Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds und vom Kanton Genf unterstützt.

Sobald das SCBA zusammengebaut ist, wird das Wachstum der Embryonen über mehrere Tage überwacht. Deshalb wird vor der Saat Dissektion Verfahren und die Montage des Atemschutzgerätes muss man Samen zu sterilisieren, um zukünftige Verunreinigungen, die angemessene Bewertung der Wirkung der Samenschale Material auf embryonale Wachstum verhindern könnten, zu vermeiden. 1. Seed Sterilisation <ol><li> Gießen 50-60 ul reife und trockene Arabidopsis-Samen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bereiten eine 70% ige Ethanollösung. </li><li> 1 ml 70% Ethanol-Lösung zu der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Samen und Schütteln bei Raumtemperatur für 10 min bei 1200 rpm in einem Vortexer. </li><li> Zentrifugenmikrozentrifugenröhrchen für 3 Sekunden bei 4000 × g, um Samen am Boden des Röhrchens zu konzentrieren. </li><li> Saugt den 70% igen Ethanollösung unter Verwendung einer Vakuum Absaugspitze vorsichtig Verlassen der Samen in den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens. </li><li> 1 ml sterilem destilliertem Wasser zu t<html> Mikrozentrifugenröhrchen er immer noch mit den Samen. </li><li> Schütteln bei Raumtemperatur für 10 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Zentrifugenmikrozentrifugenröhrchen für 3 Sekunden bei 4000 × g, um Samen am Boden des Röhrchens zu konzentrieren. Saugen Wasserstandes mit einer Vakuum-Saug-Spitze vorsichtig so dass die Samen an der Unterseite des Rohres. </li><li> 1 ml sterilem Wasser destilliertes Wasser zum Mikrozentrifugenröhrchen noch mit den Samen. Sicherzustellen, dass die Strömung von Wasser homogen suspendiert die Samen im Inneren der Röhre. Das Ziel ist hier, um zu vermeiden weiterem Schütteln, um die Integrität der Samen zu bewahren. </li><li> Lassen Sie die Samen sesshaft durch die Schwerkraft am Boden der Röhre, indem man das Rohr noch für 30 Sekunden. Saugen Wasserstandes mit einer Vakuum-Saug-Spitze vorsichtig so dass die Samen an der Unterseite des Rohres. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte vier mal 1,8 bis 1,9. Insgesamt ist das Sterilisationsverfahren dauert etwa 30 min. </li></ol> 2. Seed-Überzug NHALT &quot;&gt; Alle weiteren Schritte werden in einer Sterilbank durchgeführt, um sterile Bedingungen zu wahren. <ol><li> Vorbereitung einer Petrischale Platte (100 mm Durchmesser, 20 mm Höhe), die 30 ml Keimmedium durch Autoklavieren einer Lösung, die 4,3 g / l Murashige-Skoog-Medium mit 2,5 mM 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES-KOH , pH 5,7) und 0,8 g / L Agar. Lassen Sie die Lösung abkühlen, in einem 50 ° C Wasserbad vor dem Gießen auf der Petrischale Platte. </li><li> Geben Sie 200 ul sterilem destilliertem Wasser auf das Rohr mit den Samen. Resuspendieren der Samen und übertragen Sie sie auf der Oberfläche der Keimmedium mit einem Standard-Pipette mit einer 1 ml-Spitze. </li><li> Entfernen Sie das umgebende Wasser die Samen auf der Oberfläche der Keimmedium mit Hilfe eines Vakuum-Saug-Spitze. </li><li> Verlassen Sie die Petrischale, die die Samen ohne Deckel in der Sterilbank für 2 Stunden zur weiteren Trocknung. Schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und