We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

倫理的なステートメント 本研究は、N15 / 10とによって承認されたN65 / 10、、倫理的な許可N338 / 09下の実験動物のためのスウェーデン国家委員会と欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）のガイドラインに従って行われます北ストックホルムの動物倫理委員会。 1.組織標本<ol><li> 灌流＆固定 <ol><li>左心室を介しtranscardial灌流を行うためにイソフルランで動物を麻酔。 0.1 M PBS（PFA）中の4％パラホルムアルデヒドに続く血液成分を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて血管系のリンスを開始します。 </li><li> PFAに浸漬することにより、解剖脳、脊髄及び末梢LN組織を固定します。 4℃で24時間後、さらに処理するまで4℃でPBSにPFAから組織や店舗を転送します。あるいは、商業PBSに、250ミリリットルS＆で9グラムのNaClを溶解＃246; rensenバッファと750ミリリットルを脱イオン水（のdH 2 O）を追加します。 0.2 Mソレンセン緩衝液（pH7.4）を調製することは2.5 L の dH 2 O中に13.8グラムのNaH 2 PO 4×1H 2 Oおよび71.2グラムのNa 2 HPOのx 2H 4 2 Oに溶解します</li></ol></li><li> 脱水＆埋め込みます <ol><li>カミソリの刃を使用して、約5ミリメートルの厚さの部分に組織を切断します。 </li><li>キシレン、最後にパラフィン（ 表1）、続いて組織テックVIP真空浸潤プロセッサ（エタノールの上昇濃度に浸漬に基づく標準的な手順を使用して、組織の硬化処理（脱水）を開始します。 </li><li>金型内に組織を置き、「パラフィンブロック」を形成するために、試料周辺の流動パラフィン中に注ぎます。長期保存は、室温（RT）が必要です。しかし、セクショニングの前に、 例えば 、ブロックを冷却するために4℃で（O / N）で一晩推奨されます。</li></ol></li></ol> 2.セクショニング<ol><li>ナイフを横切って前後に移動することができる、スレッジミクロトームの固定ホルダーにパラフィンブロックを配置します。ブロックとミクロトームナイフ（すなわち、ナイフの幾何学的形状に依存するだけでなく、切削速度および技術上の）間の最適な角度を調整します。 </li><li>パラフィンブロックから5μm厚断面 - 3をカット。 </li><li>水容器の中にだけ切断した断面を転送し、スライドガラス上に水から、その後、それをマウントします。 </li><li>残留水および潜在的な気泡を除去するためにペーパータオルに対して慎重に取り付けられた部分を押してください。商業的にプレコーティングされた接着剤ガラススライドをお勧めしますが。 </li><li> 60°C - ドライは50にストーブに時間のカップルのためのスライドをマウントしました。 </li></ol> 3.脱パラフィン（再水和＆内因性ペルオキシダーゼブロッキング） <ol><li>スライドを浸し2倍キシレン（あるいはキシレン代替品へXEM-200）、毎回15から20」。 </li><li> 99％エタノールですすいでください。 </li><li>内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、0.25％過酸化水素を含むメタノール溶液に30 &#39;のためのセクションをインキュベートします。 </li><li>蒸留水で終わる、増加水分含量（99％、70％エタノールを使用して再水和を継続します。 </li><li>この点からカバーの装着までのセクションでは、湿った保たする必要がスリップ。 </li></ol> 4.抗原回復<ol><li> （EDTA緩衝原液は、1.21グラムトリスおよび50ミリリットルのdH 2 Oに溶解した0.37グラムのEDTAが含まれている60のための抗原回復溶液（この場合はEDTA pH8.5の緩衝液）」のスライドを沸騰するための蒸し器を使用してください。作業を準備します47.5ミリリットルのdH 2 O中での溶液希薄2.5ミリリットルのEDTA原液）。 </li><li>約室温でのスライドをクールダウン。 1時間してから3すすぎ - トリスで5倍は0.05 Mトリス及び0.15MのNaClからなる（TBSは、代わりにPBSを使用）緩衝生理食塩水; pHを7.5に調整のwi第HClです。あるいは、商業TBSを使用します。 </li></ol> 5.非特異的結合部位をブロックします<ol><li>非特異的なバックグラウンド反応を回避するために、10％ウシ胎児血清（FCS）、90％DAKO緩衝液を含有するブロッキング溶液中で30 &#39;室温で切片をインキュベートします。 </li></ol> 6.ダブル免疫標識：プライマリ腹筋との同時インキュベーション<ol><li>ブロッキング溶液中で一次抗体の必要量を希釈し、O / Nで4℃でインキュベートします。 （; 1 ED1：1,000）α-CD68またはα-IBA1（Aif1、1：1,000）、またはα-CD8α（オックス-8; 1：200）：;二重免疫染色のためにα-エオタキシン（300 1 CCL11）を組み合わせ。 </li><li> （代替的に10倍希釈したDAKOバッファを使用）TBSバッファーで3〜5倍のスライドを洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液中で、室温で1時間インキュベートする：二次抗体の必要量（200ビオチン化抗ヤギおよびAP結合抗マウス、両方1）を希釈します。 </li><li> （私たちをTBS緩衝液で5倍 - スライド3をすすぎEは、代替的に10倍）は、DAKO緩衝液に希釈しました。 </li><li> RTでの1時間ブロッキング溶液で希釈したアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（HRP）でスライドをインキュベートします。 </li><li> TBS緩衝液で5倍（あるいは10倍希釈DAKOバッファを使用） - スライド3をすすいでください。 </li></ol> 7.可視化<ol><li> 結合したAP標識二次抗体の可視化 <ol><li> 1リットルのdH 2 O 12.1グラムのトリスを溶解し、0.1M Tris-HCl緩衝液を調製し、HClを用いによってpHを調整します。 1 Mレバミゾール溶液を調製するために同一のTris-HCl緩衝液を使用します。 dH 2 O中で新鮮に4％のNaNO 2溶液を準備</li><li>ファーストブルー（FB）基板（1標準的なガラスキュベットに必要なボリュームが）ガラス管に312.5μlのDMF中の6.25mgのナフトール-AS-MXリン酸を溶解し、予め温め50mlに攪拌の50ミリリットル（37を取得するには°C）のTris-HCl緩衝液。 312.5μlの2 Nに12.5 mgのFB RR塩を溶解するためにHClが以前prepaの312.5μlを添加します赤の4％のNaNO 2溶液と予め温めトリス-HCl緩衝液の同じ50 mlの中に混合物を攪拌します。黄色の液体が透明になるまで軽く振ると、最終的に先に調製した1 Mレバミゾール溶液を77μlを添加します。ろ液を混合して得られたガラスキュベットに入れスライド上に注ぎます。 </li><li> 37℃でのインキュベーションを開始し、約光学顕微鏡下でのプロセスを開発して制御します。すべての15から30分。ファジー回した場合は、新鮮な混合物とFB液を交換してください。 </li><li> PBSバッファに続いてTBSバッファーと転送と5倍 - スライド3を洗い流します。 </li></ol></li><li> 結合したビオチン化二次抗体の可視化 <ol><li> DABは、/ H 2 O 2 49ミリリットルのPBSで1ミリリットルDABストック溶液（1mlのPBSあたり25ミリグラムのDAB）を希釈することにより、現像液を準備します。注ぐ前のセクションに16.5μlのH 2 O 2、ろ液を追加します。 </li><li>眉を沈殿させるに色素原DABの変換n個の顔料は即時にすることができます。 （でも数秒より長いインキュベーションが高いバックグラウンドを上げ、特定の信号をマスクすることができる）、光学顕微鏡下で現像処理を制御します。 </li><li>褐色顔料の沈殿物の強度は、あるいは5 &#39;の2％硫酸銅と、0.9％のNaClからなる溶液中でインキュベートすることによって向上させることができます。 </li><li>スライド3をすすぎ- PBSで5倍、最終的にのdH 2 Oで、代わりに水道水を使用しています。 </li><li>カバーは、水性GelTolマウンティング培地を使用することにより、水から直接スリップしてスライドをマウントします。気泡を作成しないでください。 </li><li> 例えば、O / N、4℃で、封入剤の完全な乾燥を可能にします。ストアは、RT上でスライドを乾燥させました。 </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1。 </td><td> ％エタノール</td><td> 20 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 2。 </td><td> ％エタノール</td><td> 60＆＃39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 3。 </td><td> ％エタノール</td><td> 90 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 4。 </td><td> ％エタノール</td><td> 60 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 5。 </td><td> ％エタノール</td><td> 90 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 6。 </td><td> ％エタノール</td><td> 60 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 7。 </td><td> ％エタノール</td><td> 90 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 8。 </td><td> ％エタノール</td><td> 120 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 9。 </td><td>キシロール</td><td> 30 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 10。 </td><td>キシロール</td><td> 60 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 11。 </td><td>パラフィン</td><td> 60 &#39; </td><td> 60°C </td></tr><tr><td> 12。 </td><td>パラフィン</td><td> 60 &#39; </td><td> 60°C </td></tr><tr><td> 13。 </td><td>パラフィン</td><td> 60 &#39; </td><td> 60°C </td></tr><tr><td> 14。 </td><td>パラフィン</td><td> 120 &#39; </td><td> 60°C </td></tr></tbody></table> 組織-Tek社のVIP真空浸透プロセッサによって 表1 組織処理。

