Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Bereiche unterstützt &quot;Mesoskopische neurocircuitry&quot; (Nr. 22115002) und &quot;Comprehensive Brain Science Network&quot; (Nr. 221S0003) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft, and Technology, Japan, um AN und Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (Nr. 21700344) des Japan-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (JSPS) zu HK

1. Larven Vorbereitung <ol><li> Pflegen Sie fliegen Zeilen OK6-Gal4, UAS-ChR2 oder OK6-Gal4, UAS-NpHR2 in Plastikröhrchen mit Standard-fly Essen. </li><li> Spread-Hefe-Paste mit all-trans-Retinal (ATR) in geeigneten Konzentrationen (1 mM für ChR2, 10 mM für NpHR2 (&quot;NpHR&quot; für kurz) auf einem Apfelsaft-Agar-Platte. </li><li> Pick up 2. oder 3. Larvenstadium aus den Fläschchen und legte sie auf den ATR-haltigen Platte. </li><li> Rear sie bei 25 ° C in der Dunkelheit für einen angemessenen Zeitraum (1 Tag für ChR2, 2 Tage NpHR.) </li></ol> 2. Mikroskop-Setup <ol><li> Bringen Sie eine CCD-Kamera (XCD-V60, Sony) zu einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop (in unserem Fall, FV1000, Olympus) mit einem C-Mount-Befestigung (Vergrößerung 0,35 x). </li><li> Wenn es einen Auslöser entlang der Lichtweg von dem Objektiv der CCD-Kamera, die während der Laser-Scanning-schließt, entfernen Sie ihn sorgfältig. Da dieser Schritt hängt von der microsbewältigen Setup, kontaktieren Sie das Mikroskop Hersteller für den technischen Support, falls erforderlich. </li></ol> 3. Dissection <ol><li> Spülen Sie die ATR-fed Larven mit Wasser, um restliche Lebensmittel aus dem Körper zu entfernen. </li><li> Legen Sie die Larve auf einem Sylgard Schale mit Beschichtung, Rückenseite nach oben (die Rückenseite hat zwei Trachealtuben längs verlaufende, einer auf jeder Seite der dorsalen Mittellinie). Die Dicke der Sylgard etwa 5mm. </li><li> Legen Sie ein Insekt Stift (Austerlitz Insekt Stifte, Φ0.10mm, Edelstahl) in den Schwanz zwischen den Trachealtuben mit einer Pinzette (# 5 Inox, FST von Dumont, Schweiz). Die Stifte, ca. 10mm lang, sollte gebogen oder geschnitten werden, um kurz genug sein (~ 2mm lang) zu vermeiden, schlagen und Beschädigung der Oberfläche des Objektivs. Dann legen Sie die zweite Insekt Stift in den Kopf der Larve der Nähe der Mündung Haken, schwarz Klauen-artige Struktur am vorderen Ende. </li><li> In Ca 2 +-freie Kochsalzlösung (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Saccharose 36 mM (pH 7,1)) zu halten, der Larve feucht. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe der Schwanz mit Mikro-Schere (MB-50-7, Napox, Japan). </li><li> Von den Einschnitt, einen Längsschnitt entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung des Kopfes. Achten Sie darauf, das Bauchmark (VNC) und Axone schädigen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt am Kopf seitlich. </li><li> Platz 4 Stifte an jeder Ecke des seziert Körperwandschicht. Die Körperwand gestreckt werden sollen genug, um eine segmentale Muster der Körperwand zu visualisieren, aber nicht zu viel peristaltische Bewegung zu behindern. </li><li> Entfernen Sie die inneren Organe mit Ausnahme des Gehirns und des VNC und spülen Sie die Probe mit Ca 2 +-freien normaler Kochsalzlösung. </li><li> Stellen Sie die Ausrichtung des Bauchmark sein bilateral symmetrisch, indem die Position und Orientierung der Insekten Pins auf Körper Wand. Um die Position des Bauchmark beheben, legen Sie einen Stift durch das Gewebe zwischen dem Gehirn und den Mund Haken hinunter zum Sylgard. </li> &lt;li&gt; Tauschen Sie den Puffer mit 2 mM Ca 2 + Ringer-Lösung (NaCl 130 mM, KCl 5 mM MgCl 2 2 mM CaCl 2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, 36 mM Saccharose (pH 7,3)). </li></ol> 4. Imaging mit Laser Illumination <ol><li> Bringen Sie ein 4x trocken Objektiv (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japan) in