lassen Sie es unter der Laminar-Standfließen Schrank für etwa 90 min, so daß etwa 4 Stunden seit der Initiierung der Samensterilisationsverfahren (Schritt 1.2) geleitet. </li></ol> 3. Seed Dissection Die folgenden Schritte erfordern die Zusammenarbeit mit einem Stereomikroskop in der Sterilschrank gestellt. Eine Pinzette Dumont Nr. 5 mit abgeschnittenen (dh stumpf) Tipps erleichtert die Handhabung der Samen (Abbildung 1A). <ol><li> Bereiten Sie eine neue Petrischale Platte mit 30 ml Keimmedium. Platz auf der Oberfläche des Mediums zwei nebeneinander liegende rechteckige sterile Whatman 3MM Papiere (1,5 cm x 1,0 cm; 1B, Schritt 1). Whatman 3MM-Papier wird in einem Autoklaven sterilisiert. </li><li> Übertragen Samen auf den Whatman 3MM Papier mit einer sterilen Pinzette (1B, Schritt 2). </li><li> Halten Sie eine individuelle Saatgut vor der Whatman 3MM Papier vorsichtig Drücken der Samen mit den nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen der Zange abgeschnitten ( <stRong&gt; 1B, Schritt 3). </li><li> Schneiden der Samenschale (Testa und Endosperm) der Samen unter Verwendung einer Spritzennadel (z. B. U100 Insulinspritze + 1 ml Spritze, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Fig. 1B, Schritt 4). Die Form der Arabidopsis-Samen ist ellipsenförmigen und es wird empfohlen, um die Samenschale entlang der längsten Halbhauptachse so nah wie möglich an den Ort, an dem die Keimblätter sind an der Keimwurzel (dh weg von der radikalen Spitze) beigetreten geschnitten. Dies hilft, die sichere Freilassung des Embryos in den nächsten Schritt der Prozedur der Präparation. </li><li> Drücken Sie die Samen vor dem Whatman 3MM-Papier mit den nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen der Zange abgeschnitten (Abbildung 1B, Schritt 5). Dieser Schritt löst den Embryo aus der Samenschale durch die Öffnung im Schritt 3.4 (1B, Schritt 6) erstellt. Es wird empfohlen, den Druck auf das Saatgut, wobei die Spitze der Keimblätter sind in der Nähe der Spitze der Keimwurzel (dh weg fr geltenom die Öffnung). </li></ol> 4. Versammlung der Samenschale Bettwäsche Assay (Pressluftatmer) Siehe Diskussion für die richtige Wahl der Anzahl von Samenschalen und Embryonen. <ol><li> Bereiten Sie eine neue Petrischale Platte mit 30 ml Keimmedium. An der Oberfläche des Mediums eine sterile rechteckiges Stück (3,5 cm x 5,0 cm) von Nylon-Mesh (Abbildung 2, Schritt 1). </li><li> Um Beschädigungen zu vermeiden, kann Embryos und Samenschalen auf die Oberfläche der Metallkanten der Zange durch sanftes Drücken Sie sie mit dem Spritzennadel (Abbildung 2, Schritt 2) bewegt werden. Über Embryonen und Samenschalen auf der Nylon-Mesh (Abb. 2, Schritt 3). </li><li> Bauen Sie ein Kreis-und Einzelschicht der Samenschalen mit den abgestumpft Pinzette und Nadel, sicherzustellen, dass Samen Mäntel sind so viel näher wie möglich (Abb. 2, Schritt 4). Versuchen, so viel wie möglich ausgesetzt werden die Samenschale durch die erzeugte ÖffnungNadel nach oben. Dieser Schritt wurde nicht systematisch untersucht. Es könnte jedoch der Wirkungsgrad des Atemschutzgerätes zu erhöhen, da diffundierbare Substanzen Hemmung des Wachstums des Embryos wird erwartet, direkt diffundieren in Richtung der Embryo statt von diesem