durch Messen eines Fluoreszenzsignals in einer Schnecke (typischerweise durch transgene Expression von Reporterproteinen zur Verfügung gestellt), wie es geht in ein Rohr gerichtet, so dass die Umleitung entweder zu einem Sammelrohr / Vertiefung oder zu einem Abfallbehälter nach um Gating Parameter durch den Forscher 1 gesetzt. Die wormsorter kann die Forschung in vielerlei Hinsicht zu erleichtern, ein Beispiel der Verwendung es als analytisches Werkzeug ist eine Studie, die räumlich-zeitliche Muster der Promotoraktivität für fast 1.000 Gene 2 gefolgt. Jedoch ist die Hauptanwendung des wormsorter in genetischen Screens, folgende Zielgenexpressionsniveaus oder Lokalisation des fluoreszierenden Proteins entlang der Achse der Schnecke 3-5. Hier beschreiben wir eine neue Anwendung für die wormsorter, in folgenden Kolonisierung der Wurm von einem fluoreszenzmarkierten Erregers. Mit diesem als ein Werkzeug, das wir auf die Beziehung zwischen pathog fokussierten Kolonisation / Last und der Immunantwort, um neue Einblicke in die Mechanismen für die Initiierung von Immunreaktionen in der Wurm verantwortlich zu gewinnen. In praktisch allen bisher untersuchten Organismen, Initiierung der angeborenen Immunantwort gegen mikrobielle Krankheitserreger, hängt von der Anerkennung pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und / oder Gefahr / Schaden-associated molecular patterns (gedämpft) 6,7. Die ersten konserviert sind mikrobielle Strukturen, Komponenten der mikrobiellen Zellwand, seine Flagellum oder dessen Lipid-Doppelschicht 6 umfassen, der zweite umfassen sowohl freigesetzten Moleküle (z. B. ATP 8), veränderte Proteine ​​oder andere Marker von veränderten zellulären Prozessen 9,10. Beide Arten von Signalen sind als Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), die auf spezifische Bindung eines Moleküls aktivieren Muster eine Kette von Ereignissen, die eine schützende Antwort bezeichneten Proteinen erkannt. C elegans ist extrem nützlich als tracta gewesenble Modell, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu sezieren, aber eine Sache, die nicht gut verstanden wird, ist, wie Immunantworten werden in der Wurm gestartet. Keiner der vermeintlichen Rezeptoren, die orthologen zu pattern recognition receptors (PRR) in anderen Organismen haben gezeigt, dass PAMPs zu binden, und viele der Orthologen von PRRS, die entscheidend für Immunreaktionen in andere Organismen sind eine überraschend begrenzten Beitrag zur Schnecken Erreger Antworten und Widerstand. Zum Beispiel wird das Drosophila Toll-Rezeptor, die für Gram-positive Pathogene Widerstand ist, in C dargestellt elegans durch eine einzige Homolog, tol-1, die Schutz gegen gramnegative Erreger Salmonella Typhimurium 11 trägt, nicht aber von anderen getesteten Gram-negative oder-positive Erreger 11,12. Diese Beobachtungen, zusammen mit Daten, die anzeigen, dass Immunantworten konnte durch Unterbrechung zellulären Proteintranslation h induziert werdenso führte einige darauf hin, dass C. elegans erkennt vor allem dämpft 9,13,14. Dennoch deuten Berichte beschreiben Fähigkeit von toten Krankheitserreger, Immunantworten zu induzieren, dass PAMP Bindung kann eine wichtige Rolle in Krankheitserreger Anerkennung in C haben werden elegans 15,16. Frühere Arbeiten mit Schwerpunkt auf Immunantworten in alters synchronisiert genetisch identisch C. elegans Populationen zeigten große individuelle Unterschiede in der Darmbesiedlung durch die bakterielle Gram-negative Krankheitserreger Pseudomonas aeruginosa. Allerdings Transkriptionsprofilierung Studien behandelt diese variabel kolonisierten Bevölkerung als eine Einheit 17,18. Unter Ausnutzung dieser Variabilität, wir ein Protokoll Fokussieren eines automatisierten wormsorter differentiell kolonisiert Populationen von Caenorhabditis elegans an GFP-exprimierenden S. ausgesetzt trennen entwickelten aeruginosa. Untersuchung der Genexpression in unterschiedlich kolonisierten Bevölkerung Facilitated Beurteilung der Beziehung zwischen Keimmenge (und der damit verbundenen Schädigung) und Immunreaktionen und lieferte neue Erkenntnisse über Pathogen Erkennung in C. elegans 19. Nachfolgend beschreiben wir das Protokoll, die angewendet könnten, um Würmer mit einem Fluoreszenz-markierten Erreger infiziert zu sortieren. Potenziellen Anwendern ist anzumerken, dass die Anzahl der Würmer erforderlich aussortiert werden müssen, hängt von der Art der nachfolgenden Analysen und Protokolle benutzt werden. Zum Beispiel im Fall von Microarray-Genexpressionsanalyse,&gt; 1.000 Würmer werden benötigt, um genügend RNA zu erhalten, wenn Standard-Protokolle verwendet werden, aber ~ 100 Würmer würde genügen, wenn Verstärkung eingesetzt wird, die eine schnelle Sammlung von Material und damit Minimierung von Stress zu die Würmer.