<ol>
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The authors declare no conflict of interest.

標準的なIHC手順は、多くの場合、一般的に豊富な経験だけでなく、「試行錯誤」アプローチを意味し、最適な結果を得るために、具体的な調整を必要とします。組織標本からターゲットの可視化まで、プロトコルのほぼ各ステップを個別に最終的な結果を改善するために修飾を設計するために行ってもよいです。ここで紹介する二重染色プロトコルは、特に神経炎症の影響を受け、ホルマリン固定、パラフィン包埋したラットCNSおよびLN組織切片における私たちの目的の標的タンパク質間の相互関係を評価するための調整ターゲットとIHCベースのタンパク質を例示しています。このように、IHCの技術を学ぶためのチュートリアルとしてだけでなく、より高度な試験のためのインスピレーションの源として使用することができます。しかし、提示され、ここよりも、および/または他の組織中の他のタンパク質を標的とするため、このプロトコルの単なる再生は次善の結果を生成する可能性があることに留意すべきです。 CCL11は、コンジェニックラット系統10のCNSにおけるそれぞれのmRNAレベルのアップレギュレーションを示しに対して&gt; in situハイブリダイゼーションではロックされた核酸（LNA）リボプローブを使用。この知見は、定量PCR分析によって確認しました。さらに、定量PCRは、野生型（WT）株と比較コンジェニック末梢LNにもCCL11のアップレギュレーションを明らかにしました。最後に、ウェスタンブロット（WB）は、疾患保護コンジェニックラット系統10の両方の標的組織におけるCCL11タンパク質の有意な上方制御を示しました。したがって、我々は、標的組織に直接ケモカインの起源を調査することを目的とし、その目的のために、我々は、ここで説明する二重染色プロトコールを開発しました。 死後の解剖と定着後の脱灰中に組織の機械的な損傷を回避することに加えて、組織切片は、かなり挑戦的な表示されることがあります。切片は、通常のスキルと実践が必要です。スライスの品質は多くの側面Sに依存していますUCHは、切断中にサンプルに加えられる圧力を減少させるために組織ブロックとナイフとの間に直角を調整するように、スレッジミクロトームによって産パラフィン包埋組織切片の切削速度、 等厚さは2〜50μmで変化してもよいです。パラフィン組織切片を要求染色手順の間のより良好な保持を確実にするために、好ましくは、商業的に、例えばポリ-L-リジンまたはアミノプロピルトリエトキシシラン（APTS）のように接着剤でコーティングされたガラススライド上に温水浴から搭載されて切断されます。クライオミクロトームを用いて-20℃で約切断し、染色前に室温で乾燥された組織切片をクライオとは対照的に、パラフィンブロックを冷却し、室温でスライスし、続いて脱パラフィン前に50〜60℃で乾燥させます。 高度に保存された組織のアーキテクチャ、細胞形態及び標的エピトープは、標的タンパク質の局在と相関を評価するために不可欠です。最適な組織PRESERを達成するために、vationは、サンプルは、凝固または架橋固定剤のいずれかを使用して、適切に固定されなければなりません。エタノールのような固定剤を、凝固、より頻繁に凍結保存のために使用されます。エタノールを使用して、タンパク質の変性は、組織の脱水9を介して達成されます。不十分な細胞の保存16をもたらし得ます。固定液を凝固とは対照的に、ホルムアルデヒドは、最も頻繁にルーチン組織学およびIHC 9で使用されている架橋固定剤であります 冷凍のパラフィン両方の組織保存のため。私たちは前に脱灰とその後のパラフィン包埋し、4℃で24時間、ホルムアルデヒド溶液に浸漬することによって、ラットCNSおよびLNのための最適な固定を達成しています。巨大分子のコンホメーションに大きな変化を引き起こすにもかかわらず、この半可逆共有結合試薬はQUAL高提供（ホルムアルデヒド、すなわち、タンパク質を架橋し、それによって抗体の特異的結合を防止することができる抗原をマスクするメチレン架橋を形成します）性の組織保存。注目すべきことに、架橋試薬と固定の温度および時間は、セクショニング、エピトープの検出、さらには交差反応としてIHCのいくつかの側面に影響を与えることができます。したがって、両方の固定アンダーとオーバーの固定ホルムアルデヒド等のアルデヒドベースの試薬を使用すると、それぞれ、主に自己分解または過度のクロスリンク17に起因するアーティファクトを引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、疎水性タンパク質にoverfixationによって観察された結合による非特異的バックグラウンド染色は、ポリクローナルまたはABS樹脂18を使用する場合、希釈緩衝液のpHを上昇させることによって非イオン性界面活性剤を含有する低塩漬け緩衝液を使用して低減することができます。しかしながら、イオン性及び静電気的タンパク質相互作用に起因する非特異的バックグラウンド染色（ノイズ）同時に18を結合する疎水性タンパク質に起因するノイズを悪化させることができる高イオン強度、希釈剤緩衝液を用いて還元することができます。それは標的エピトープの検出になる、ホルムアルデヒドI完全に、抗原回復19で反転されていないが、タンパク質の三次構造のnduced変化は、することができます：種々のpH値（熱誘導エピトープ回復（HIER）との緩衝液中で加熱することによりⅰ）、ⅱ）酵素分解によって（プロテアーゼによって誘発されます濃ギ酸23で処理することにより強アルカリまたは酸溶液、またはスクロース21、22またはIIII）でのインキュベーションにより）、ⅲ）;エピトープ回復（20 PIER）。 HIERは、標的エピトープ19の大多数のための便利な表示されます。