der konfokalen Mikroskop und stellen Sie die Larve Vorbereitung auf der Bühne. </li><li> Besorgen Sie sich ein Bild von der Übertragung seziert Vorbereitung mit einem roten Laser (633nm), um das Bauchmark durch konfokale Mikroskop suchen. Aus diesem Scannen, sicher sein, nicht um einen 488nm oder 559nm Laser, der unerwünschte Stimulation ChR2 oder NpHR induziert bzw. zu verwenden. </li><li> Definieren Sie die Region of Interest (ROI) auf dem Übertragungsweg Bild. Vergrößerte Modus nützlich sein könnte für detaillierte Ermittlung des ROI. </li><li> Ändern Sie den Filter-Set des Mikroskops mit 488nm oder 559nm Licht beleuchten. </li><li> Beleuchten Sie die Vorbereitung mit einer Halogenlampe, um den Körper Wand zu visualisieren. The Zubereitung kann mit einer CCD-Kamera, die an dem konfokalen Mikroskop beobachtet werden. </li><li> Notieren Sie sich die Bewegung des Körpers Wand und schalten Sie den Laserstrahl auf und ab, während die Überwachung der Bewegung. </li></ol>

<ol>
	<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae.">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li><li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae:+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation.">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zeitliche und lokale Störung der neuronalen Aktivität ist eine unschätzbare Technik für die Analyse der Netzwerk-Dynamik von neuronalen Schaltkreisen. In diesem Protokoll, präsentieren wir eine Methode, um neuronale Aktivität durch Optogenetik mit einem Laser zu manipulieren. Die Laser der hohen Richtwirkung ermöglicht mehr lokalisierte optogenetische Stimulation als weites Feld Stimulation mit Quecksilber oder Xenon-Lampe. Obwohl Laser Beleuchtung bereits auf optogenetics in früheren Studien angewendet werden spezielle Einrichtungen, wie Glasfaser, Mikromanipulator und Laserquelle in den meisten früheren Studien erforderlich. In diesem Protokoll, verwenden wir eine herkömmliche konfokale Mikroskopie für lokale Beleuchtung. Da der konfokalen Mikroskop-System weit verbreitet ist, wird diese Methode öffnen Sie die Möglichkeit, höhere Auflösung Optogenetik in vielen Labors gelten. Das Protokoll hat zwei kritische Punkte: Larven Dissektion und Laserleistung. Erstens, wenn das Gehirn, das Bauchmark oder ein Motor Nerv beschädigt During Dissektion, werden die Larven weniger aufweisen oder keine spontane Peristaltik. Präzision ist es wichtig, insbesondere, wenn ein Einschnitt auf der Rückenseite mit Feder Schere und Entfernen von inneren Organen mit einer Pinzette. Details zu den Dissektion wurden bereits 21 gemeldet. Zweitens ist, wenn eine ausreichende Stimulation erreicht werden soll, eine Laserleistung von etwa 0,1 bis 1 mW / mm 2 für ChR2 oder 1 ~ 10 mW / mm 2 für NpHR erforderlich. Wir untersuchten die Laserleistung gesamten Lichtleistung unterhalb einer Objektivlinse um geschätzte Beleuchtungsfläche unterteilt. Wir messen die gesamte Lichtleistung mit einem Leistungsmesser (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). Wir schätzten die Beleuchtungsfläche als kreisförmige Konstanten mal dem Quadrat der Wellenlänge des Lasers, die in etwa gibt Ausleuchtung in Beugungsgrenze. Effektive Beleuchtung Macht auf die Probe kann nicht nur von der Leistung des Lasers Ausgang eingestellt werden, sondern auch durch die Änderung der Scangeschwindigkeit und tauber von Wiederholungen. Wir gescannt Laser mit 20-100 us / Pixel für 63 mal. Darüber hinaus sind die Expression von optogenetics Proteins und der Menge des ATR auch kritisch für die Stimulation Effizienz. Dementsprechend wird, wenn Larven zeigten keine Reaktion optogenetische, sollten die folgenden Punkte überprüft und korrigiert werden: 1) Laserleistung (durch Optimierung Mikroskop-System), 2) Expression von Optogenetik Protein (indem Genotyp und Aufzucht Temperatur) und 3) Menge ATR (durch Einstellen Konzentration von