<table><tbody><tr><td>M9 Buffer</td><td>prepared in house</td><td></td><td>Recipe at wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Egg prep solution</td><td>prepared in house</td><td></td><td>50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide</td></tr><tr><td>NGM plates</td><td>prepared in house</td><td></td><td>Recipe at wormbook.org</td></tr><tr><td>SKP plates</td><td>prepared in house</td><td></td><td>Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%</td></tr><tr><td>Control test particles</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen

Die wormsorter ist ein Instrument analog zu einem FACS-Maschine, die in den Studien von Caenorhabditis elegans verwendet wird, in der Regel, um Würmer, basierend auf der Expression eines fluoreszierenden Reporter sortieren. Hier stellen wir eine alternative Nutzung dieses Instruments für die Sortierung Würmer nach dem Grad der Kolonisierung durch einen GFP-exprimierenden Erregers. Diese neue Nutzung gestattet uns die Beziehung zwischen Kolonisierung des Darms Schnecke und Induktion von Immunreaktionen zu adressieren. Während C. elegans Immunreaktionen auf verschiedene Erreger dokumentiert worden ist, ist es noch nicht bekannt, was sie veranlasst. Die beiden wichtigsten Möglichkeiten (die nicht gegenseitig ausschließen) sind Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns, und den Nachweis von Schäden, die durch eine Infektion verursacht. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, muss die Exposition gegenüber dem Erreger aus der von ihm verursachten Schäden getrennt werden. Die wormsorter aktiviert Trennung von Würmern, die durch Gram-n extensiv besiedelt wurdenegative Erreger Pseudomonas aeruginosa, mit dem Schaden wahrscheinlich durch Erreger Last verursacht, von Würmern, die in ähnlicher Weise exponiert waren, aber nicht, oder geringfügig besiedelt. Diese unterschiedliche Populationen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen Keimmenge und der Induktion von Immunantworten Transkriptions beurteilen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die beiden dissoziiert, unterstützt die Möglichkeit der Krankheitserreger Erkennung.

