Special thanks to the personnel of the University of Georgia Health Center laboratory for their continuous support of our work on isolating human neutrophils. This work was supported by the start-up fund of Dr. Rada provided by UGA Office of Vice President for Research.

Die Institutional Review Board der University of Georgia genehmigt das menschliche Subjekt Studie peripheren Blut von gesunden Freiwilligen (UGA # 2012-10769-06) zu sammeln. 5,7,8 Freiwilligen unterzeichnet die erforderliche Einverständniserklärung vor der Blutentnahme. Die Forschung in diesem Artikel ausgeführt ist in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für die medizinische Forschung am Menschen von der Deklaration von Helsinki. 1. Isolierung von Neutrophilen aus peripherem menschlichem Blut (Figur 1) Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren. Das folgende Protokoll stellt eine Möglichkeit. Dieses Protokoll liefert eine große Anzahl von nicht-aktivierten menschlichen Neutrophilen der Lage NETs auf externe Stimulation freigesetzt wird. Verwenden Sie 40 ml Vollblut von gesunden Freiwilligen durch Venenpunktur. 7,9 <ol><li> Aliquotieren 20 ml Blut in zwei 50 ml konischen Röhrchen. 10 ml 6% Dextran. Vorsichtig mischen. </li><li> Nach 20 min Transfer der Leukozyten-rich obere Phase ohne pelle roten Blutkörperchen in saubere 50 ml konische Röhrchen nehmen, und füllen Sie es mit sterilem PBS auf. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg 10 min. Pellet in 4 ml sterilem PBS. </li><li> Bereiten Sie einen 5-stufigen Percollgradienten von 85% -80% -75% -70% -65% in zwei 15 ml konischen Röhrchen und Schicht 2 ml Leukozyten-Suspension auf der jeweils Gradienten. </li><li> Zentrifuge 800 × g für 30 min mit Bremsen aus. </li><li> Sammle alle Zellen (Neutrophile) in den Schichten an der 75% / 80% und 70% / 75% Schnittstelle. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (350 · g, 10 min, RT) und zählen Zellen eine Zählkammer. </li></ol> 2. Messung der Kinetik der extrazellulären DNA Veröffentlichung Mit Hilfe eines Mikroplatten-Fluorimeter Hinweis: Diese Methode ermöglicht die Messung von Veränderungen in der Fluoreszenz eines membran impermeable DNA-bindenden Farbstoff anzeigt DNA Freisetzung auf einer 96-Well - Mikrotiterplatten - Format (Abbildung 2). <ol><li> Eine Suspension von Neutrophilen in Testmedium (HBSS +1% (v / v) autologem Serum + 5 mM Glucose) bei einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; mol / L der Membran undurchlässig DNA-bindenden Farbstoff. Vorsichtig mischen. </li><li> Aliquotieren humanen Neutrophilen (50 &amp; mgr; l / Vertiefung) auf 96-Well-schwarz, transparenten Boden Mikrotiterplatten. Stellen Sie sicher, dass das Testmedium den gesamten Boden des Bohrlochs erstreckt. Wenn nicht, tippen Sie auf die Platte vorsichtig auf die Seite. </li><li> Warm up die Platte, die Neutrophile für 10 min bei 37 ° C. </li><li> In der Zwischenzeit werden die Lösungen von Reizen auf das Doppelte ihrer endgültigen Konzentrationen eingesetzt werden (in 37 ° C warmen Testmedium). Als ein positives Nettosteuer menschliche Neutrophilen mit 100 nM Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) für 4 Stunden nutzen , um eine maximale NET Freisetzung auslösen. 5,8 PMA - Stimulation für 4 Stunden sorgt für maximale NET Freisetzung während spontane NET Bildung niedrig 5,8 bleibt. </li><li> Bereiten Sie die Mikrotiterplatte Fluorimeter für die Messung (4 Stunden, 37 ° C, 530 nm zur Anregung und 590 nm für Emission). &lt;/ Li&gt; <li> Neutrophile stimuliert durch Zugabe von 50 &amp; mgr; l Reizlösung auf 50 ul Neutrophilen Suspensionen. Verwenden Sie 0,5 ug / ml Saponin in einem gut maximale DNA-Freigabesignal zu messen. </li><li> Legen Sie die Platte in Leser und messen Veränderungen in der Fluoreszenz für 4 Stunden bei jeder 2 min ohne Schütteln. </li><li> Für die Datenanalyse berechnen normalisierten Erhöhungen der Fluoreszenz über die Zeit. <ol><li> Subtract Fluoreszenzbasis von Endpunktwerte für alle Vertiefungen einschließlich Saponin (2A, B). Aufstieg in Saponin Fluoreszenz sollte das höchste Signal sein. Es wird als &quot;maximale DNA - Freigabe&quot; (2A) bezeichnet. </li><li> Berechnen