ATR und Fütterung Zeitraum). NpHR erfordert höhere Konzentration von ATR als ChR2 tut von unbekannten Gründen 13. ChR2 funktioniert gut in Larven in Lebensmitteln mit geringerer ATR (zB 0,1 mm), als hier (1 mM) gezüchtet. Wie füttern Larven bis 1 mM ATR ist ausreichend für die Herstellung ChR2 photo-reaktiven, empfehlen wir diese Konzentration für den ersten Versuch in ChR2 Experimente. Die Konzentration der ATR kann anschließend unten von 1 mM titriert werden. Was Expositionsdauer für ATR, empfehlen wirdie Dauer hier beschriebene robuste optogenetische Kontrolle. Wir haben oft versäumt, optogenetische Antwort zu beobachten bei der Fütterung Larven ATR für kürzere Dauer. In diesem Protokoll werden Laserbeleuchtung und Bildaufnahme von einem separaten Rechner betrieben. Also, das ist eine leichte Erkennung von raum-zeitlichen Muster der Laser-Beleuchtung durch CCD-Kamera für die kritische Analyse der Daten. Wenn Laserpunkt oder Linie ist dim auf CCD-Bild, sollten Sie optimieren die Leistung der Halogenlampe und der Gain-Wert der CCD-Kamera, die Laserbeleuchtung visualisieren, während Körper Wand sichtbar. Spatiotemporal Beleuchtung in diesem Protokoll gezeigt informiert über Larven Motorkreise, jedoch hat das Verfahren einige Einschränkungen. Wie der &quot;räumlichen&quot; Aspekt, Standort der Beleuchtung wird durch eine geringe Vergrößerung CCD Bild für Videoaufnahmen Körper Wand Bewegungen verwendet aufgezeichnet. Dementsprechend kann Beleuchtungsbereich auf Segmentebene zugeordnet werden, aber nicht auf zellulärer Ebene. Was den &quot;temporal &quot;Aspekt Zeitspanne zwischen dem Einschalten der Laser-Scan durch konfokale Mikroskop und Beleuchtung durch Laser hängt von dem konfokalen Mikroskop und Scannen Zustand. Folglich wurden Tests durch Versuch und Irrtum erforderlich ist, um eine Beleuchtung Timing einzustellen. Da der Zeitpunkt der Beleuchtung kann in CCD-Filme mit entsprechender Software wie ImageJ bestimmt werden kann, ist der kritische Faktor in zeitlicher Auflösung Bildrate von CCD-Kamera Bildgebung. typischerweise Wir setzen die Bildrate für 7,5-15 Frames pro Sekunde. Advances in optogenetische Tools bieten uns die Chance, dieses Protokoll zu ändern. Wir verwendeten 3. Larvenstadium besitzen OK6-Gal4 und UAS-ChR2 [H134R] oder UAS-NpHR2. Andere optogenetische Werkzeuge statt ChR2 [H134R] oder NpHR2 wie ChR2 [T159C/E123T] NpHR3 oder Arch kann die Effizienz der Tätigkeit Steuerung 22 zu steigern. Darüber hinaus können mit anderen gal4 Linien oder Analyse in anderen Entwicklungsstadien mehr Informationen über den Motor circuits. In diesem Protokoll wurde die motorische Aktivität durch Übermittlung Bilder der Körperwand Kontraktion mit einer CCD Kamera überwacht. Die Aktivität von Motoneuronen mit Calcium-sensitiven Fluoreszenz-Moleküle (zB GCaMP) kann auch direkt überwacht werden, während die Manipulation neuronale Aktivität mit ChR2 oder NpHR. In diesem Fall werden blaue Beleuchtung in einem weiten Bereich und eine hochempfindliche CCD-Kamera (zB EMCCD Kamera) anstelle einer Halogenlampe und der normalen CCD-Kamera zuvor beschrieben. Um räumliche Auflösung von Stimulation zu verbessern und gleichzeitig die Überwachung Körperwandschicht Bewegung, mit einem zusätzlichen Objektiv eine erweiterte Methode sein kann: Beleuchtung des Bauchmark durch eine hohe Vergrößerung Objektiv (zB 40x) von oben auf die Probe und Überwachung Körperwandschicht durch niedrige Vergrößerungslinsenposition (zB 4x) unterhalb der Probe. Dieses Dual Lens System ermöglicht es uns, Nervensystem in höhere räumliche Auflösung zu stimulieren. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Das Protokoll abgebildet anderen neuronalen Schaltkreise aufgebracht werden kann, vorgesehen optogenetische Werkzeuge im Nervensystem exprimiert und Herstellung in dem ausreichend Licht in das neuronale Gewebe abgegeben werden kann, kann hergestellt werden.

