Die Autoren bedanken sich Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder unseres Labors, die diese Techniken entwickeln geholfen. Teilfinanzierung durch einen Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538) DE zur Verfügung gestellt.

1. Zebrafisch Haltung, Embryo-Generation, und Behandlung <ol><li> Führen Sie die folgenden Protokolle Zebrafisch unter der Leitung von einem institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss (IACUC) und innerhalb der Tierpflege Richtlinien der NIH oder anderen Regulierungsbehörden / Richtlinien. </li><li> Zebrafisch-Stämme, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren in bestimmten Geweben, Zellen oder Organe sind von der Zebrafisch International Resource Center (ZIRC). Zum Beispiel, Tg (kdr: EGPF) S843 EGFP in vaskulären Endothelzellen 6, die verwendet werden können, um eine vollständige 3D-Gefäßstrukturen zu erzeugen, wie in diesem Protokoll gezeigt auszudrücken. Andere Linien transgener Zebrafische sind von ZIRC. </li><li> Haus erwachsenen Zebrafisch in einem geeigneten Aquakultursystem, pH-Wert, Salzgehalt, Temperatur, Sauerstoff, Licht und anderen Umweltfaktoren 7 überwacht. Das hier gezeigte Zebrafisch wurden in einem Aquaneering Inc. System (San Diego, CA) bei 28,5 ° C mit einer 14 Stunden lig untergebrachtht/10 Stunden Dunkel-Zyklus. Feed-erwachsenen Zebrafisch eine ausgewogene Ernährung der Artemia und NRD 06.04 Fischfutter (Artemia-Direct, Ogden, Utah). </li><li> Erwachsene männliche und weibliche Zebrafisch-Zucht Alter sollten separat untergebracht werden Paarung erfolgreich zu erhöhen. </li><li> Stimulieren Eiablage und Befruchtung, indem Weibchen (2-4) und Männchen (4-6) zusammen in einer passenden Container, der eine Gitterboden mit Löchern groß genug für die Eier durchfallen hat, aber zu klein für die Zebrafisch Erwachsene weitergeben . Bis Paarungen am Abend vor Set; Eier werden in der Nähe der Dämmerung gelegt, in der Regel während der Tageslichtzyklus in der Intensität (Morgendämmerung) steigt langsam. Check für Eier an der Unterseite des Gegen Behälter alle 15-30 Minuten. </li><li> Sammeln Sie Eier mit einem Mesh-Sieb und sauber mit E3-Puffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4). Übertragen Sie die Eier zu 100 mm Kulturplatten mit E3 Pufferspeicher gefüllt und in einem 28 ° C-Inkubator. </li><li> Um Chemikalien, die cer ändern studierenebrovascular Verzweigung hinzufügen gewünschten chemischen Konzentrationen. Zum Beispiel kann neovasular Verzweigung mit γ-Sekretase-Inhibitor (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester) in DMSO solubilisiert 4, beginnend 24 induziert werden, Stunden nach der Befruchtung (hpf). Zu dieser Zeit-Punkt-Embryonen sind immer noch in dem Chorion, und viele Chemikalien können durch sie 8 weiterzugeben. Wenn ein Behandlungszustand hat Nerven-oder Motor-Effekte, die die Fähigkeit von Embryonen zu befreien von dem Chorion beeinträchtigen können, dann Embryonen sollte zwischen 24 und 48 hpf, die entweder mit einer Pinzette Pronase 2 getan werden kann, de-chorionated werden. Die Embryonen in den bereitgestellten Bilder gezeigt wurden von griff vorsichtig das Chorion mit zwei geschärften Pinzette und es zu zerreißen offenen dechorionated. </li><li> Falls erforderlich / wünschenswert, Pigmentbildung kann durch Zugabe von 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) an die E3-Puffer bei 24 hpf gehemmt werden. </li></ol> 2. Konfokale Bildgebung von zerebrovaskulären Structnahmen in Festzebrafischembryonen <ol><li> Sacrifice Embryonen in 250 mg / L Tricainmethansulfonat, und befestigen Sie sie durch Eintauchen in 2-4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C Behälter mit fluoreszierenden Embryonen in Folie eingewickelt werden. Einmal festgelegt, sind Embryonen in PBS bei 4 ° C gelagert werden, bis abgebildet - EGFP-Fluoreszenzintensität wird weniger aufgelöst nach etwa einer Woche, aber die Morphologie (wie im Hellfeld aus gesehen) ist viel länger erhalten. </li><li> Bereiten Sie den Embryo, indem zuerst ein Auge mit einem geschärften Wolfram Nadelbefestigung. Um den Anschluss des Augengewebes ersten Cut schneiden Sie dann die Muskeln, geschnitten und schließlich den Sehnerv das Auge zu verdrängen. (Hinweis: Wenn die Abbildung beide Seiten gewünscht, beide Augen entfernen.) </li><li> Sobald das Auge entfernt wird, montieren Sie den Embryo auf einem Deckglas mit einem Rückgang von 3% Methylcellulose. Ausrichten der Embryo, so dass die Seite mit dem Auge entfernt wird, mit Blick auf das Deckglas und ist so nah an die Glas wie möglich. Decken den gesamten Embryo mit methylcellulose, um ein Austrocknen zu verhindern, während der Bildgebung. </li><li> Bild der montierte Embryo sofort mit einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem hochwertigen Plan Apo 20x Objektiv (numerische Apertur = 0,75 oder besser) ausgestattet. Diese Konfiguration ist bevorzugt, ein nicht-invertiertes Mikroskop, das Anordnen der Embryo zwischen zwei Glasflächen, und Pressen des Embryos vor dem oberen Glas erfordern würde. </li><li> Sammeln optische Schnitte in Schritten von 1 um mit einem mittleren oder großen Blendeneinstellung. Größeren Schritten von 2,5 &amp;mgr; m können ebenfalls verwendet werden, aber es kann schwieriger sein, um die räumliche Ordnung der kleineren Objekte zu bestimmen. Kleine Öffnungen erzeugen schärfere Detail, aber die längeren Scans erforderlich ist, kann EGFP bleichen und auch die Tiefe der Bildgebung in den Embryo, die erreicht werden kann, zu begrenzen. Konfokales Mikroskop ermöglicht Abbildungs ​​etwa auf halbem Weg durch einen Embryo. </li><li> Wenn Bildgebung des gesamten Fisch gewünscht ist, entfernen Sie beide Augen von Anfang an (siehe Hinweis in Schritt 3.2), drehen Sie den Embryo nach imaging der einen Seite und wiederholen Sie die Schritte von 2,3 bis 2,5 für die Gegenseite. </li></ol> 3. 3D-Rekonstruktion der embryonalen Zebrafisch Cerebrovasculature <ol><li> Verwenden Sie den Fidschi-Verteilung 3 von Open-Source-ImageJ (http://fiji.sc), die für die 3D-Renderings optimiert ist kostenlos und mit PC-, Mac-und Linux-Computern kompatibel. </li><li> Import konfokalen Stapeln nach Fidschi, indem Sie auf Plugins&gt; LOCI&gt; BioFormats Importeur 9 wählen Sie dann die konfokale Datei, zB name.ids für Nikon Stapel (2A). Wählen Sie Ansicht Stack mit Hyperstack, Farbmodus: Graustufen, automatische Skalierung überprüfen, überprüfen aufgeteilt Kanäle. </li><li> Diese Auswahl wird vier separaten Kanal-Panels zu öffnen; für EGFP nur einer benötigt werden, in der Regel die dritte nach unten. Schließen Sie die anderen drei Platten (rot, blau und alpha) so dass die 16-Bit-Bild mit einem langen Namen, gefolgt von C = 1 (Abbildung 2A). </li><li> Stellen Schwelle durch Scannen wenn das Bild mit der Bildlauf tab entlang der Unterseite, eine Scheibe, die die Region oder die Struktur von Interesse ist zu finden, dann gehen dem Bild&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert (Abbildung 2C). </li><li> In dem Panel, das kommt, schieben Sie die obere Leiste (Schwarzwert) nach links, so dass die Struktur kann sehr gut über Hintergrund gesehen werden, und lassen den Boden Schieber (Weißwert), wo es ist (Abbildung 2D). Wählen Sie B &amp; W, wählen Dunkler Hintergrund. Sie berechnen Threshold für jedes Bild wählen nicht, es sei denn andere Einstellungen erforderlich sind für jede Scheibe, wählen Schwarz Hintergrund. Dieser Prozess schafft eine neue 8-Bit-Bild. </li><li> WARNUNG: Threshold kann nicht rückgängig gemacht werden oder in ImageJ gespeichert, so dass die konfokale Stapel müssen jedes Mal eine Veränderung notwendig ist neu geladen werden. Notieren Sie sich die Nummern und probieren Sie verschiedene Einstellungen, bis das gewünschte Ergebnis erreicht ist. </li><li> Zum Plugins&gt; 3D Viewer&gt; Schwellwert 0, Resampling Faktor 1 (am besten) oder 2 (gut), deaktivieren Sie die roten und blauen Farbfelder, um eine grüne 3D-Ausgabe zu machen - sonst ist es will produzieren einen weißen Rendering - wählen Sie Apply (nicht Auto) (2E). </li><li> Drehen, drehen und zoomen Sie das 3D-Bild mit der Maus und Tastatursteuerung (2F). </li><li> Speichern von Standbildern an jedem Punkt mit der Option Capture im Menü. Die Größe des Bildfeld auf dem Bildschirm schreibt Pixelmaße des Bildes erzeugt, so, wenn ein Bild mit hoher Auflösung gewünscht Make die Box größer durch die untere rechte Ecke ziehen. </li><li> Erstellen Sie ein 3D-Film Spinn über Ansicht&gt; Aufnahme 360 Grad Drehung (2G). Rotation standardmäßig auf 2 Grad pro Schritt, aber es kann bis 5 Grad zum Beispiel, die viel kleinere Dateigrößen erstellen wird geändert, kann aber Ruckeln, um die Animation hinzuzufügen. </li><li> Speichern Sie die Datei in einem von mehreren verfügbaren Formate für die spätere Betrachtung mit Media Player, das Hochladen auf das Internet oder die Verwendung in Powerpoint-Präsentationen. Die Open-Source-Media-Player, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), ist kostenfrei und verarbeitet diese Videos sehr gut. </li></ol>

<ol>
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J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine Grundlage für die visuelle Untersuchungen des Gefäßsystems bei der Entwicklung von Zebrafisch. Lebende Exemplare können verwendet werden, um physiologische Parameter, wie die Herzfrequenz und die Herzschlagvolumen zu beurteilen, während feste Proben für hochauflösende konfokale Bildgebung. Drosophila und C eingesetzt werden elegans ermöglichen Ganzkörper-Bildgebung, aber Zebrafisch sind Wirbeltiere und ein nützliches Modell für Wirbeltiergewebe, einschließlich einer Endothelzellen ausgekleidet Gefäßsystem. Diese Studien können erhebliche transgenen Linien und genomische Ressourcen aus dem Zebrafisch-Forschung zu integrieren. 3D-Rekonstruktion und Wiedergabe von konfokalen Bildern aus embryonalen Zebrafisch, wie hier beschrieben, ermöglichen einen systembiologischen Ansatz, um Gefäßverzweigung und Blutgefäßdichte, die nicht mit größeren Tiermodellen, wie Ratten und Mäusen ist möglich. Ferner ist, wie Zebrafisch Amnioten entwickeln in einer modifizierbaren Umwelt (E3-Puffer), wo man leicht hinzufügen chemicals, die bestimmte Enzyme oder andere Prozesse, die Gefäßentwicklung beeinflussen zu hemmen. Die Konzentration und der Zeitpunkt der Lieferung kann chemisch verändert werden, so dass die Forscher die Feinabstimmung Behandlungsbedingungen. 1. Änderungen und Fehlersuche Modifikationen dieses Systems können transgene Linien, die EGFP Zebrafisch oder andere fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, in einer Vielzahl von Gewebe, Organ oder einer Region spezifische Muster 10 zu integrieren. Ferner Analyse der neovaskulären Änderungen im Zebrafisch Retina wurde kürzlich veröffentlicht 5. Probleme mit Pigmentierung bei älteren Embryonen und erwachsenen Zebrafisch kann durch Kreuzung mit transgenen Linien, die Skala Pigmente oder Netzhautpigment produzieren nicht kompensiert werden. Probleme mit verminderter Fluoreszenz typischerweise vor unangemessenen Bedingungen Fixierung führen. Paraformaldehyd (4%) für 1 Tag ist optimal, aber stärker Fixiermittel, wie Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid oder Alkohol,zerstören EGFP Fluoreszenz. Nach der Fixierung sollte Embryonen in PBS bei 4 ° C aufbewahrt werden und immer vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt. 2. Einschränkungen dieser Technik Die Qualität und Auflösung der 3D-Renderings mit diesem Protokoll erzeugt, hängt von der Qualität der Bilder erzeugt. Lichtdurchlässigkeit durch diese Embryonen zu der Mitte Sagittalebene mit einem Standard-Konfokalmikroskop beschränkt. Dieser Aspekt der Bild begrenzt die Tiefe der Bildgebung bei älteren Embryonen und Erwachsene, aber mehr erweiterte Multi-Photonen-Mikroskopie-Systeme ermöglichen für die Bildgebung in größeren Tiefen. 3. Bedeutung in Bezug auf bestehenden Methoden Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die Analyse von Blutgefäßnetze auf Systemebene, die eine ganze Tier integrieren können. Frühere Darstellungen solcher Daten oft angeführte Reihe von Bildern zusammen gelegt, aber 3D-Rendering bietet eine bessere Auflösung der räumlichen Beziehungenhungen beteiligt. 4. Zukünftige Anwendungen Neue Entwicklungen in der Bildgebung und Gewebeverarbeitung bieten viele neue Anwendungen für diese Methoden, die zählen können machen älteren Embryonen oder Erwachsene transparent 14.11. Verbesserte Transparenz Gewebepenetration deutlich erhöhen durch konfokale und Multiphotonen-Laser. Ferner ist, wie die Geschwindigkeit der Kameras und Photomultiplier-Röhren zu erhöhen kann es bald möglich sein wird, um 3D-Renderings von Fischen in Echtzeit zu erzeugen, die eine 4. Dimension Analyse. 5. Kritische Schritte Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll ist die Vorbereitung für die Bildgebung, die die ordnungsgemäße Fixierung beinhaltet. Imaging sollte nach der Fixierung mit hohen Qualitätszielen, die die besten numerischen Aperturen zur Verfügung haben so schnell wie möglich durchgeführt werden. Auflösung ist abhängig von der Abbildungssystem verwendet werden, sind so hoch, Qualitätssysteme in der Regel besser. Generieren von 3D-Renderings ist speicherintensivfür so neuere, High-End-Computer mit einer großen Menge an Speicher und gute Grafik-Prozessoren empfohlen. Die hier beschriebene optische System ist für die Biologie transgenen Zebrafisch, das EGFP in vaskulären Endothelzellen exprimieren optimiert, wenn diese Verfahren auf die GFP-transgenen Embryos oder andere fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, in Populationen von Neuronen, Muskeln, Drüsen oder einer beliebigen Anzahl von anpassen anderen Zellen. Der große Vorteil bei der Arbeit mit diesem System ist die Möglichkeit, zu jeder Zeit während dieser Entwicklungsphase zu studieren, was in der gesamten Embryo, in fest-und / oder lebenden Tieren.

