Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lars Philipsen für die Hilfe bei der Optimierung der Intravitalmikroskopie Filme, Dr. Jonathan Lindquist für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts danken, und allen Mitgliedern des Gunzer Labor für hilfreiche Diskussionen und Stellungnahmen, die während der Entwicklung der Methode. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) an MG finanziert

1. Infektion <ol><li> Geschwollene Konidien des Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus (Stamm ATCC 46645) durch Vorinkubation in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) ergänzt mit generierten 5% FCS (v / v). 2x10 7 ruhenden Konidien sind in 5 ml Medium resuspendiert und in einer 6-well Zellkulturschale (TPP AG; Trasadingen, Schweiz, Katalog Nr. 92006) für 7h bei 37 ° C. </li><li> Jedem Aspergillus enthält auch in die 6-well; Nach der Schwellung Zeitraum werden die Sporen Fluoreszenz durch Zugabe von 10 ul der Calcofluor weiß Stammlösung ([25 mg / ml] in DMSO Sigma Aldrich, Deisenhofen, Deutschland, Katalog # F3543) gekennzeichnet Platte, auf die endgültige Calcofluor Konzentration von 50 ug / ml RPMI. Nach sanftem Mischen werden die Sporen für weitere 15 min bei 37 ° C inkubiert </li><li> Im nächsten Schritt werden die Sporen durch Filtration durch ein 70 um Zellsieb (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) geerntet. Nach einmaligem Waschen mit 10 ml PBS (Zentrifuge bei 900xg für 5 min bei Raumtemperatur) wird das Pellet in 2 ml PBS und die Gesamtzahl der geschwollenen Konidien durch Zählen mit einer Neubauer Kammer bestimmt resuspendiert. Schließlich wird die Sporensuspension stillgelegt ist 900xg für 5 min bei Raumtemperatur gesponnen wird der Überstand vorsichtig entfernt und das Pellet resuspendiert, um die endgültige Konzentration von 1x107 Sporen pro 100 ul PBS. </li><li> Zur Infektion wird 100 pl spore Lösung intratracheal in weiblichen Mäusen (C57/BL6, 8-10 Wochen alt, Harlan, Deutschland) eingesetzt. Wenn Neutrophile als auch beobachtet werden, ist die Verwendung von Lys-EGFP Mäuse, Durchführung EGFP unter der Lysozym-Promotor 1 empfohlen. Beginnen Sie mit der Betäubung des Tieres mit einem einzigen ip-Injektion von 150 ul Ketamin / Rompun Lösung (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland (Ketamin) und Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml sterile NaCl [0,9%]). 5 Minuten später den narkotisierten Maus kann mit einem Gummiband durch die Zähne an der Rampe (dh eine geneigte Fläche), um die Intubation (ergänzende Abbildung 1) zu erleichtern fixiert werden. Mit einer Pinzette wird die Zunge auf der einen Seite und eine 22G innewohnende Katheter (B. Braun AG, Melsungen, Deutschland, Vasofix Braunüle) kann leicht in die Luftröhre werden unter ständiger Beleuchtung mit einem Schwanenhals-Lampe eingesetzt gezogen. Die erfolgreiche Einführung des Katheters wird durch die Beobachtung regelmäßiger Bewegung des Tieres Thorax mit der Frequenz der mechanischen Ventilator überprüft. Wenn die erfolgreiche Intubation bestätigt wurde, ist 100 ul Sporensuspension unter Verwendung einer 100 ul Mikropipette. Dieses Volumen sollte durch das Tier ohne zusätzliche Hilfe in 1-2 s. eingeatmet werden Eine verbesserte Verteilung der Pilz-Partikel in der Lunge wird durch mechanisch Belüftung des infizierten Tieres für 2 Minuten mit einem kleinen Tier Atemschutzmaske (Minivent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Deutschland) mit einer Rate von 250 Atemzüge pro Minute