加熱時間の他に、例えば、EDTA（pHを5.5、8.5または9.0）またはクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0- 6.2）などの溶液のpH値は、HIERの結果のために不可欠であり得ます。特に、我々の研究の中で最も満足のいく結果は、pH値8.5とEDTA溶液中で1時間サンプルを蒸しすることによって達成されました。 抗体は優先的にその特異的エピトープ、非特異的に魅力に特異的に結合するが、同族のAgと同様に結合しますサイトは、完全に排除することはできません。注目すべきは、おそらくバックグラウンド染色を減少させるための最も効率的な方法は、従来の一次Absの9のアプリケーションに（そのような私たちの研究で用いたFCSなど）のタンパク質をブロックでのインキュベーションです。モノクローナル一次Abは、とにかく、より高い特異性ポリクローナル腹筋よりも優先することにより、非特異的バックグラウンドシグナルを減少させています。モノクローナルAbは、一般的にいくつかの他の（非特異的）タンパク質24の一部であってもよいアミノ酸の数が少ない、からなるエピトープに対して向けられているようにもかかわらず、交差反応性は、まだ、表示される場合があります。モノクローナル抗体とは異なり、ポリクローナルAbは、標的タンパク質の複数のアイソフォームを認識し、より高いチャンスがあります。 ⅰ）ポリクローナルヤギで育っおよびii）モノクローナルがマウスで育った：私たちは、最初にCCL11を検出するために、2つの異なる主要な腹筋を使用していました。私たちの手では、両製品は、ターゲット・ケモカインのための同じ染色パターンを示しました。同時共染色を行うために、我々は、ヤギ抗ラットCCL1を使用しましたすべてのマウスで生産されたそれぞれ伊庭-1、ED1およびCD8に対する抗体、との組み合わせで1抗体。同じ種で産生さ主要Abの同時標識化のために必要なそれにもかかわらず、同時に他に、二重免疫染色はまた、25を順次行うことができます。 我々の研究で使用されるAbの最適な作業用濃度は、特定の信号の強度とバックグラウンドノイズとの間の最適な比率として試験希釈系列によって推定しました。しかし、それは同じ抗体の最適な作用濃度は時々臓器、種、背景病理など注目すべきは、透過性がパラフィン包埋で行われる当社の染色方法において必要とされなかったの間で変化し得ることに留意すべきである、3-5ミクロン厚い組織切片は、しかしながら、トリトンX-100のような界面活性剤は、依然として、表面張力を低減し、従って、抗原と抗体との結合を促進するために使用されてきた可能性があります。オン（IF）逆に、凍結セクションおよびIHC /新鮮な（太い、ビブラトームカット）でIF免疫蛍光のために、抗体の浸透の改善は、一般的に培養した細胞または細胞懸濁液（免疫細胞化学（ICC））にタンパク質検出のために必要とされる媒介permeabilization-自由組織切片をフローティング。 複数のコントロールは、特定/信頼性の免疫標的を生成するための、本質的に重要です。ポジティブコントロールとして、我々はCCL11 +好酸球を検出することができる喘息のラットモデルから肺を使用しました。陰性対照は、一次Abの非存在下でのみ、ブロッキング溶液O中/ N 4℃でインキュベートしました。 我々はすでにバックグラウンドシグナルを減少させるためにいくつかの原因と潜在的な救済を記載しています。非特異的免疫染色製品は、DABと赤血球および骨髄細胞26のペルオキシダーゼのプソイドとの間の反応として生じ得ます。これらの酵素の活性、単にノイズコーなど内因性ビオチンによってエドまたはAPは、すでにホルマリン固定の間に減少しています。しかし、メタノール/ H 2 O 2での前処理は、その更なる又は完全な不活性化27、28のために必要である。哺乳動物の組織中のAP活性に起因するバックグラウンド染色は、さらにレバミゾール29によって、または酢酸29によって阻害され得ます。アビジンと反対に荷電した細胞分子30との間のイオン引力の結果として非特異的結合は、31 avidiniiストレプトミセスからのストレプトアビジンと卵白からアビジンを代入することによって回避することができます。 DABは、おそらくIHCの中で最も頻繁に使用される色素原です。 DAB（褐色の反応生成物）に加えて、使用中の他のペルオキシダーゼ色原体は、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC;赤色）であり、4-クロル-1-ナフトール（CN、青）及びテトラメチルベンジジン（TMB;青）。一般的に選択されたAPの色原体は、FB、ファーストレッド（FR）、新たなフクシンおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル/ニトロBLありますUE塩化テトラゾリウム（BCIP / NBT）。酵素及び色素原の選択は、基本的に個々の好みの問題であるが、しかしながら、そのような局在、発現パターンとして対象地物によってだけでなく、内因性の色素（メラニン、ヘモジデリン）32の存在によって操縦されてもよいです。対比染色は通常ヘマトキシリン、核ファストレッドまたはメチルグリーン18を使用して行わIHC手順の最後、通性のステップです。一般的に、より適した単一標識のため、対比は、組織形態の解釈を容易にし、微妙に色素原の沈殿物との干渉を回避するために開発されるべきです。 染色手順の組織切片の完了時に慎重にマウンティング培地を使用してカバースリップでマウントする必要があります。気泡の発生は避けるべきです。物理的な保護のほかに、メディアをマウントすると、イメージングの可視化と品質が向上します。いずれかの有機/疎水性または水性/親水性、CH封入剤のOICEは、有機溶媒中で、最終生成物の溶解度に依存します。封入剤ベースのトルエンが適切であろうが、 例えば、DABのために、水性封入剤は、蛍光標識を含むすべての酵素の色素原に適用することができます。