Prozentsatz der DNA-Freisetzung in unbekannten Proben durch einen Anstieg der Fluoreszenz von unbekannten Proben durch maximale DNA-Freisetzung zu teilen. </li><li> Durchschnittliche Ergebnisse der Replikate und präsentieren sie als &quot;% der maximalen DNA - Release&quot; (Abbildung 2C). </li></ol></li></ol> 3. Die Quantifizierung von NET-Formularation von MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays Hinweis: Diese Assays modifiziert (MPO-DNA) oder etablierte (HNE-DNA) in unserem Labor NET Bildung Quantifizieren von Niveaus von MPO-DNA und HNE-DNA - Komplexe Messung 5. <ol><li> Mantel 96-well hohe Bindungskapazität ELISA-Platten über Nacht mit Fänger-Antikörper (50 &amp; mgr; l / Well): anti-MPO (1: 2000 Verdünnung) oder anti-HNE (1: 2000). </li><li> Wasch ELISA Platten dreimal mit PBS (200 ul / Vertiefung) und blockieren sie mit 5% BSA und 0,1% humanes Serumalbumin für 2 h bei RT (200 ul / Vertiefung). Wasche dreimal mit PBS. </li><li> Seed Neutrophilen auf 96-well Mikrotiterplatten in einer Dichte von 100.000 Zellen / Well in 100 &amp; mgr; l Assay-Medium und NET Bildung stimulieren. Inkubiere Zellen: 4 h 37 ° C. </li><li> Führen Sie eine begrenzte DNase-Verdau durch Zugabe von 2 U / ml DNase Neutrophilen Stände, mischen sie gut. Halten Sie diese bei RT. </li><li> Stoppen Sie die DNase nach 15 Minuten durch Zugabe von 11 &amp; mgr; l 25 mM EGTA (Endkonzentration 2,5 mM). Gut mischen. Sammeln Sie supernatants in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Proben bei 300 × g für 5 min bei RT loszuwerden Zelldebris zu werden. Bringen Sie ihre Stände in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie sie auf Eis, bis sie bereit. </li><li> Verwenden Sie einen aliquoten Teil einer zuvor hergestellten &quot;NET-Standard&quot;. Hinweis: Die NET-Standard ist eine Mischung aus DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten, die aus mindestens 5 verschiedenen, unabhängigen menschlichen Spendern. <ol><li> Um den gleichen Standard für eine lange Zeit, zu sammeln und ein großes Volumen an neutrophilen Stände von jedem einzelnen Spender aliquotieren. Sammeln zum Beispiel 2 ml DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten Neutrophilen werden in 200 Aliquots (10 ul jeweils) genug für 200 ELISA-Platten führen. Die Daten der NET - Standard kennzeichnen , sind in Abbildung 5 gefunden. </li><li> Stimulieren menschliche Neutrophilen mit 100 nM PMA für 4 Stunden und gelten DNase nach Schritten, um ihre Überstände verdauen 3,4-3,5. </li><li> Sammeln, Pool, Aliquot (10 ul) und kostenlosze (-20 ° C) neutrophil Überständen. </li><li> Zur Herstellung der &quot;NET-Standard&quot;, Tauwetter ein Aliquot / Spender aus mindestens fünf verschiedenen Spendern erhalten, mischen sie und halten sie auf dem Eis. </li><li> Entsorgen Sie aufgetauten Proben und frische für den nächsten Versuch verwenden. </li><li> Bereiten Sie eine 1: 2 serielle Verdünnung des NET-Standard in PBS + EGTA. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie DNase1-verdauten Proben (Standard und unbekannte Stände) 20-fach in PBS + EGTA und aliquotieren sie auf ELISA-Platten mit Fänger-Antikörper beschichtet. </li><li> Inkubieren ELISA-Platten über Nacht bei 4 ° C und waschen Sie sie dreimal mit PBS. </li><li> Bewerben Detektions-Antikörper-Lösung (100 &amp; mgr; l / Well): Meerrettich-Peroxidase-konjugierter anti-DNA-Antikörper (1: 500, Maus). Inkubieren für 1 Stunde in Dunkelheit. </li><li> Nach vier Waschungen mit PBS TMB Peroxidasesubstrat hinzufügen: 100 &amp; mgr; l / Vertiefung, 30 min. Blaue Färbung ist ein Indiz für die Peroxidase-Aktivität (NETs vorhanden). </li><li> Stop Reaktion durch Zugabe von 100 ul / Vertiefung 1 M HCl. Dasblau Lösungen gelb (5A) drehen. </li><li> Lesen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Photometer. </li><li> Für die Datenanalyse, die Berechnung der Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA-Komplexe im Vergleich zu dem NET-Standard. <ol><li> Ziehen Sie den Hintergrund Wert der optischen Dichte des Testmediums aus allen Proben. </li><li> Zeichnen Sie die Absorptionswerte (X-Achse) der verdünnten Standardproben gegen