und einer Inhalation von 300 erreicht ul pro Atemzug (ergänzende Abbildung 2). Nach der Infektion Tiere ihren Käfig zurück und beobachtet alle 5 Minuten, bis der ambulanten wieder. Mäuse zeigen keine Anzeichen von Schmerzen oder Leiden während der folgenden Inkubationszeit. </li></ol> 2. Lung Vorbereitung <ol><li> 7 h nach der Infektion mit den Sporen wird das Tier durch eine Überdosis eingeschläfert Isofluran (Baxter GmbH, Unterschleißheim, Deutschland), bis Bewegungen und Atmung sind seit mehr als 30 Sekunden eingestellt. Diese wird dann durch Thorakotomie als sekundäre Methode zur klinischen Tod versichern und damit für die Visualisierung und den Zugang der Luftröhre und der Lunge gefolgt. Dann wird die Brust vorsichtig geöffnet, um der Lunge und der oberen Atemwege aussetzen. Dann noch 22G innewohnende Katheter wird in die Luftröhre ab der exponierten Epiglottis eingefügt. Durch diese Röhrchen die Lungen werden mit 1 ml vorgewärmten niedrig schmelzender Agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung einer 1 ml Spritze Omnifix (B. Braun) gefüllt. Sobald die Lungen gefüllt sind die Luftröhre wird mit einem kurzen Stück Nähgarn gebunden und das ganze Tier wird in einem Kühlschrank bei 4 ° C stellen </li><li> 15 min später, als die Agarose erstarrt ist, wird die ganze Lunge herausgeschnitten Anfang der Luftröhre. Mit ein paar spitzen Schere, das Recht Lungenlappen später entfernt wird, ist die Bodenfläche kurz auf ein Blatt Seidenpapier getrocknet und dann die ganze Lappen ist mit der Vorbereitung Block eines Vibratom (Campden Instruments, UK, 752m Vibroslice geklebt ) mit einem Tropfen Gewebekleber zur Fixierung (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland, Roti-Coll 1). Nach 1 min wird der Block in den Mahlraum der Vibratom, die mit vorgekühlten (4 ° C) PBS gefüllt ist installiert. Die Vibratom ist eine Mid-Range-Vibration (5 von 10 max.) Und auch mäßiger Geschwindigkeit (5 von 10 max.), So dass ein horizontaler Querschnitt der eingestelltenLunge produziert wird. Die obere Hälfte der Orgel wird dann in ein kleines Kunststoff-Petrischale (5 cm Durchmesser), wo es umgekehrt und ist mit einem self-made Unterlegscheibe (1 cm Innendurchmesser), die durch eine Reihe von parallel Nylonfäden bedeckt ist dort fixiert, jeweils 1 mm auseinander (ergänzende Abbildung 3). Schließlich wird die Petrischale mit 10 ml PBS mit 10 ul der DNA-Farbstoff Sytox Orange [5 mm] (Invitrogen, Deutschland), die sich in einer abschließenden Farbstoff-Konzentration von 5 uM ergänzt gefüllt. </li></ol> 3. 2-Photonen-Laser-Mikroskopie <ol><li> Die Petrischale mit der Lunge Probe wird dann unter dem Mikroskop-Objektiv eingebaut, so dass der Puffer auf 37 ° C kann durch einen Temperatursensor-gesteuerte Heizung (ergänzende Abbildung 4) erwärmt werden. 2-Photonen-Mikroskopie wird dann über die gesamte Schnittfläche mit einem Zeiss-Mikroskop LSM 710 NLO auf eine aufrechte Axio Examiner Bühne mit einer 20xNA1.0 Wasser getaucht Objektiv (Zeiss, Jena, Deutschland) ausgestattet ist. Für die Bildgebung werden verschiedene Bereiche entlang der Schnittlinie bis 400 mu m Tiefe abgetastet mit einer Ausleuchtung Wellenlänge von 800 nm erkennen Grün (530 nm) und rot (580 nm) Fluoreszenz, sowie die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG)-Signal und die blau Calcofluor Fluoreszenz (bei 400-470 nm Emission) mit externem nicht descanned Detektoren (NDD). Neben 2-D-Bilder und Zeitraffer-Filme (1 Bild alle 5-10 Sekunden), können einzelne oder wiederholende 3-dimensionales