高度なハイスループットの使用にもかかわらずmethylome、トランスクリプトームまたはプロテオームさえレベルで実行解析、免疫染色は、組織試料、細胞培養物又は細胞塗抹標本に直接タンパク質検出のための黄金の標準のままです。局在/分布パターンを明らかにすることによって、免疫組織化学（IHC）は、相対比と標的タンパク質の地形的相互関係を評価し、さらにそれらの生物学的活性を示すことができます。したがって、IHCは広く、診断、治療の評価のために、 例えば 、臨床研究のためなど病気のメカニズム、動物モデルにおける機能と表現型の変化の研究を利用しています基本的に組織学、病理学、生化学および免疫を備え、IHCが大幅に蛍光標識した抗体は感染組織1に肺炎球菌抗原を同定するために初めて使用された1941年以来進めてきました。 VIHCによる細胞製品およびコンポーネントのisualizationは、その特定の抗原（Ag）からに対する抗体（ABS）の結合に基づいています。フルオロフォアタグ付けされた抗体を使用するほかに、免疫反応はまた、ペルオキシダーゼ2,3またはアルカリホスファターゼ4のような酵素を使用して可視化することができます。放射性標識は、オートラジオグラフィーによって可視化しながら、さらに、金コロイドタグ抗体5は 、光と電子顕微鏡の両方により特異的な抗原-抗体相互作用を検出するために使用されます。 Agを抗体の免疫反応は、直接的および間接的な方法によって検出することができます。それは直接標識一次Absの6を使用していますように直接的な方法は、より速く、より簡単な本質的です。しかし、感度の大幅な不足のためには、間接的な方法は、直接のものに好適です。二段階の間接検出手順は、最初のように、非標識一次腹筋を必要とし、第二層7として、主要な腹筋に対して向けられた二腹筋標識。信号増幅は、さらに二次抗体に結合する酵素 - 結合された第三抗体（三段間接法）を含むことによって達成することができます。一般的に使用される間接的な検出方法は、アビジン - ビオチンペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（PAP）です。あるいは、アルカリホスファターゼantialkalineホスファターゼ（APAAP）複合体ではなく、PAP法を用いることができます。特に、アルカリホスファターゼ（AP）メソッドは、免疫ペルオキシダーゼ法4よりもさらに敏感であるように思われます。アビジン - ビオチン複合体（ABC）法は、標識アビジン - ビオチン複合体（LAB）のいずれかとの組み合わせで、ビオチン化二次抗体を使用し、またはストレプトアビジン - ビオチン複合体（SLAB）標識しました。検出感度はさらにペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ8で標識したアビジンを含むことによって増大させることができます。使用中の他の検出方法は、ポリマー標識、チラミン増幅および免疫ローリングサークル9です。特に、別の検出方法は、同じ組織内の複数のAgの検出のために組み合わせることができここに提示1978年4。同時二重免疫染色で初めて報告されたサンプルは、それぞれ、ペルオキシダーゼ結合し、AP結合二次抗体を用いて、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN組織切片で行いました。信号は、それぞれ、3,3&#39;- diaminobencidine（DAB）色素原とファーストブルー（FB）APAAP複合体を用いて可視化しました。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane 			(Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl 			ether) 
 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan 			(C3H2ClF5O)</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>1001936060</td>
 <td>Eye 			irradiation. Probably influences fertility and damages baby in 			uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing 			environment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodiumchloride 			(NaCl)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.0604</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate 			Buffer Saline (PBS), tablet</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde 			(OH(CH2O)nH (n = 8 - 100), 4% in 1x PBS </td>
 <td>Apl pharma</td>
 <td>34 24 28</td>
 <td>Health 			hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 			&ge;99.5%, absolute (CH3CH2OH)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>459844-1L</td>
 <td>Flamable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene 			(Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>534056</td>