weg. </li><li> Zeigen die Embryonen als Kreis einzigen Schicht auf der Mitte der Samenschale Bett im Schritt 4.3 zusammengebaut (Fig. 2, Schritt 5). Sicherzustellen, dass die Embryonen in so viel wie möglich näher. </li><li> Die Pressluftatmer unter Dauerlicht (40 mmol / m 2 s ec) Inkubation bei 20-21 ° C In dem Fall, wo ein FR-Impuls wird verwendet, um die Keimung zu verhaften, montieren die Pressluftatmer unter normalem Licht, gelten die FR-Impuls, wie beschrieben, 9 und verlassen Petrischale in der Dunkelheit. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) hier beschriebene Vorgehensweise ist im Prinzip auf jeder Umstand, bei dem die Keimung der Samen von Arabidopsis ist gesperrt (oder verzögert) und wo der Mehlkörper wird vermutet, diese Verhaftung zu implementieren. Letzteres kann durch Entfernen der Samenschale (Testa und Endosperm) und unter Berücksichtigung, dass embryonale Wachstum schneller verläuft relativ zu beobachten, wenn Embryonen werden von der Samenschale umgeben nachgewiesen werden. Die Keimung kann als Reaktion auf bestimmte Umwelt physikalischen Parameter (zB Wasserpotential oder Lichtqualität) oder in bestimmten genetischen Hintergründen (zB Fehlen von GA-Synthese wie in GA1-Mutanten, siehe Abbildung 3) blockiert werden. Es gibt keine allgemein gültigen Regeln über die Zahl der Samenschalen und Embryonen für einen Pressluftatmer eingesetzt werden. Dies hängt von der Samencharge (und insbesondere ihre Frische) und der Art des Experiments durchgeführt werden. Es ist daher wichtig, adjust die Menge an Material, präpariert für jeden bestimmten Fall durch Überwachen des Wachstums auf die Embryos auf dem Bett des Samenschalen auf einer täglichen Basis. Allerdings sind in der Regel nur wenige Samenschalen notwendig, wenn hoch ruhenden Arabidopsis Ökotypen verwendet werden. Nachfolgend sind typische Mengen von Samenschalen und Embryonen, die bei der Montage Pressluftatmer erfolgreich eingesetzt wurden: Pressluftatmer mit ruhenden Keimmaterial 6: * Frisch geerntete (dh ruhende) Kap Verde Insel Ökotypen (CVI): Verwenden Sie 10 Embryonen und 20 Samenschalen. * Frisch geerntete Landsberg (Ler) Samen: Verwenden Sie 10 Embryonen und 80 Samenschalen. Atemschutzgerät in Abwesenheit von Gibberellin (GA)-Biosynthese (Fig. 3): * GA1 mutierten Samen (Columbia - Col - Ökotypen): Verwenden Sie 10 Embryonen und 80 Samenschalen. * Wildtyp Col Samen mit 10 uM Paclobutrazol (ein Inhibitor der Biosynthese GA) in der Keimmedium: Verwenden Sie 10 Embryos und 100 Samenschalen. Paclobutrazol hinzuzufügen, wenn das Medium auf 50 ° C vor dem Gießen in die Petrischale abgekühlt. Atemschutzgerät nach einem Impuls von bis rot (FR) Licht 9: * Verwenden Sie 12 100 Embryonen und Samenschalen. Die einzige Einschränkung der Atemschutztechnik ist, dass es erfordert Geduld und Fingerfertigkeit, um so schnell montieren die Materialien seziert Samen zwar nicht die Tötung der Embryonen. Ein erfahrener Forscher kann 100 Samen innerhalb von 20-30 min zu sezieren. Allerdings müssen möglicherweise weniger erfahrene Benutzer 1 Stunde und erwarten, dass embryonale Schäden. Nach unserer Kenntnis gibt es bisher keine Alternative Techniken, die Rolle des Endosperms für die Kontrolle der Keimung von Samen zu erforschen.