Bild Stapel anschließend als Voxel Renderings oder einzelnen erweiterten Fokus Bilder oder 4-D-Daten (3D über die Zeit) mit gerendert werden verschiedenen Software-Paketen. Diese mikroskopischen Aufbau ermöglicht die Beobachtung von zellulären Verhaltens in einer fast intakten Umwelt, die, wie es den Eintrag Port stellt für eine Vielzahl von Luft-Erreger, ist von enormer immunologische Relevanz. Zellbewegung, Phagozytose und NET Produktion von körpereigenen Neutrophilen nach der Infektion mit dem Schimmelpilz Aspergillus fumigatus kann leicht unter diesen werden in situ-Bedingungen untersucht. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn man es richtig macht der Bildgebung erzeugt 2 - oder 3-Farb-Dias oder Filme. Obwohl Färbung in einem Post-Processing Verfahren durchgeführt wird und ist somit frei anpassbar, wir in der Regel wählen Sie ein Farbschema, das die natürliche Farbe des Farbstoffs / Signal, das in der relativen Kanal erkannt wird reflektiert. So sind die Sytox Farbstoffe in rot, der Pilz sowie die SHG-Signal wird in blau dargestellt dargestellt und, falls vorhanden, EGFP-markierten Zellen sind grün angefärbt. Im ersten Beispiel (Abb. 1) den blauen SHG-Signal zeigt das Gewebe Fasern eines nicht-infizierten Lunge und die rote Sytox Signal wird von Kernen der Lunge ansässigen Zellen produziert aufgeschnitten durch die Vibratom. Im zweiten Beispiel (Abb. 2) einer infizierten Lunge gezeigt, wo beide, alveoläre Strukturen sowie Pilz-Massen, in blau erscheinen, während Kerne und NETs gefärbt sind rot. Das dritte Beispiel (Abb. 3) wird aus einer Lys-EGFP transgenen Tieres, wo zusätzlich zu den blauen und roten Strukturen der grünen Neutrophilen auch gesehen werden kann. Die Migration von Neutrophilen und deren Phagozytose von einzelnen Pilzelemente im Zeitraffer-Sequenzen ist in den ergänzenden Film gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Das Erscheinungsbild einer nicht-infizierten Lunge Scheibe in 2-farbig 2-Photonen-Mikroskopie. Ein Lunge Scheibe wurde aus einer nicht-infizierten C57/BL6 Maus vorbereitet und abgebildet wie im Protokoll beschrieben. Präsentiert werden hier die SHG-Signal des alveolaren Struktur (A), schneiden Sie die Sytox Signal von Zellkernen während der Vorbereitung der Lunge Scheibe (B), und eine Überlagerung der beiden Kanäle (C) zu öffnen. Die boxed-Bereich in (C) ist ersichtlich, vergrößert in (D). Bitte beachten Sie die faserige Gewebe am unteren Rand der Lunge Scheibe im Vergleich zu den deutlich alveoläre Organisation innerhalb der Atem-aktiven Bereiche der Lunge vor. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Das Erscheinungsbild einer Lungen-Scheibe einer Aspergillus-Infektion Wildtyp Tier in 2-farbig 2-Photonen-Mikroskopie. Ein Lunge Slice aus einer C57/BL6 Maus infiziert 7 h, bevor mit A. fumigatus wurde vorbereitet und abgebildet wie im Protokoll beschrieben. Dargestellt ist die kombinierte Pilz Struktur und SHG des alveolaren (A), die Sytox Signal DNA NETs gehören sowie die Zellkerne schneiden bei der Vorbereitung der Lunge Scheibe (B) zu öffnen, und eine Überlagerung der beiden Kanäle (C) . Die boxed-Bereich in (C) ist ersichtlich, vergrößert in (D). Bitte beachten Sie, sind die deutlich unterschiedlichen Bereichen der Pilz-Massen, Alveolen, und NET-Strukturen mit den Buchstaben F, A und N, jeweils markiert. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Das Erscheinungsbild einer Lungen-Scheibe einer Aspergillus-Infektion Lys-EGFP Tier in 3-farbig 2-Photonen-Mikroskopie. Ein Lunge Scheibe eines Lys-EGFP Maus infiziert 7 h, bevor mitA. fumigatus wurde vorbereitet und abgebildet wie im Protokoll beschrieben. Dargestellt ist die kombinierte Pilz Struktur und SHG des alveolaren (blau), die Sytox Signal von Zellkernen und NETs (rot), sowie auch zahlreiche Neutrophile (grün). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Abbildung 4" /> Supplemental Abbildung 1. Maus Fixierung zur Intubation. Under Ketamin / Rompun Narkose wird das Tier mit einem Gummiband an den Zähnen befestigt, um die Intubation mit einer 22G innewohnende Katheter zu erleichtern. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Abbildung 5" /> Supplemental Abbildung 2 dargestellt. Mechanische Maus Belüftung. Die intubierten Maus wird durch eine IT-Anwendung von 1x10 7 Sporen in 100 ul PBS resuspendiert infiziert. Eine verbesserte Verteilung der Pilz-Partikel in der Lunge wird durch mechanisch Belüftung der infizierten Maus mit einem kleinen Tier Beatmungsgerät erreicht. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Abbildung 6" /> Supplemental Abbildung 3 dargestellt. Lungenlappen Fixierung. Nach der Vorbereitung des rechten Lungenlappen des Organs wird in einer Petrischale mit Hilfe eines im Labor hergestellte Unterlegscheibe, die durch eine Reihe von parallel Nylonfäden bedeckt ist fixiert. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Abbildung 6" /> Supplemental Abbildung 4. 2-Photonen-Imaging-Setup. Die Petrischale mit dem rechten Lungenflügel ist auf eine Heizmatte unter der 2-Photonen-Mikroskop nach Zugabe der DNA-Farbstoff Sytox orange installiert. Supplemental Film:. Neutrophile Migration und phagozytierenden Pilzelemente in Aspergillus infizierte Lunge durch Zeitablauf 2-Photonen-Mikroskopie eines lebenden Lunge Scheibe 7 h nach der Infektion mit dem Pilz gesehen Neutrophile sind grün, Pilz-Elemente und SHG sind blau, und Zellkerne als sowie NET-Strukturen sind in rot dargestellt. Die Echtzeit des Versuchs ist auf der unteren rechten Seite angezeigt. Der Maßstab zeigt 50 um. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a>

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Real-time 2-Photonen-Mikroskopie in vivo-oder in intakten Organen hat eine tiefgründige Bedeutung in Studien, die sich mit der Physiologie der Immunzellen in den vergangenen 10 Jahren gewonnen. Es war mit dieser Technik, die wichtige Ereignisse wie die Dynamik von T-Zell-Aktivierung in den Lymphknoten wurde erst sichtbar 2-4. In jüngster Zeit haben Forscher damit begonnen, spezifische zelluläre Funktionen wie die ersten Schritte in die Generierung von Effektor-Zellen in den lymphatischen Geweben mit diesem Ansatz 5 zu analysieren. Doch obwohl eine Reihe von neuen biologischen Konzepten aufgedeckt wurden mit dieser Methode gibt es immer noch eine Herausforderung und wichtige Fragen, für die keine intravitalen Visualisierung Studien veröffentlicht wurden bislang. Insbesondere gilt dies für die Säuger Lunge. Der interessanteste Aspekt dieses Organs, als Eintrittspforte für eine Vielzahl von Luft-Erreger, macht ihn zu einem der wichtigsten Flächen, an denen immunologische Prozesse finden in den Körper von Säugetieren. Mit jedem Atemzug über die gesamte Lebensdauer, sind unerwünschte Partikel, von denen einige das Potenzial, lebensbedrohliche Infektionen hervorrufen 6 eingeatmet. Es ist selbstverständlich, dass bei einem so sensiblen und gefährdeten Ort ein dichtes Netz von Abwehrmechanismen vorhanden sein ausstellenden das gesamte Repertoire von Immunantworten