 <td>Flamable. 			Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Histo-Comp 			Paraffin 			Wax</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>V0-5-1001 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive 			Microscope Slides</td>
 <td>Starfrost </td>
 <td>MIC-1040-W</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylol 			substitute XEM-200 </td>
 <td>Vogel GmbH</td>
 <td>ND-HS-200</td>
 <td>Respiratory 			sensitization. Carcinogenicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- CD8 			(Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>AbD 			Serotec</td>
 <td>MCA48G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- Iba1 			(AIF1) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>MABN92</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- CD68 			(ED1) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>AbD 			Serotec </td>
 <td>MCA341R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- 			eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody</td>
 <td>Santa Cruz 			BT</td>
 <td>SC-6181</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alkaline 			phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody</td>
 <td>Dakopatts, 			Denmark</td>
 <td>D0314</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotinylated 			secondary antibody</td>
 <td>Amersham 			Biotech</td>
 <td>RPN1025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avidin- 			horseradish peroxidase complex (HRP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Naphthol 			AS-MX phosphate (C19H18NO5P)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N4875-1G</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast Blue 			RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 			x 			1/2 ZnCl2)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>FBS25</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisol 			hydrochloride (C11H13ClN2S)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31742</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3,3'-Diaminobenzidine 			tetrahydrochloride (DAB Chromogen)</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>S3000 </td>
 <td>Highly 			flammable. Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 			sulphate (CuSO4)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.02791</td>
 <td>Acute 			toxicity. Environmental hazzard.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GelTol 			Aqueous Mounting Medium</td>
 <td>Thermo 			Electron Corporation</td>
 <td>230100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen 			peroxide, 30% (H2O2)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>107210</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol 			(CH3OH)</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>65543</td>