Vorwärts peristaltische Fortbewegung in Drosophila-Larven erfolgt durch die Ausbreitung der Muskelkontraktion von hinten nach vorne Segmente. Diese Bewegung wird durch sequentielle Aktivierung von Motoneuronen in Bauchmark entlang der Körperlängsachse realisiert. Um die Schaltung hinter dieser gemusterten ausbreitenden Aktivität untersuchen, könnten lokale Störung der neuronalen Aktivität einen informativen Ansatz. Obwohl pharmakologische Assay spezifischen Substanz, wie Neurotransmitter, in Nervengewebe steuern kann, kann die Wirkung von pharmakologischen Drogen unter den fast alle Segmente ähnlich, weil die Larven Bauchmark ist repetitive Struktur von ähnlichen Neuromeren entlang der Längsachse aus. Alternativ könnte man optogenetische oder temperaturempfindlichen Sondenmoleküle in eine kleine Anzahl von Segmenten auszudrücken. Jedoch sind solche spezifischen GAL4 Linien sehr schwierig zu erzeugen. Hier präsentieren wir eine Methode zur Manipulation von Neuronen in einigen Segmentengen mit Laser-Beleuchtung. Unter Ausnutzung des räumlich begrenzten Ausleuchtung in der konfokalen Mikroskopie, kann man stören die Aktivität von Neuronen in einem lokalen Bereich. In Kombination mit dem Expressionsmuster der Sonde durch Teilmengen der Neuron-spezifische GAL4 Linien, diese Laserbeleuchtungsverfahren verbessert die räumliche Auflösung bei Störung. Und weil diese Methode erfordert nur einen herkömmlichen konfokalen Mikroskop, ist der Kauf von zusätzlichen Laborgeräte in der Regel nicht erforderlich. Mit diesem Verfahren untersuchten wir die Rolle des Motors neuronalen Aktivität während der Ausbreitung der Motorleistung 13. Durch das Blockieren der Aktivitäten von Motoneuronen in wenigen Segmenten während peristaltische Bewegung, waren wir in der Lage zu prüfen, ob die Aktivität von Motoneuronen sich für die Ausbreitung des Motors Ausgangssignal erforderlich. Lokale und vorübergehende Blockade von Motoneuronen verhaftet die Ausbreitung der Peristaltik. Nachdem die Blockade entfernt wurde, propagation erschien am Segment, wo die Welle verhaftet worden war. Dieses Phänomen legt nahe, dass ohne Motor neuronaler Aktivität, die Ausbreitungs-Welle nicht entlang der Bauchmark einer weiteren Vertiefung, und somit die Aktivierung von Motoneuronen ist für peristaltische Bewegung. Wir haben bereits detaillierte Daten und Diskussionen über dieses Phänomen in Inada et al. (2011) 13 gemeldet. Hier beschreiben wir die Methode, um neuronale Aktivität während der Überwachung interaktiv stören die Bewegung der Larven seziert. Mit verschiedenen Gal4-Linien und eine Reihe von räumlich-zeitlichen Muster für Aktivität Manipulation kann eine Logik-Schaltung durch Störung Ansprechverhalten des Motors Schaltung untersuchen.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

Drosophila Larven Fortbewegung ist ein herrliches Modellsystem in Entwicklungs-und physiologischen Neurowissenschaften, die aufgrund der genetischen Zugänglichkeit der zugrunde liegenden neuronalen Komponenten in den Schaltungen 1-6. Anwendung der Optogenetik 7,8 im Larvenstadium neuronalen Schaltkreis ermöglicht es uns, die neuronale Aktivität in räumlich und zeitlich strukturiert Möglichkeiten 9-13 manipulieren. Typischerweise Proben im Großen und Ganzen mit einer Quecksilberlampe belichtet oder LED, so Spezifität der Zielneuronen durch binäre Genexpressionssystemen wie die Gal4-UAS-System 14,15 gesteuert. In dieser Arbeit, die räumliche Auflösung auf &quot;sub-genetische Auflösung&quot; zu verbessern, wir lokal beleuchtet eine Untergruppe von Neuronen im Bauchmark mit Hilfe von Lasern in einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop durchgeführt. Während der Überwachung der Bewegung des Körpers Wand des semi-intakten Larven wir interaktive aktiviert oder gehemmt neuronale Aktivität mit Channelrhodopsin 16,17 or Halorhodopsin 18-20, beziehungsweise. Durch räumlich und zeitlich eingeschränkte Beleuchtung des Nervengewebes, können wir manipulieren die Aktivität bestimmter Nervenzellen in der Schaltung bei einer bestimmten Phase des Verhaltens. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung der Beziehung zwischen den Tätigkeiten eines lokalen neuronalen Assembly im Bauchmark und der raumzeitlichen Muster der Motorleistung.