In Arabidopsis reifen Samen wird der Samenmantel der Samenschale, einer äußeren Schicht von abgestorbenem Gewebe mütterlichen Ursprungs, und der Mehlkörper, einer einzigen Zellschicht der lebenden Gewebe des Embryos ein unmittelbar umgebenden zusammen. Das Endosperm und der Embryo aus getrennten Befruchtung Ereignisse abgeleitet: das Endosperm ist ein triploid Gewebe mit zwei Müttern und einem väterlichen Genoms während das Embryo ein diploiden Gewebes mit einer Mutter und einem väterlichen Genoms 2. Die Hauptfunktion traditionell dem Endosperm zugeordnet ist, dass ein Nährgewebe. Jedoch ist es immer deutlicher, dass das Endosperm spielt auch eine zentrale Rolle bei der Samenkeimung steuern. Dieser Begriff wurde zunächst offensichtlich im Fall der Ruhe, ein Merkmal von neu produzierten Samen ausgestellt. Ruhenden Samen nicht, trotz der Anwesenheit von günstigen Keimbedingungen keimen. Samen verlieren ihre Keimruhe nach einer Reifezeit und werden nondormant, dh sie keimen, wenn günstige Keimbedingungen ausgesetzt. In vielen Pflanzenarten, darunter der Modellpflanze Arabidopsis wird die Samenschale zwingend erforderlich, um die Keimung von ruhenden Samen zu verhindern, da die Entfernung der Samenschale löst embryonale Wachstum und Begrünung 3,4. In Arabidopsis Bethke et al. Beobachtet, dass die Keimung blieb nach dem Entfernen der Samenschale, während der Mehlkörper rund um den Mehlkörper 5 verdrängte. Diese Beobachtungen stark an, dass die Mehlkörper wird das Gewebe innerhalb der Samenschale Ausüben einer repressiven Aktivitäten auf den Embryo. Allerdings glaube Samenschale Entfernung Experimente nicht unbedingt zur Klärung der Art der Keimung repressive Aktivität durch die Samenschale vorgesehen noch die Identifizierung der Gene, die es zu implementieren. Wir vor kurzem eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer), wo Samenschalen und Embryonen sind physisch getrennt, aber in enger Nähe gehaltenerklärung, so dass die Keimung repressive Aktivität durch den Mehlkörper vorgesehen ist, gehalten 6. Das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant, und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien. Als Ergebnis können die genetischen Bahnen Steuern Keimung und spezifisch im Endosperm und Embryo-Betriebs seziert werden. Das Atemschutzgerät wurde im Rahmen der Vegetationsruhe verwendet, um zu zeigen, dass der Mehlkörper gibt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) in Richtung der Embryo seine Wachstums 6 verdrängen. Darüber hinaus wir die Pressluftatmer nutzen könnten, um die Signalwege, die in Mehlkörpers und embryonalen Geweben zu identifizieren, um Ruhe zu fördern. Die Rolle des Endosperms, um Keimung Kontrolle wurde weiter verstärkt, indem man den Fall der nondormant Samen auf einen Impuls des fernen Rot (FR) belichtet. Frühe auf Samenquellung ein Lichtimpuls FR ist bekannt, dass die Keimung hemmen 7,8. Wenn Samenschalen wurden aus Samen entfernt einen Impuls von Licht FRwar nicht in der Lage, um die Keimung hemmen, was stark darauf hindeutet, dass der Mehlkörper können auch die Keimung von Samen nondormant 9 verdrängen. Bemerkenswerterweise kann das Atemschutzgerät auch zur FR-abhängige Hemmung der Keimung zu rekapitulieren. Dies erlaubt zu zeigen, dass die FR-abhängige Hemmung der Keimung der Samen ist auch ein Prozess, der ABA-Freisetzung aus dem Mehlkörper 9. Darüber hinaus erlaubt die Identifizierung der verschiedenen Atemschutzlichtsignalwege, die in der Mehlkörpers und der Embryo nondormant die Keimung der Samen in Reaktion auf Licht Cues 9,10 steuern. Das Atemschutzgerät scheint daher eine zuverlässige Technik, um die Funktion des Endosperms im Rahmen der Steuerung der Samenkeimung erkunden. Es ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um in vitro beurteilen, ob Gene im Verdacht, die Keimung Kontrolle arbeiten im Endosperm, Embryo oder beiden Geweben. Hier werden wir ausführlich die verschiedenen Schritte erforderlich, um eine Atemschutz montieren.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf AG</td><td>5355 000.011</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td></tr><tr><td>Vacusafe Comfort</td><td>INTEGRA Biosciences AG</td><td>158 310</td><td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td></tr><tr><td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>664 102</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>Agar (plant agar)</td><td>Duchefa Biochemie B.V.</td><td>P1001</td><td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td></tr><tr><td>Dumont forceps #5</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11251-10</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>BD Micro-Fine</td><td>324827</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td></tr><tr><td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td><td>SEFAR AG</td><td>03-50/31</td><td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF Plant Climatics</td><td>Percival I-30BLLX</td><td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td></tr><tr><td>Paclobutrazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46046</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr></tbody></table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