 <td>Acute 			toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris 			(hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 			)</td>
 <td>AppliChem </td>
 <td>A1379</td>
 <td>Skin and 			eye irritation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris 			Buffered Saline (TBS), tablet</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T5030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Di- Sodium 			hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 			x 			2H2O)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.0658</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium 			dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 			x 			1H2O) </td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.06346</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf 			serum (FCS) </td>
 <td>Cambrex 			BioScience</td>
 <td>DE-14-802F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAKO 			cytomation wash buffer 10x </td>
 <td>DAKO </td>
 <td>S3006</td>
 <td>Should be 			stored at 2-8 &deg;C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N- 			Dimethylformamide; DMF (C3H7NO)</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>40250</td>
 <td>Flammable. 			Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glas 			coverslips 24 x 36 mm </td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 <td>BB024036A1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric acid, conc. (HCl)</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>30721</td>
 <td>Corrosive, 			irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric acid solution 			volumetric, 2M HCl (2N) </td>
 <td>Fluka </td>
 <td>71826</td>
 <td>Corrosive, 			irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium 			nitrite, ReagentPlus, &ge;99.0% (NaNO2)</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S2252 </td>
 <td>Oxidant. 			Toxic. Dangerous for the environment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenedinitrilotetraacetic 			acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 			x 2H2O)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.08454</td>
 <td>Oral 			exposures may cause reproductive and developmental effects.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 			V.I.P 			Vacuum Infiltration Processor </td>
 <td>Sakura</td>
 <td>5902 VIP 			Jr. 115 V, 60 Hz</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hacker-Bright 			8000 Series Base Sledge Microtome </td>
 <td>Hacker 			instruments</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Household 			food steamer </td>
