Das Protokoll erlaubt die spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden in lebenden Zellen und die quantitative Untersuchung ihrer Bewegung in hoher Auflösung. Die Inkubation mit dem Fluoreszenzfarbstoff umgeht nur die Notwendigkeit von fluoreszierendem Protein über expression, vermeidet verwandte Artefakte und Einschränkungen und ermöglicht die Anwendung unseres Protokolls auf nicht transfizierbare Zellen. Um eine bevorzugte Nukleoidfärbung zu erreichen, sollte man SYBR Gold und nichts anderes unter den Bedingungen verwenden, die wir optimiert haben.
Andernfalls kann die gesamte zelluläre DNA gefärbt werden. Einen Tag vor dem Etikettierungsverfahren viermal 10 bis fünf HeLa-Zellen in zwei Millilitern Medium in einer 35-Millimeter-Petrischale kulturieren. Am nächsten Morgen waschen Sie die Zellen in zwei Milliliter PBS, bevor Sie einen Milliliter phenolrotes freies Kulturmedium und einen Milliliter der entsprechenden 2X-Etikettierlösung hinzufügen.
Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid den Farbstoff, der Überstand enthält, vorsichtig aus jeder 35-Millimeter-Petrischale ansaugen und die Zellen mit zwei Millilitern PBS waschen. Dann füttern Sie die Zellen mit frischem phenolroten freien Zellkulturmedium und bringen Sie die Kultur in den Zellkultur-Inkubator zurück, der vor Licht bis zur Live-Bildgebung geschützt ist. Für die Live-Zell-Bildgebung, mindestens eine Stunde vor der Bildgebung Sitzung, legen Sie die Bühne Top-Inkubator auf die Super-Auflösung strukturierte Beleuchtung Mikroskop Bühne und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und die Kohlendioxid-Konzentration auf 5%Schalten Sie alle Komponenten des Mikroskops einschließlich der Laser und wählen Sie eine hohe Vergrößerung, hohe numerische Blenden Immersion Objektiv wie für Super Auflösung strukturierte Beleuchtungsmikroskopie vom Mikroskop empfohlen.
Wenn sich die Laser erwärmt haben, installieren Sie die 35-Millimeter-Petrischale auf die Mikroskopstufe und verwenden Sie das Okular, um einen Bereich von Interesse mit Zellen zu lokalisieren, die an der Unterseite der Schale befestigt sind. Um strukturierte Beleuchtungsmikroskopiebilder mit superauflösungsauflösung zu erfassen, verwenden Sie eine Back-End-High-End-Elektronenmultiplikator-gekoppelte Gerätekamera. Legen Sie in der Bildaufnahmesoftware eine hohe Elektronenmultiplikationsverstärkung wie für die Kamera empfohlen fest.
Vor dem Erwerb der Zeitraffer-Serie für Nucleoid-Tracking, erwerben Sie ein zweifarbiges super auflösungsstrukturiertes Beleuchtungsmikroskopiebild des gleichen Sichtfeldes in einem Kanal für mitochondriale Färbung und einen weiteren für SYBR-Gold. Stellen Sie den mitochondrialen Bildfarbkanal auf die entsprechende Anregung und Emission für den verwendeten mitochondrialen Fleck ein und stellen Sie den entsprechenden Anregungs- und Bang-Pass-Emissionsfilter für den SYBR-Goldfarbstoff ein. Stellen Sie die niedrigste Laserleistung für beide Kanäle ein.
Wenn das Mikroskop Kanäle nur sequenziell erfasst, schalten Sie den Kanal für die mitochondriale Fleckenerkennung aus. deaktivieren Sie die Z-Stack-Box in der Software, um die Z-Stack-Erfassung auszuschalten, um die Erfassung einer einzelnen Fokusebene einzustellen und die kürzest mögliche Kamerabelichtungszeit einzustellen. Legen Sie drei Drehungen des Rasters fest und erfassen Sie zweidimensionale Bilder der beschrifteten Zellen mit mehreren Laserleistungswerten und mehreren Belichtungszeiten, um die Laserleistung in der Belichtungszeit der Kamera zu optimieren.
Wählen Sie die Laserleistungs- und Kamerabelichtungszeiten, die strukturierte Beleuchtungsmikroskopiebilder mit hellen Flecken in den Mitochondrien mit wenig oder gar keinen Artefakten ergeben, und starten Sie die Erfassung der Zeitrafferserie mit den optimierten Einstellungen. Für die Analyse der Zeitrafferbilder öffnen Sie die konvertierten strukturierten Beleuchtungsmikroskopiebilder und eine entsprechende Bildanalysesoftware, die über ein Spot-Tracking-Modul verfügt, und klicken Sie auf Neue Spots hinzufügen, um den Spots-Erstellungs-Assistenten zu starten. Klicken Sie auf der Registerkarte Erstellen auf Pfadpunkte im Zeitverlauf, und fahren Sie mit dem zweiten Schritt des Assistenten fort.
Stellen Sie den geschätzten x-y-Durchmesser auf 0,1 bis 0,15 Mikrometer ein. Klicken Sie auf Hintergrundsubtraktion, und fahren Sie mit dem dritten Schritt im Assistenten fort. Ziehen Sie die vertikale Linie im Histogramm, um den Schwellenwert des Qualitätsfilters anzupassen, bis die meisten Nukleotide erkannt werden, da Flecken in den Artefakten nicht innerhalb jedes Frames erkannt werden.
Fahren Sie mit dem vierten und fünften Schritt des Assistenten fort, und wählen Sie den autoregressiven Bewegungsalgorithmus aus. Stellen Sie den maximalen Abstand auf 0,5 Mikrometer und die maximale Spaltgröße auf Null ein. Wenn die fein abgestimmten Parameter es der Software ermöglichen, alle Spots zu erkennen und Tracks korrekt zu erstellen, klicken Sie auf den Pfeil jetzt, um die Erstellung der Spuren zu bestätigen, und klicken Sie auf das Statistiksymbol, um die Spurenstatistiken zu extrahieren.
Wählen Sie dann die erforderlichen Statistikparameter aus und klicken Sie auf Speichern unter, um die Werte als Punkt-CSV-Dateien zur Quantifizierung und Visualisierung zu exportieren. Die Etikettierung mit hohen Konzentrationen von SYBR-Gold oder PicoGreen führt zu einer reichlichen Färbung der Kerne und der Punktiatfärbung im Zytoplasma. Bei niedrigeren Konzentrationen tritt ein schwaches SYBR-Goldsignal innerhalb der Kerne in einem Muster heller Flecken auf, das innerhalb des Zytoplasmas beobachtet wird.
Die PicoGreen-Kennzeichnung in niedrigen Konzentrationen führt hauptsächlich zu kernnuklearen Färbungen. Die gleichzeitige Färbung mit geringen Konzentrationen von SYBR-Gold in einem weit roten mitochondrialen Farbstoff zeigt, dass fast die gesamte SYBR-Goldfärbung innerhalb der Mitochondrien auftritt, während die Etikettierung in hohen Konzentrationen zu einer signifikanten Färbung der Kerne und des Zytoplasmas führt. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigt, dass die Nukleoidfärbung nach 45 Minuten nahe an der Sättigung ist.
Die Fixierung bewirkt eine leichte Umverteilung des Farbstoffs in den Kern, während die Permeablisierung der festen Zellen das gepunktete Färbemuster der Mitochondrien eliminiert und die kerntechnische Färbung verbessert. Wenn SYBR-Gold nach Fixierung und Permeablierung den Zellen zugesetzt wird, verteilt sich der Farbstoff gleichmäßig über das Zytoplasma und den Kern, was zum Verlust der Färbungsspezifität führt. Live-Zell-3D-Bildgebung durch super auflösungsstrukturiertes Beleuchtungsmikroskop zeigt das mitochondriale Nukleoid als helle Flecken innerhalb der Mitochondrien.
Das Verfolgen der Positionen des Nukleoids bei einer Auflösung jenseits der Beugungsgrenze zeigt, dass die Mehrheit der Nukleoide zufällige Bewegungen in kurzer Entfernung aufweist, die wahrscheinlich auf das mitochondriale Netzwerk beschränkt sind. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht mit der Fixierung des Beispiels kompatibel ist. Unser Protokoll sollte jedoch mit einer breiten Palette von Live-Zell-Bildgebungs-basierten Assays zur Untersuchung von Morphologie, Dynamik und Aktivitäten von Molekülen und Organellen kompatibel sein.
Unsere Studie veranschaulicht die Vorteile der Retargeting nicht-organischen Farbstoffe für zellbasierte Techniken. Es kann die Erforschung anderer fluoreszierender Farbstoffe für ihre Anwendung in zellulären Studien inspirieren.