benötigt. Auf der anderen Seite ist es sehr wichtig, dass die induzierte immunologische Kampf gegen potenzielle Krankheitserreger in einem solchen &quot;schmutzigen&quot; Ort eng kontrolliert wird. Übertriebene Reaktionen des Immunsystems tragen ein hohes Risiko der Schädigung des eigenen Körpers durch massiv verletzt Organgewebe nach Stimulation von unspezifischen Immunzellen Aktionen 7,8. Im Lichte dieser Überlegungen wäre es sehr interessant und hilfreich, um die Möglichkeit, das Verhalten der Zelle in Säugetier-Lunge untersucht werden, unter echten Bedingungen in vivo haben. Die Tatsache jedoch, dass ein solches System bisher nicht erfolgreich weist eindeutig auf die enormen Schwierigkeiten, die in die Einrichtung einer Arbeitsgruppe Protokoll gelöst werden müssen umgesetzt werden. Die größte Herausforderung ist wahrscheinlich Fokus Stabilität. Die Lunge als Organ für die Atmung ist unter ständiger Bewegung in allen drei Richtungen des Raumes, um ein Einatmen zu realisieren. Allein dieser Umstand führt zu schweren Imaging Probleme und kann als eine intravitale Imager &quot;Albtraum&quot; werden. Schon eine kleine Bewegung, jedes beliebige Maß im Raum hat eine massive Verschlechterung der Wirkung auf die mikroskopische Ansicht, die mit Mikrometer-Präzision stabil, um zu erzeugen aussagekräftige Bilder zeigen 9 benötigt. Aufgrund ihrer von Natur aus eng lokalen Fokus 10, 2-Photonen-Mikroskopie ist sogar noch empfindlicher auf Schwerpunkte Instabilitäten, wie eine Versetzung von einer bestimmten Struktur im Bereich von wenigen Mikrometern in der Z-Richtung entspricht einem vollständigen Verlust des Fokus und damit ein gescheitertes Experiment. Das Protokoll in dieser Studie für die Beobachtung von Immunzellen im murinen Lunge präsentiert ist noch nicht in vivo-Anwendung, sondern eine Annäherung an die Situation in einem funktionell intakten Lunge 11. Ex-vivo-Ansätze für die Bildgebung Lymphozyten, z. B. in explantierten Lymphknoten Knoten haben gezeigt, dass gleichwertige Ergebnisse wie mit echten in vivo-Beobachtungen 12 RENDITEOPT und sind daher von großer Bedeutung 5. Die in situ Beobachtungen in Lung Slices, die nur mit unserem Ansatz möglich, statt in einer infizierten Lunge kurz nach Exzision. Die 3D-Integrität während des Schneidens wird durch die Agarose-Matrix, ein wesentlicher Schritt, um eine genau kontrollierte Schneiden der Lunge ermöglichen gewährleistet. Obwohl es notwendig, die explantierten Lunge für einen kurzen Zeitraum zu einer Verfestigung der Agarose-Matrix erlauben cool ist, ist es möglich, in der Nähe von physiologischen Bedingungen für die Zellen nach dem Schneiden und Erwärmen des Gewebes zurück. Dies ist eindeutig durch unsere Daten, was bedeutet, dass unter diesen Bedingungen Neutrophilen sehr aktiv sind und zeigen ihr volles Potenzial als agile Fresszellen, die für die effektive Abfertigung eines Aspergillus fumigatus Infektion zu demonstrieren. Sie patrouillieren im Lungengewebe durch epitheliale Barrieren, um die inneren Teile der Alveolen zu erreichen und sie zudem aktiv aufgreifen Pilzsporen 11. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit war die Darstellung von Strukturen ähnlich Neutrophile extrazelluläre Traps (NETs) in der Aspergillus befallenen Organ. NETs sind eine sehr junge Feststellung eines neuen Abwehrmechanismus in Neutrophilen 13. Doch seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2004 hat die Zahl der physiologische oder pathologische Zustände in Tiermodellen oder Menschen, wo dieses Phänomen beobachtet worden ist oder fehlt, wurde explosionsartig steigenden 14-16. Interessanterweise, obwohl so viel Arbeit an diesen Strukturen wurde von so vielen verschiedenen Gruppen verbrachten, sind die meisten Berichte weiterhin auf einem sehr deskriptiven Ebene und nicht viel istbekannt über den Mechanismus der NET Version und ihrer Regulierung. Mit unserem Protokoll konnten wir zum ersten Mal auf NET-Fasern in einer infizierten Lunge zeigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, wie wichtig frisch rekrutierten neutrophilen Granulozyten sowie molekulare Pilzstrukturen für ihr Auftreten oder die Hemmung 11. Dies zeigt deutlich das Potenzial unserer Methode, um die einzelnen Schritte der NET-Bildung näher zu untersuchen. Man könnte denken, zum Beispiel an Neutrophile aus geeigneten knock-out Mäuse nutzen, um ihre Fähigkeit NET Bildung in Adoptiv-Transfer-Experimenten zu beobachten. Obwohl also die direkte Beobachtung der neutrophilen Zuwanderung aus dem peripheren Blut ist nicht mit diesem System aufgrund der mangelnden Blutversorgung nach Organentnahme möglich ist, wir immer noch glauben, dass unser Protokoll eine wertvolle und relativ leicht zu handhaben Ansatz, der die Darstellung von ermöglicht, ist früh oder zu spät Schritte in der Immunabwehr gegen Infektionen der Lunge. Dies ist daher ein wichtiger Schritt zur Erforschung dieses Phänomens in der Atmung Lunge von lebenden Tieren.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

Nach dem Magen-Darm-Trakt, ist die Lunge der zweitgrößten Fläche für die Interaktion zwischen den Wirbeltieren Körper und die Umwelt. Hier muss eine effektive Gasaustausch aufrechterhalten werden, während gleichzeitig die Vermeidung einer Infektion mit dem eine Vielzahl von Krankheitserregern, die während der normalen Atmung eingeatmet werden. Um dies zu erreichen, besteht eine hervorragende Reihe von Abwehrstrategien Kombination humoralen und zellulären Abwehrmechanismen. Eine der wirksamsten Maßnahmen für die akute Abwehr der Lunge ist die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten, die entweder phagozytieren die eingeatmete Erreger oder töten sie durch Freisetzung zytotoxischer Chemikalien. Eine aktuelle Ergänzung zum bestehenden Arsenal von Neutrophilen ist ihre explosive Freisetzung von extrazellulären DNA-NETs, ​​mit denen Bakterien oder Pilze verfangen oder inaktiviert werden auch nach dem Loslassen NET Zellen abgestorben sind. Wir stellen hier eine Methode, die man direkt beobachten Neutrophilen ermöglicht, die Migration in einem kürzlich infizierte Lunge, phagozytierenden pilzliche Erreger sowie Visualisierung der umfangreichen NETs, ​​dass sie in das infizierte Gewebe produziert haben. Die Methode beschreibt die Herstellung von dicken lebensfähig Lung Slices 7 Stunden nach intratrachealer Infektion von Mäusen mit Konidien des Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus und deren Prüfung durch multicolor Zeitraffer-2-Photonen-Mikroskopie. Dieser Ansatz erlaubt es, direkt zu untersuchen antimykotische Verteidigung in nativen Lungengewebe und eröffnet damit einen neuen Weg für die detaillierte Untersuchung der pulmonalen Immunität.

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K Aufrufe.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Serie: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrowelle Assisted Schnelle Diagnose von Plant Virus Erkrankungen durch Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Trennung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...