ihren Nettogehalt (Y-Achse) (5A). </li><li> Mit dem nicht gesättigten Bereich dieser Standardkurve eine Trendlinie etablieren (beste exponentielle Anpassung der Software verwendet wird ) (5A). Die Gleichung dieser Trendlinie bestimmt die Umwandlung von OD-Werte Mengen von NETs quantitativ. </li><li> Legen Sie die gemessenen OD - Werte der Unbekannten in den Trend-Linie Gleichung von 3.13.3, die die Menge von NETs in der unbekannten Probe als Prozentsatz des Netto-Standard (5A) geben wird. </li><li> BerechnenMittelwerte von Replikaten (dreifacher Ausführung) und die endgültigen Daten als &quot;Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA - Komplexe ( in % der Norm)&quot; (5C) präsentieren. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

NETs stellen eine faszinierende neuartige Mechanismus , durch den Erreger Neutrophilen töten. 1 Obwohl die Literatur von NETs hat den letzten zehn Jahren den Ausbau über kontinuierlich seit ihrer Entdeckung, einige wichtige Fragen zu ihrer Rolle im Zusammenhang mit der Biologie, Mechanik und Regelung unklar bleiben. Entsprechende Methodik entwickelt werden NETs zu messen, diese einzigartigen antimikrobiellen Mechanismus. Dieser Artikel beschreibt Verfahren, die verwendet werden können NETs in einem Hochdurchsatz Weise zu quantifizieren. Die erste Assay-Kinetik folgt der Fluoreszenz eines membran impermeable DNA-bindenden Farbstoff. Dieser Test liefert große Menge an Informationen über die Steigung und die Geschwindigkeit der DNA-Freisetzung aus neutrophilen Granulozyten. Diese Informationen sind in Untersuchungen entscheidend studieren frühen Signalereignisse zu NET Bildung führt. All diese Informationen werden in Endpunkt-Assays Messung DNA Freigabe am Ende der Inkubation verloren. Die extrazelluläre DNA-Farbstoff-basierten Test ist für NETs nicht spezifisch. Esnur misst DNA-Release. Um zu bestätigen, NETs ist es weithin Immunofluoreszenz auf NET-bildende Neutrophilen auszuführen angenommen und zeigen die Co-Lokalisierung von DNA entweder mit Granulat Marker (MPO, HNE) oder Histone. Die Quantifizierung der Immun Daten ist allerdings sehr mühsam und subjektiv. Hierbei wird eine Modifikation eines zuvor entwickelten ELISA-Assay-Erfassungs MPO-DNA-Komplexe dargestellt. Ein ähnliches ELISA - Assay Mess HNE-DNA - Komplexe , die spezifische NET Maßnahmen darstellen , wird ebenfalls beschrieben. 3,5 Beide Assays sind in der detaillierten charakterisiert. 5 Die MPO-DNA und DNA HNE-ELISA - Assays sind quantitative und netzspezifische zugleich von einem anderen aktuellen Verfahren. 5 sind diese Funktionen nicht erfüllt. Die Tests sind einfach durchzuführen und reproduzierbare Daten zur Verfügung stellen. 5 eine begrenzte DNase Verdauungsschritt ist im Preis enthalten , die direkt auf Neutrophilen schnelle und standardisierte Handhabung von NETs gewährleistet. 5 Diese Tests eignen sich für den commehrere Proben zur gleichen Zeit pare. In neuen, Kontrollmessungen ist es, dass Frost / Tau-Zyklen und Proteasen wirken sich nicht auf das Ergebnis der MPO-DNA und HNE-DNA-Tests gezeigt. Es ist nicht bekannt, aber, ob bekannte Proteine ​​in NETs an DNA zu binden (einschließlich Histonen und LL-37) 1,11 würden mit diesen Assays interferieren. Kritischen Schritte der dargestellten Protokolle sind die folgenden. Es ist wichtig, Neutrophile zu ernten, die in einem ruhenden, Ruhezustand sind und nicht loslassen große Menge an NETs spontan. Fehlen einer hypotonischen Lyse der roten Blutzellen in dem dargestellten neutrophil Isolierungsprotokoll zu entfernen, ist entscheidend, nicht aktivierten Neutrophilen zu erhalten. Zur Aktivierung von Neutrophilen hemmen nach hatten die Zellen gereinigt wurde, ist es auch wichtig, Neutrophile in einem Medium zu resuspendieren ihre Donator eigenen Serum enthält. Zur Erzielung ruhenden Zellen ist es auch entscheidend, pyrogen- und kontaminationsfreie Reagenzien während der Neutrophilen Zubereitung zu verwenden. SPONTAzeitige NET Freisetzung von neutrophilen Granulozyten während der extrazellulären DNA-Freisetzungstest könnte auch passieren. Zugabe von 1% autologem Serum zu dem Testmedium ist wichtig, um es zu verhindern. Höhere oder