Die Arabidopsis Endosperm besteht aus einer einzigen Zellschicht um den reifen Embryo und spielt eine wesentliche Rolle, um die Keimung von ruhenden Samen oder die der nondormant Samen von einem fernen Rot (FR) Lichtpuls bestrahlt verhindern. Um weitere Einblicke in die molekularen genetischen Mechanismen, die Keimung repressive Tätigkeit des Mehlkörpers ausgeübt zugrunde liegt, wurde ein &quot;Samenschale Bettwäsche&quot;-Test (Pressluftatmer) entwickelt. Das Atemschutzgerät ist ein Dissektion Verfahren physische Trennung Samenschalen und Embryonen aus Samen, die es ermöglicht die Überwachung des Wachstums von Embryonen auf einer darunter liegenden Schicht der Samenschalen. Bemerkenswert ist, rekonstruiert das Atemschutzgerät die Keim repressiven Aktivitäten der Samenschale im Rahmen der Samenruhe und FR-abhängige Steuerung der Keimung der Samen. Da das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien, die genetischen Signalwege steuern Keimung und speziell optriebs im Endosperm und Embryo kann zerlegt werden. Hier werden wir ausführlich die Prozedur, um einen Pressluftatmer montieren.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass mutierte Samen nicht GA synthetisieren konnten als Ergebnis der hohen ABA-Akkumulation in Samen keimen 11,12. Allerdings, die Unfähigkeit, keimen erfordert die Samenschale, da seine Entfernung löst embryonale Wachstum 13. Diese stark an, dass das Endosperm der Samen nicht GA synthetisieren ist die Freigabe ABA embryonale Wachstum zu blockieren. Wir erwarten daher Samen Mäntel nicht GA zu synthetisieren, um das Wachstum der Embryonen in einem Pressluftatmer im Gegensatz zu Samenschalen nicht GA-und ABA-Synthese blockieren. Hier verwenden wir GA1-21 (Salk Insertionslinie Salk_109115) mutierten Samen, die ein T-DNA-Insertion Störung der GA1-Gen (Beitritt AT4G02780) ent-copalyl Synthase, die für GA-Biosynthese 14 (SALK_109115 Eintragslinie in GA1 (kodiert Col Ökotypen) wird in der SALK Signaldatenbank 15 (referenziert <a href="http://signal.salk.edu/" target="_blank">http://signal.salk</a>. Edu /). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen 13, könnte GA1-21-Mutante Samen nicht keimen 80 Stunden nach Samenquellung (3, Tafel 1). Im Gegensatz dazu und weiter im Einklang mit früheren Ergebnissen 13, Samenschale Entfernung ausgelöst GA1-21 Embryo Wachstum (Abbildung 3, Feld 2), es sei denn ABA im Medium vorhanden (Abb. 3, Feld 3) war. Panel 4 in Abbildung 3 wurde 80 Stunden nach der Samenquellung aufgenommen und zeigt einen Pressluftatmer mit GA1-21 Embryonen auf einem Bett von 80 GA1-21 Samenschalen. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese, blockiert GA1-21-Mutante Samenschalen das Wachstum der GA1-21 Embryonen. Frühere Arbeiten zeigten, dass in ruhenden Samen der Samenschale synthetisiert und gibt ABA Richtung Embryo aufgrund der konstitutiven Expression des GA-Antwort DELLA Faktor RGL2, die ABA-Akkumulation in tränkte fördertSamen 6,11. Unter Bedingungen, wo GA-Synthese blockiert wird die DELLA Faktor RGL2 konstitutiv sammelt und fördert die ABA-Akkumulation 11. Fehlen RGL2 und ABA-Synthese im GA1-21 Samenschalen wird daher erwartet, dass das Wachstum der GA1-21 Embryonen in einem Atemschutzgerät zu ermöglichen. Um diese Hypothese zu benutzten wir die aba2-1-Mutante Allel (Ökotyp Col), mangelhaft in ABA-Synthese als Folge einer Punktmutation im Gen für Xanthosin Dehydrogenase (AT1G52340) und dem rgl2-14 T-DNA-Insertion Linie (Salk_027654 zu testen, Ökotyp Col) 16. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Verfahren für die Saatgut Dissektion. A) Diagramm beschreibt, wie abgeschnitten Zange für Saatgut Dissektion zu machen. Zange kann mit einer Schere oder Zange abgeschnitten. Wenn die Zange geschlossen wird, der nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen shou. ld bedecken eine Fläche von der Größe eines Samens B) Schritt 1: zwei nebeneinander rechteckige sterile Whatman 3MM Papiere werden auf einer Petrischale Platte mit MS festen Medium festgelegt. Schritt 2: Samen werden auf der Oberfläche der Papiere Whatman 4 h nach der Imbibition übertragen. Schritt 3: die Präparation Verfahren erfordert, hält das Saatgut vor der Whatman-Papier mit den abgeschnittenen Pinzette. Schritt 4: eine Spritzennadel verwendet wird, um die Samenschale zu schneiden, wie gezeigt. Schritte 5 und 6: Die nebeneinander liegenden Spitzen der geschlossenen Zange zum schieben der Embryo aus der Samenschale durch die Seite des Schnitts. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig2.jpg" /> 2. . Vorgehensweise für die Montage der Samenschale Bettwäsche Test Schritt 1: Ein rechteckiges Stück Nylon-Mesh wird auf eine Petrischale Platte mit MS festen Medium festgelegt. Schritt 2 und 3: Dissected Embryonen und Samenschalen sind sanftbewegt wird, um die Kanten der Zange mit der Spritzennadel vor, um sie auf dem Nylonnetz übertragen. Schritt 4 und 5: Bauen Sie ein Kreis-und Einzelschicht der Samenschalen und entsorgen die Embryonen als Kreis einzigen Schicht auf der Mitte der Samenschale montiert Bett. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig3.jpg" /> 3. Repräsentative Ergebnisse mit Saatgut nicht GA synthetisieren. Seed Mantel Bettwäsche Tests unter Verwendung von Samenschalen und Embryonen von GA1 (GA1-21) mutierten Samen seziert, unfähig, GA synthetisieren. Panels zeigen Pflanzenmaterial wie in der Abbildung 80 Stunden nach Samenquellung beschrieben.