 <td>Braun</td>
 <td>MultiGourmet 			FS 20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Light 			microscope </td>
 <td>Leica 			Polyvar 2</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

immunohistochemical analysis in the rat central nervous system and peripheral lymph node tissue sections

免疫組織化学（IHC）は、高度に、特定の信頼性と魅力的なタンパク質の可視化を提供します。 IHCベースの多色標識の正しい性能および解釈は、中枢神経系（CNS）のような高脂肪含有量を有​​する組織中の標的タンパク質との間の相互関係を評価するために利用される場合は特に、困難です。 我々のプロトコルは、特にラットCNSおよび神経炎症によって影響末梢リンパ節（LN）の両方の構造および可溶性タンパク質の検出のために調整し、標準的な免疫標識技術の改良を表します。それにもかかわらず、さらなる改変の有無にかかわらず、我々のプロトコルはそうであってもここで紹介する以外の臓器や種で、他の関連するタンパク質標的の検出のために使用することができます。

二重免疫染色（共染色）は、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN切片で行いました。 3-5ミクロン厚の組織切片は、スレッジミクロトームを用いて切断し、プレコーティングされた接着剤のガラススライド上にマウントされ、その後、以前10,11,12に記載のように処理しました。簡潔には、組織の再水和および内因性のペルオキシダーゼの不活性化を脱パラフィン後、切片を、非特異的結合部位を除去するブロッキング工程に続いて、抗原回復処理を行いました。 ⅱ）CCL11 / ED1及びiii）CCL11 / CD8、ⅰ）CCL11 /伊庭-1：同時染色は、以下の組み合わせで行いました。各同時染色のために使用される主要なABSが彼らの同時インキュベーションを有効にして2つの異なる種（それぞれ、ヤギ、マウス、）、で育ちました。イバ-1、ED1およびCD8ながらCCL11は、褐色のペルオキシダーゼ反応生成物によって可視化した、青AP信号により可視化しました。 10様多発性硬化症（MS）におけるCCL11ケモカインの役割についての我々の最近の研究では、より大きな文脈に記載されています。 IHCによると、ラットCNSで分析を行った、CCL11はpericarya、樹状突起および脊髄灰白質（ 図1AおよびB）の腹側角に位置する神経細胞の軸索に存在しました。また、単一CCL11 +形質細胞は、同じ組織切片（ 図1A）で検出可能な、ならびに単一CCL11 + / ED1 +マクロファージと炎症部位（データは示さずに観察された脳常駐ミクログリアた。ED1は、リソソームタンパク質のマーカーであります活性化マクロファージおよびミクログリア13）インチ特に、CCL11ケモカインは、伊庭-1 +マクロファージおよび脳常駐ミクログリア（1Aとの共局在化する見つかりませんでした。伊庭-1は、イオン化カルシウムを検出するためのマーカーである2+ -bindi<html> ngのタンパク質14）。 周辺ラットLNで行わ標的とIHCベースのタンパク質は、ED1（ 図2B）とCCL11タンパク質共局在を示しました。しかし、CCL11分泌CD8 + Tリンパ球は、（ 図2A; CD8 +細胞を、抗CD8α、MHCクラスに結合する主細胞傷害性T細胞のマーカーIは、15分子を用いて検出した）同一の組織切片において検出されませんでした。プロトコールに記載のようにブロッキング溶液中でO / Nインキュベーションの間に一次のAbを省略した以外は、制御部は、処理しました。標的タンパク質のない検出信号（ 図1A、B及び2Aに示されるように、B）は、CNSおよびLN制御部（それぞれ図1Cおよび2C）において観察されませんでした。 S / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg &quot;/&gt; 図1. A、B：ラットLNにおける二重免疫染色。 α-CD8（A）またはED1（B）のいずれかと組み合わせて、CCL11ケモカインに対して向けられた一次抗体。 。CCL11検出信号（茶色）マクロファージにおけるリソソームタンパク質のマーカー（ED1、青）で共局在化：同一セル内には共局在は、CCL11 +（茶色）およびCD8 +細胞（青）Bのために認められませんでした。 C：ネガティブコントロール;末梢LNで標識されていない常在細胞を示す詳細は<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50425/50425fig2.jpg" /> 図2. A、B：ラットSでの二重免疫染色pinalコード。 。神経pericarya、樹状突起と軸索にCCL11を示す灰白質の前角（ブラウン）伊庭-1 +（;青）のいずれかで共染色またはED1 +（B;青）、マクロファージ/ミクログリア細胞C：ネガティブコントロール;脊髄灰白質の前角で標識されていない常在細胞を示す詳細は<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K ビュー.  Karolinska Institutet. We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

ビデオ: Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

神経科学

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...