niedrigere Dosen des autologem Serum konnte um optimale Ergebnisse zu erhalten, werden getestet. Es ist wichtig, während der MPO-DNA und DNA HNE-ELISA-Assays, die DNA freigesetzt sollte nicht durch die DNase Über verdaut, weil es zu einem vollständigen Verlust des Signals führen. Daher sollte die optimale Dosis für jede neue DNase Charge bestimmt werden. Die Parameter der DNA Verdau leicht verändert werden könnte, die höchste ELISA-Signale möglich zu erhalten. Es ist auch wichtig, die DNase und NETs gründlich zu mischen, um sicherzustellen, dass die DNase übersichtlichen Zugriff auf die DNA haben. Wenn die verdaute NETs Ernte, waschen Sie die gut ausgiebig alle NETs zu sammeln. Die DNA - Nachweisgrenze der MPO-DNA und DNA-HNE - Assays ist etwa 10-20 ng / ml DNA (5B). Serum und Plasma-freie DNA-Spiegel von Several hundert bis tausend ng / ml wurden in Krankheiten (Krebs, systemischer Lupus erythematosus, myocardial Infektion) berichtet , die mit abnormal NET Bildung verbunden sind. 12-14 Dies legt nahe , dass die MPO-DNA und DNA HNE-ELISA - Assays haben auch das Potential , in der Lage sein NETs in humanen klinischen Proben zu quantifizieren. Diese künftige Anwendung der MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays ermöglichen wird, Pathogenese der Erkrankung quantitativ NETs zu verknüpfen.

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.1 The core of NETs is nuclear DNA.1 This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.1 The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.2 NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release. 
Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.1 Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.1 MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.2 NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).6 Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.6
Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human Neutrophil Elastase&#160; Rabbit Ab&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>481001</td>
			<td>1:2000X coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-496</td>
			<td>1:2000X coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-104-159-001</td>
			<td>1ug/ml used for digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mM EGTA/ PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM EGTA/PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell death detection ELISA Anti-DNA POD</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11544675001</td>
			<td>1:500X&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eon Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 All-in-One microplate software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>analytical tool (ELISA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox orange</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>S11368</td>
			<td>0.2% final concentration/volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Hepes</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>Use 10 mM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Use 5 mM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8139</td>
			<td>100nM final used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (pH 8.5-9.5)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 1644</td>
			<td>Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>D1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well assay plate black plate clear bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput measurement of extracellular dna release and quantitative net formation in human neutrophils in vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Die Zahlen in diesem Manuskript die Methode der Neutrophilen - Isolierung, experimentelle Verfahren beschreiben und präsentieren repräsentative Ergebnisse mit Erklärung der Datenanalyse. Abbildung 1 die aufeinanderfolgenden Schritte der humanen neutrophilen Vorbereitung zeigt. Dieses Protokoll stellt nur eine mögliche Art der Neutrophilen-Isolation. Es ergibt große Mengen an Neutrophilen freisetzen kann , NETs bei Stimulierung ruht. 2 zeigt , wie die Fluoreszenz-basierte DNA - Freisetzungs - