Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Medizin-und Gesundheitsforschung Zuschuss von der Stadt Paris, die Französisch Nationalen gewähren ANR-09-JCJC-0118-1, und der ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Projekt nicht unterstützt. 242719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Wahl der Zell-Linie. Die Wirksamkeit von Basis-Analoga als RNA Mutagene korreliert mit ihrer relativen Aufnahme durch verschiedene Zelltypen 11. Wenn der Zelllinie, die normalerweise für Viruspassage dient erweist sich als refraktär Aufnahme oder zu empfindlich (hohe Zelltoxizität) mutagen, kann es notwendig sein, um eine andere Zelllinie, die diese Anforderungen erfüllt und ist immer noch permissive die virale Replikation verwenden. Sobald die mutagen Widerstand Variante isoliert ist, kann der Rest der Charakterisierung in der ursprünglichen, bevorzugte Zelllinie durchgeführt werden. In unserer Erfahrung, HeLa Zellen leicht nehmen mutagen; BHK-Zellen benötigen bis zu 10-fach höhere Konzentrationen und Vero-Zellen sind refraktär gegenüber mutagen Aufnahme. Wahl des mutagen. Bei dem Versuch, Treue-Varianten durch Mutagenbehandlung, die Wahrscheinlichkeit eines Erfolgs zu isolieren wird erhöht, wenn mehr als eine Art von Mutagen verwendet wird. Basis analoger Mutagene unterschiedlicher Struktur, die fälschlicherweise in Genome während der Replikation eingebaut wird überwiegend induzieren Ergebnis in eine bestimmte Untergruppe von Mutationen in den nachfolgenden Replikationszyklen: Ribavirin behandelt Gefälligkeiten GtoA und CtoU Übergang Mutationen 12; 5-Azacytidin hat eine ähnliche Tendenz, mit der Neben der CtoG und GtoC Transversionen 13; 5-Fluorouracil bevorzugt induziert Atog und UTOC Übergänge 14. Alternativ höhere Konzentrationen von Mg 2 + oder Mn 2 + können dem Medium ergänzt werden, um die gesamte Mutationsfrequenz von RNA-Viren, ohne die Vorspannung über 12 beschrieben zu erhöhen. Je nach Virus &quot;Codon-Sequenzen und die Codon-Änderungen erforderlich, um eine Treue-Variante zu erzeugen, einige von diesen Bedingungen wird die Entstehung dieser Variante gegenüber anderen zu bevorzugen. Für die höheren Treue Poliovirus G64S und Coxsackie Virus A372V, Ribavirin Behandlung am ehesten für die Varianten ausgewählt, weil die erforderliche Atog Übergang an die Codon-Website entsprach der Mutationen hauptsächlich durch dieses Ribavirin generiert. MOI vs Populationsgröße. In der Virologie, Pay-Protokolle für Gewebekultur Infektion besonderes Augenmerk auf die Multiplizität der Infektion (MOI), um die Ansammlung von defekten störende Partikel (low MOI) zu vermeiden oder Rekombination zwischen Viren zu fördern (hohes MOI), für Beispiel. So wählen Sie für die Entstehung Veranstaltungen über serielle Passage ist es auch wichtig, Viruspopulation Größe zu betrachten. Da die resistente Mutante existiert zunächst bei einer niedrigen Frequenz ist es am besten, einen möglichst großen Bevölkerungszahl wie möglich von einem Kanal übertragen auf die nächste (10 5 -10 6 Viren, z. B.) nicht zu verlieren diese neuen Varianten bei jeder Passage. Intensivierung der Größe von gut oder Kolben (Anzahl der Zellen infiziert) kann dazu beitragen, den Anstieg der MOI zu minimieren, wenn dies von Belang ist. Auf der anderen Seite, für Experimente, in denen die Empfindlichkeit eines Virus mutagen getestet wird, ist gering MOI Infektion durchgeführt, um die Anzahl der Replikationszyklen vorkommende in das Experiment zu erhöhen und die Rettung von mutagenisierten Genomen zu vermeiden durch eine höhere Fitness Genome durch Komplementation bei co-infizierten Zellen. Dies ist wichtig, da die Mutationen für die Nachkommenschaft Genome in der ersten Runde der Replikation generiert wird nicht sofort erkannt werden. Die meisten dieser mutagenisierten RNAs noch in Virion verpackt werden. Es ist in die nächste Runde der Infektion, die letalen Mutationen in diesen Genomen wird in einer abgebrochenen Replikationszyklus führen, und Reduzierung der Virustiter. Es kann notwendig sein, um für mehrere Runden der Akkumulation von Mutationen erlauben, bevor eine signifikante Wirkung von tödlichen Mutagenese zu beobachten ist. Schließlich, wenn mehr als die Passage-Serie in der Gegenwart von mutagen, die Virustiter bis Aussterben weiter abfällt, dann sollte der Forscher versuchen Passagierung Virus in allmählich steigenden Mengen von mutagen (ausgehend von einem sehr niedrigen Konzentrationen). Isolation und Generierung der RNA mutagen resistenten Klon aus der RNA mutagen-resistenten Population. RNA Mutagene einführen mehrere zufällige Mutationen zu jedem Genom, sondern Selektion auf Resistenz wird nur bereichern (und zu beheben, um Consensus-Sequenz) die Resistenz-Mutation. Zur Identifizierung dieser Mutation, wir Abfolge der Mutagen resistente Population (Konsens der Bevölkerung) und nicht die einzelnen Viren. Daher sind die einzigen, zufällige Mutationen durch die mutagen erstellt wurden, nicht in der Reihenfolge erkannt, nur die Mutationen, die im Konsens Veränderungen nach Auswahl, zu finden sind. In unserer Erfahrung sind wir nur zu identifizieren ein oder zwei solcher Konsensus-Sequenz ändert. Sobald die mutagen resistenten Population erhalten wird und die Resistenz-Mutation identifiziert ist, ist es notwendig, eine reine Bestandsaufnahme dieser Variante zu erzeugen. Oben beschrieben, haben wir eine Gedenktafel Reinigungsverfahren. Alternativ, wenn das Virus von Interesse führt nicht zu leicht identifizierbaren Plaques, können die gewünschte Variante purif werdenIED durch limitierende Verdünnung. Dieser Ansatz ist im Wesentlichen ein TCID 50 in 96-Well-Format, in denen das Virus Lager so verdünnt, dass weniger als 50% der Brunnen infiziert sind. Mit dieser Verdünnung wird der gleiche Ansatz wie oben genommen, bei der Isolierung bis zu 10 individuelle Varianten und bestätigt ihre Sequenzen. Wie bereits erwähnt, in den besten Fällen ist eine infektiöse cDNA Klon des Virus-Stamm zur Verfügung. Isolation der Variante wäre also nicht notwendig sein. Nach unserer Erfahrung sind Treue Varianten das Ergebnis der einzelnen Aminosäure-Substitutionen und kann somit unter Verwendung einfacher, kommerzialisiert Mutagenese-Kits wie Quikchange (Agilent) werden. Eine zweite Möglichkeit ist, einen cDNA-Klon von einem eng verwandten Stamm verwenden. Allerdings, wenn ein verwandter Stamm verwendet wird, empfiehlt sich die Verwendung sowohl diesen Ansatz und die Virusisolierung (zB Plaque-Reinigung), weil wir festgestellt, dass die gleiche Treue zu verändern Mutation auf beiden eng verwandten Viren werden nicht unbedingt die gleiche Wirkung haben. Fidelity und Replikation. Selektion von RNA mutagen resistente Varianten haben in der Isolation sowohl höhere als auch niedrigere Treue Varianten mit Wachstum, die ähnliche Merkmale auf ihre Wildtyp-Gegenstücke 4,12,15 sind geführt. Derzeit ist das Bindeglied zwischen Polymerase Erwerbsquoten und Treue nicht vollständig verstanden. In-vitro-biochemische Untersuchungen unter Verwendung von gereinigten RNA-Polymerase haben gezeigt, dass eine höhere Klangtreue Varianten langsamer Verarbeitungsgeschwindigkeit haben, während niedrigere Treue Varianten schnellere Verarbeitung 1-3,12 neigen. In Gewebekulturen, sind diese Unterschiede in der Regel nicht erkennbar, was darauf hindeutet, dass die Verfügbarkeit von