<html> Lokale und transiente Aktivierung von Motoneuronen mit ChR2. Wir drückten ChR2 in Motoneuronen. Die Axone von Motoneuronen, die aus jedem Segment VNC Projekt zu einem entsprechenden Segment des Körpers Wand. Wenn wir ein oder zwei Segmente des VNC angeregt mit einem blauen Laser zeigten Muskeln in den entsprechenden Segmenten Kontraktionen (Abbildung 1). Lokale und vorübergehende Hemmung von Motoneuronen mit NpHR. Wir drückten NpHR in Motoneuronen. Wenn wir ein paar (1 ~ 2) Segmente des VNC angeregt mit einem gelben Laser während der Peristaltik Muskelkontraktionen wurde die sich ausbreitende Welle an den entsprechenden Segmenten des Körpers Wand (Abbildung 2) verhaftet. Dann die Welle gestartet von den Segmenten verhaftet, wenn wir ausgeschaltet Laserbeleuchtungsverfahren 13. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; Abbildung 1 &quot;fo: content-width =&quot; 5,5 Zoll &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Lokale Aktivierung von Motoneuronen mit ChR2. A. Schema der lokalen Aktivierung filetiert Vorbereitung. Mit blauer Belichtung von einigen Segmenten des Bauchmark Ausdruck ChR2 in Motoneuronen, werden die Muskeln in den entsprechenden Segmenten kontrahiert (Pfeilspitze). B. Übertragung von Bildern einer seziert Larve. Lokale Beleuchtung des Bauchmark (Pfeilspitzen) induziert segmentalen Kontraktion der Muskeln Körper Wand (Pfeile). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Lokale Hemmung von Motoneuronen mit NpHR. A. Schema der lokalen Hemmung filetiert Vorbereitung. Mit gelb-light Beleuchtung von einigen Segmenten des Bauchmark Ausdruck NpHR in Motoneuronen, Muskeln Kontraktion während spontan aufgetreten Peristaltik (Pfeilspitze in der Spitze) sind entspannt (Pfeilspitze in den Boden.) B. Übertragung von Bildern einer seziert Larve . Lokale Beleuchtung des Bauchmark (Pfeilspitzen) entspannt die spontan vergeben Körper Wandsegmenten (Pfeile).

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Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für optogenetische Manipulation motoneuralen Aktivität, während die Überwachung der Motorleistung (Muskelkontraktion) in semi-intakten<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven mittels Laser in einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop. Diese Technik ermöglicht es Forschern, lokale Störung der neuronalen Aktivität in wenigen Neuromeren erreichen, um die Dynamik des Motors Schaltungen aufzuklären.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K Aufrufe.  The University of Tokyo. Hier beschreiben wir ein Protokoll für optogenetische Manipulation motoneuralen Aktivität, während die Überwachung der Motorleistung (Muskelkontraktion) in semi-intakten Drosophila Larven mittels Laser in einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop. Diese Technik ermöglicht es Forschern, lokale Störung der neuronalen Aktivität in wenigen Neuromeren erreichen, um die Dynamik des Motors Schaltungen aufzuklären.

Serie: Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Die Kombination Behavioral Endokrinologie und Experimentelle Wirtschaftsforschung: Testosteron und Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...