Zebrafisch bieten ein leistungsfähiges System zur Entwicklungsbiologie zu studieren, und die relative Transparenz ihrer Embryonen zugänglich ist Imaging-basierte Studien ein. Der Zebrafisch ist nun als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren seit Jahrzehnten eingesetzt. Knochenfischen, einschließlich Zebrafisch, eine vereinfachte Wirbelkreislauf-System, die keine angemessenen Homolog in Wirbellosen hat. Blut wird aus der vorderen Kammer eines Zwei-Kammer-Herz durch Kiemen, wo es mit Sauerstoff angereichert wird, gepumpt. Blut von den Kiemen konvergiert an der dorsalen Aorta und durch Arterien, Zweig in immer kleinere Schiffe erreicht schließlich Kapillaren in Organgeweben. Innerhalb Kapillaren Sauerstoff freigesetzt und Kohlendioxid absorbiert. Auf der venösen Seite des Blut Kapillaren fließt in immer größeren Venen und wird schließlich in die hintere Kammer des Herzens, wobei der Zyklus wiederholt gezogen. Ein erwachsener Zebrafisch kann 200 oder mehr Eier auf einmal legen und ONCE befruchtet, entwickeln sie schnell zwei. Innerhalb eines Tages die Körperachse ist gut entwickelt, einschließlich der Muskeln, die Vertrags-und um den Embryo innerhalb der Chorion-Membran zu bewegen. Von 2-7 Tage nach der Befruchtung (DPF) die meisten Körpersysteme zu entwickeln, einschließlich der Augen und des Zentralnervensystems, die koordinieren können schwimmen in Richtung Essen oder weg von hellem Licht. Bis zu 7 dpf Embryonen sind klein genug, um für die Visualisierung mit der Mikroskopie zu ermöglichen. Transgene Linien, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, können mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie oder abgebildet werden. Die konfokale Bildgebung kann mit Open-Source-Software 3 bis 3D-Renderings von kompletten Gefäßstrukturen in Zebrafischembryonen, die einen systembiologischen Perspektive der Gefäßentwicklung bieten erstellen gepaart werden. Mit Veränderungen in der Gefäß-und zerebrovaskuläre Komplexität betreffenden Studien werden von diesem Protokoll profitieren, da sie ermöglicht eine Analyse der Systemebene Gefäßnetze 4,5. Eine Zusammenstellung von Methoden und Ressourcen zur Verfügung stellend für die einfache Annahme und dieser Techniken für Studien, die Abbildung von Gefäßstrukturen in embryonalen Zebrafisch erfordern können. Die Kosteneffizienz der Zebrafisch als Tiermodell ist mit Schwellen Imaging-Technologien kombinieren, um neue Plattformen, mit dem angiogenen Effekte der molekularen Signalwege in der Wirbeltierentwicklung und Homöostase beurteilen zu können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Zebrafische sind ein mächtiges Werkzeug, um die Entwicklungsbiologie und Pathologie in vivo zu untersuchen. Die geringe Größe und die relative Transparenz der Zebrafisch-Embryonen machen sie besonders geeignet für die visuelle Untersuchung der Prozesse, wie Herz-und Gefäßentwicklung. In mehreren aktuellen Studien wurden transgene Zebrafisch, die EGFP in vaskulären Endothelzellen exprimieren zur Abbildung und Analyse komplexer Gefäßnetze im Gehirn und Netzhaut, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Beschreibungen sind vorgesehen, um vorzubereiten, zu behandeln und Bild Zebrafischembryonen, die verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) ausdrücken, und dann erzeugen umfassende 3D-Renderings des zerebrovaskulären Systems. Protokolle umfassen die Behandlung von Embryonen, konfokale Bildgebung, und die Fixierung Protokolle, die EGFP-Fluoreszenz zu bewahren. Weiterhin werden nützliche Tipps für die Beschaffung qualitativ hochwertiger Bilder von zerebrovaskulären Strukturen, wie das Auge die Entfernung ohne Beschädigung in der Nähe von Nervengewebe zur Verfügung gestellt. Mögliche Fallstrickemit konfokaler Bildgebung diskutiert, zusammen mit den notwendigen 3D-Rekonstruktionen aus konfokalen Bildstapeln mit frei verfügbaren Open-Source-Software erzeugen Schritte.

3D-Rekonstruktion von Gefäßstrukturen bietet eine umfassende und visuell interessante Perspektive der Zebrafisch-Entwicklung. Abbildungen 1 und 2 zeigen die Methoden, wie sie in der Regel getan. Abbildung 3 zeigt mehrere Winkel von Gefäßstrukturen in einem 6 dpf Zebrafisch-Embryo, der EGFP in Endothelzellen exprimiert. Mit einem grün oder weiß es schwierig sein kann, um die Signalstärke zu schätzen wissen; Pseudo-Färbung liefern Bildintensität aus einer Look-up-Tabelle und ermöglicht eine bessere Tiefenwahrnehmung, wenn Strukturen überlappen. Ein Beispiel einer Pseudo-farbige 3D-Bild des Gefäßsystems in einem 6 dpf Zebrafisch ist in Fig. 4 vorgesehen. Können Fluoreszenz-Bildgebung von lebenden Embryonen verwendet werden, um physiologische Merkmale, Augen-und Körperbewegung gehören zu studieren, und die Herzaktivität. Fig. 3 und 4 zeigen, mit diesen Methoden erhalten repräsentative Ergebnisse mit Hilfe der transgenen Zebrafischlinie<html> beschrieben. Imaging Auflösung hängt von Mikroskop Eigenschaften, aber die Helligkeit des EGFP-Signal ist ausreichend für eine gute Bildqualität mit den meisten kommerziellen Systemen. Wiederaufbau und Rendering von 3D-Darstellungen ist konsistent und Optionen innerhalb dieser Open-Source-Software bieten durchweg gute Ergebnisse. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Augenentfernung. A) Eine feste 3 dpf Embryo mit einer Wolfram Bedarf positioniert neben dem Auge. Das Gewebe wird um das Auge von dieser Position. B geschnitten) Das Auge ist fällt aus und die zugrunde liegenden Augenmuskeln und Sehnerv geschnitten werden. Die leere Augenhöhle ist mit gestrichelten Kreis angedeutet. C) Das gleiche Embryo wird umgedreht und mit Methyl-Cellulose-montiert, mit dem intakten Auge nach oben.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> 2. Schritt-für-Schritt-3D-Rekonstruktion eines konfokalen Bildstapels. A) Öffnen Sie die Datei (4104.1.ids) in Fidschi mit Plugins&gt; LOCI&gt; Bioformat an. B) Nach der Feststellung ein Stück mit dem interessierenden Bereich auswählen geladen ist, wird Schwelleneinstellung wie gezeigt. C) ausgewählt wird Threshold auf 214 mit dem oben angepasst Schieberegler und gelten gewählt. D) 3D-Viewer wird aufgerufen, wie dargestellt. E) Die 3D-Rekonstruktion eines Zebrafisches mit dem Auge intakt, zur Orientierung. F) Das Bild wurde gezoomt und gedreht. G) eine 360-Grad-Drehung Film gezeigt hergestellt wird, wie dargestellt.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3. Perspektiven aus 3D-Rekonstruktion. A) Medial Sicht von 6 dpf Embryo mit 10-fach Objektiv abgebildet wird, ist Mund auf der rechten Seite, nicht Kiemen in den Mund. B) Seiten des gleichen Embryos ist Note Flosse eine Schleife in der Mitte. C) Gleiche Embryo mit 20x-Objektiv abgebildet wird, medialen Perspektive, Anmerkung Kiemenauflösung. D) Seitliche Sicht der 20x-Objektiv-Bildgebung. Die Flosse ist am rechten Rand des Panels. E) Antero-medial von 20x-Objektiv Bildgebung, Anmerkung Kiemen in den Mund. F) Abdomen des gleichen Embryos mit einem 20x-Objektiv, Kopf nach rechts abgebildet. Hinweis Gefäß auf dem Dottersack unten rechts.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4. Unterschiede in der Intensität 6 dpf Embryo. Bild von einem 6 dpf Rekonstruktion mit Pseudo Look-Up-Tabelle für Signalintensität. Mund-, Hirn, Kiemen und Dottersack sind zur Orientierung gekennzeichnet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Film des rekonstruierten Gefäßsystem in einem 4 dpf Zebrafisch. Der Fisch wurde auf 2,5 um abgebildet. Die Bilder warenAbbilden von einer Hälfte des Embryos. Vergleichen vaskulären Strukturen mit Strukturen in einer GSI-behandelten Zebrafisch in Abbildung 6 vorgesehen. Beachten Sie die geringere Dichte der Blutgefäße im Kopf und größeren Kiemen. (Siehe &quot;Zfish_spin.avi&quot; ergänzende Datei unter Downloads) <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Abbildung 6. 3D Movie des Gefäßsystems in einer GSI-behandelten Embryo bei 4 dpf. Der Fisch wurde auf 2,5 um durch von lateral nach Mittellinie abgebildet. Vergleichen Gefäßstrukturen mit der Steuerung 4 dpf Fisch in Abbildung 5 dargestellt. Die gewölbte Rückseite und kleinere Größe typisch in Embryonen mit dieser Chemikalie behandelt. (Siehe &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; ergänzende Datei unter Downloads)

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Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Aufrufe.  Western University of Health Sciences.  Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden. 

Serie: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Forschung

Biologie

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.