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A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um embryonale Wachstum beeinflussen.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

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Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.4K Aufrufe.  Université de Genève.  Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um em...

Serie: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Here we present a protocol for assessing seed survivorship, germination and dormancy under field conditions using buried, labeled seed strips and tetrazolium chloride (TZ) viability testing.

Zuverlässige Methode zur Beurteilung der Samenkeimung Dormanz und Mortalität unter Feldbedingungen

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Forschung

Umwelt

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Entwicklungsbiologie

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through nanoindentations with an atomic force microscope (AFM) coupled with an optical inverted fluorescence microscope. The method consists of applying controlled forces to the sample while measuring its deformation, allowing quantifying parameters such as the apparent Young's modulus of cell walls at subcellular resolutions. It requires a careful mechanical immobilization of the sample and correct selection of indenters and indentation depths. Although it can be used only in external tissues, this method allows characterizing mechanical changes in plant cell walls during development and enables the correlation of these microscopic changes with the growth of an entire organ.

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

The atomic force microscopy indentation protocol offers the possibility to dissect the role of the physical properties of the cell wall of a particular cell of a tissue or organ during normal or constrained growth (i.e., under water deficit).

Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung der physikalischen Eigenschaften epidermaler Zellen lebender Arabidopsiswurzeln

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Biologie

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Immunologie und Infektion

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

Ein arbeitssparendes und wiederholbares Touch-Force Signaling Mutant Screen Protocol zur Untersuchung der Thigmomorphogenese einer Modellpflanze Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

Identifizierung der Gene, die an der Entwicklung der Stomata beteiligt sind, mittels epidermalem Phänotyp-Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden

Zusammenfassung

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