Ressourcen, anstatt intrinsische Polymerase-Aktivität Kinetik ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Wenn die Treue Variante repliziert mit Kinetik, die sich nicht signifikant von Wildtyp-, dann einen Vergleich ihrer Mutation Frequenzen können direkt vorgenommen werden. Wenn eine sehr signifikante Veränderung bei der Replikation Kinetik vorhanden ist, dann sollten die Daten normalisiert, um zur kinetischen Unterschiede, zum Beispiel durch den Vergleich Viren, die die gleiche Anzahl von Replikationszyklen unterzogen haben Konto. In unserer Erfahrung, auch wenn keine signifikanten Unterschiede in einem Schritt Wachstumskinetik zwischen Wildtyp und High-Fidelity-Varianten beobachtet wurden, beobachteten wir, dass eine höhere Klangtreue Varianten durchweg höhere Titer (innerhalb von 1 log) im Vergleich zum Wildtyp, aber sie machen etwas weniger RNA (innerhalb der gleichen Größenordnung), weiter darauf hindeutet, dass die Genome sie produzieren weniger Mutationen enthalten und somit mehr infektiös. Die Probenaufbereitung und Sequenzierung. Für alle Schritte in dieser Protokolle ist es unerlässlich, dass High-Fidelity-, Korrektur-Enzymen für die PCR und RT-PCR dienen zur Begrenzung der Einführung zusätzlicher Mutationen, da sie nicht von biologisch relevanten Mutationen unterschieden werden. Es ist wichtig, dass das Virus Populationen verglichen werden unter den gleichen Bedingungen (Passage Geschichte, Gewebekulturmedium, Temperatur, RNA-Extraktions-Verfahren, RT-PCR-Protokolle, etc.) erstellt worden Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass genügend Ausgangsmaterial wurde erhalten aus der RNA-Extraktion, so dass eine starke Bande von RT-PCR generiert. A 1 / 100 Verdünnung der RNA-Probe sollte auch eine nachweisbare RT-PCR-Bande, was darauf hinweist, dass die Probe eine ausreichende Zahl von RNA-Molekülen auf Vertretung Bias zu vermeiden (Verstärkung der gleiche Genom mehrfach) enthält. Da Mutationsfrequenz ist eine Distribution, würde man erwarten, dass ähnliche Werte unabhängig von der Populationsgröße wird erreicht werden, sofern die genannten Bias nicht auftritt. Wie Abbildung 6 zeigt, gibt ein 10 5-fachen Verdünnung von einem Virus Lager eine Mutation Frequenz nicht wesentlich verschieden von den Elterntieren. Bis in die optimale Bedingungen für TopoTA Klonen gefunden werden, bestätigen das Vorhandensein von Einsätzen nach blau / weiß-Screening, durch Kolonie-PCR-Sequenzierung vor. Als Kontrolle für Mutationsanalysen Rauschen (Mutationen durch RT-PCR und Sequenzierung eingeführt), Klon eines PCR-Produkts aus einem Plasmid mit dem gleichen Virus-Sequenz und / oder geklont und sequenziert RT-PCR-Produkte von in vitro transkribierten RNA entsprechend Virusgenom (werden bewusst, dass verschiedene in-vitro-Transkription Enzyme haben unterschiedliche Fehlerraten und dürfen nicht geben wertvolle Informationen über die wahren Hintergründe Fehler in der Prozedur). Einige Viren-Sequenzen können giftig für Bakterien, so ist es wichtig, diese vor einer Entscheidung über die Region des viralen Genoms für Mutationsfrequenz sequenziert werden zu überprüfen. Bei der Analyse der Sequenzen durch TopoTA erhalten, beachten Sie, dass jeder Klon sollte nur ein insert / Sequenz enthalten. Wenn ein Doppel-Peak beobachtet, was auf eine gemischte Bevölkerung, ist es möglich, dass zwei benachbarte Bakterienkolonien ausgewählt wurden. Es ist auch möglich, obwohl sehr unwahrscheinlich, die niedrigen Frequenzen Mutation in bakteriellen Replikation gegeben, dass die Mutation während der Amplifikation von Plasmid wurde in der Bakterienkultur eingeführt. In Plaque purified Populationen kann eine Doppel-Spitze repräsentieren überlappende Plaques, oder ein Virus, dass der Erwerb einer neuen Mutation oder Zurücksetzen eine Mutation während der Plaque-Entwicklung. Seien Sie konsequent und entscheiden, ob zu zählen oder nicht zählen diese Mutationen. Schließlich, im Auge behalten, dass die Mutation verwendeten Frequenzen hier relative Werte. Sie gelten nur in den Vergleich Viruspopulationen unter den gleichen Bedingungen aufgewachsen, und sequenziert über den gleichen Bereich! Sie sollten nicht als absolute Werte der Mutationsrate, oder die Mutation Häufigkeit des Genoms als Ganzes betrachtet werden. Allerdings, wenn die Bedingungen geregelt sind, erlauben sie eine reproduzierbare, quantitative Vergleiche von Unterschieden in Mutation Verbreitung und Häufigkeit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Ribavirin </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluorouracil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-Azacytidin </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange Mutagenese-Kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Wenn ein cDNA infektiösen Klon ist verfügbar </td></tr><tr><td> 96-Well-Miniprep Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Oder andere Ausrichtung Software </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

RNA-Viren verwenden RNA abhängigen RNA-Polymerasen auf ihre Genome zu replizieren. Die eigensicheren hohen Fehlerquote dieser Enzyme ist ein großer Faktor für die Generation der extremen Vielfalt der Population, die auf Viren Anpassung und Entwicklung erleichtert. Zunehmende Anzeichen zeigt, dass die intrinsische Fehlerrate und die daraus resultierenden Mutation Frequenzen von RNA-Viren können moduliert werden durch subtile Aminosäure Änderungen an der viralen Polymerase. Obwohl biochemische Assays für einige virale RNA-Polymerasen, die quantitative Messung der Inkorporation Treue erlauben existieren, hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Messung der Mutation Frequenzen von RNA-Viren, die sich als so genau wie biochemische Ansätze bei der Identifizierung Treue zu verändern Mutationen hat. Der Ansatz nutzt konventionellen virologischen und Sequenzierung Techniken, die in den meisten biologischen Laboren durchgeführt werden können. Basierend auf unseren Erfahrungen mit einer Reihe von verschiedenen Viren, haben wir die wichtigsten Schritte, die optimiert, um die Wahrscheinlichkeit zu isolieren Treue Varianten und die Erzeugung der Daten der statistischen Signifikanz erhöhen müssen identifiziert werden. Die Isolierung und Charakterisierung der Treue zu verändern Mutationen können neue Einblicke in die Polymerase-Struktur und Funktion 3.1 bieten. Darüber hinaus können diese Treue Varianten nützliche Werkzeuge werden bei der Charakterisierung von Mechanismen der Virus-Anpassung und Weiterentwicklung 4-7.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency at JoVE.com

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Der vorliegende Artikel beschreibt die notwendigen Schritte zu isolieren und zu charakterisieren RNA-Polymerase Treue Varianten von RNA-Viren und wie man Mutationsfrequenz Daten verwenden, um Treue Veränderungen in der Gewebekultur zu bestätigen.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.5K Aufrufe.  Institut Pasteur. Der vorliegende Artikel beschreibt die notwendigen Schritte zu isolieren und zu charakterisieren RNA-Polymerase Treue Varianten von RNA-Viren und wie man Mutationsfrequenz Daten verwenden, um Treue Veränderungen in der Gewebekultur zu bestätigen.

Serie: Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikel von Erwachsenen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...