Wenn bei gleichaltrigen, genetisch identisch C. elegans sind P. ausgesetzt aeruginosa, wird eine breite Verteilung in Stufen der Kolonisation (Fig. 1A) beobachtet. Mit Hilfe des hier beschriebenen effiziente Trennung von noncolonized kolonisiert Würmer erreicht werden (Abbildung 1B) Protokoll. Im Gegensatz zu noncolonized Würmer, Würmer kolonisiert zeigen Anzeichen von Schäden, wie Trägheit und reduziert Stuhlgang 19. Letzteres kann ein Grund, warum Würmer von P. besiedelt sein aeruginosa haben Schwierigkeiten Clearing-Infektion. Dies hat direkte Auswirkungen auf die beschriebenen Protokoll darauf hindeutet, dass Würmer sortiert, als noncolonized bisher nicht besiedelt. Um direkt zu testen, ob diese Aussage richtig ist, wurden handverlesen kolonisiert Würmer ähnliche Waschschritte wie die in dem Sortier Experiment unterzogen und anschließend unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, und nur 4/56 gelöscht Erregers. Daher ist es wahrscheinlich, thden Anteil der zuvor besiedelt Würmer unter denen, sortiert, als noncolonized ist vernachlässigbar. Allerdings ist es ratsam, Änderungen bei der Kolonisation während Waschschritte, um Effekte von falschen Sortierung auf der Analyse zu verhindern, die eher ein Problem sein kann für andere Erreger als P. überwachen aeruginosa. Frühere Arbeiten unter Verwendung der hier beschriebenen für einen Microarray-Genexpressionsanalyse verwendet sortiert Würmer und beobachtet im Wesentlichen identisch Antworten auf P. Protokoll aeruginosa kolonisiert noncolonized Schneckenpopulationen, die mit dem Krankheitserreger für die gleiche Zeitdauer 19 ausgesetzt worden waren. Fig. 2 zeigt den gleichen Trend mit quantitativen (q) RT-PCR auf die Expression von vier Genen, bekannt, einen Teil des C messen . elegans Immunantwort: lys-2 kodiert für ein Lysozym, F08G5.6 und F55G11.2 zwei nicht charakterisierte Gene, die spezifisch an Infektion reagieren, von denen die erste ebenfalls zur Infektiontion Widerstand und pgp-5, die zu Infektionen sowie Schwermetallstress reagiert. Alle vier Gene wurden ebenfalls durch P. induzierte aeruginosa Belichtung, unabhängig von der Kolonisierungsstatus der Würmer. Dies bestätigt die zuvor veröffentlichten Ergebnissen anzeigt, dass Kolonisation und der zugehörigen Schädigung nicht für eine Immunantwort erforderlich ist, sondern zeigt auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster wie das Signal. Das pgp-5 ist in noncolonized Tiere, die vermutlich nicht zu erleben umfangreiche Schäden induziert, schlägt eine Überlappung in den regulatorischen Programme steuern Immunantworten und allgemeine Stressreaktionen in C. elegans. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51090/51090fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51090/51090fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Kolonisiert und noncolonized C. elegans mit einem wormsorte getrenntr. (A) Repräsentatives Bild von Wildtyp-erwachsenen C. elegans mit GFP-exprimierenden S. ausgesetzt aeruginosa 18 Stunden. (B) Repräsentative Bilder eines noncolonized und kolonisierten Würmer mit der wormsorter getrennt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51090/51090fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51090/51090fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51090/51090fig2.jpg" /> 2. Kolonisation ist für die Transkriptionsreaktion auf P. erforderlichen aeruginosa. RNA-Spiegel von lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), und PGP-5 (D) durch qRT-PCR in Wildtyp-Tiere gemessen, um E. ausgesetzt coli oder P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; für ~ 18 Stunden. Dargestellt sind Mittel und SD von zwei Messungen von einem Experiment, das ein Vertreter der drei ist. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51090/51090fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51090/51090table1.jpg" src="/files/ftp_upload/51090/51090table1.jpg" /> Tabelle 1. Materialien und Reagenzien für einen wormsorter Experiment benötigt.

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Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Die wormsorter erleichtert genetische Screens in Caenorhabditis elegans durch Sortieren Würmer nach Ausdruck von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir eine neue Nutzung: Sortierung nach einer Besiedlung durch GFP-exprimierenden Krankheitserreger, und wir beschäftigen sie, um die schlecht verstanden Rolle der Erreger Anerkennung bei der Einleitung Immunantwort zu untersuchen.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

automated-separation-c-elegans-variably-colonized-bacterial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

8.3K Aufrufe.  University of California, Berkeley.  Die wormsorter erleichtert genetische Screens in Caenorhabditis elegans durch Sortieren Würmer nach Ausdruck von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir eine neue Nutzung: Sortierung nach einer Besiedlung durch GFP-exprimierenden Krankheitserreger, und wir beschäftigen sie, um die schlecht verstanden Rolle der Erreger Anerkennung bei der Einleitung Immunantwort zu untersuchen. 

Serie: Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Forschung

Genetik

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Ein Protokoll zum Infect<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Mit<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Immunologie und Infektion

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Biologie

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Automatische Trennung von

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

Ein Protokoll zum Infect

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen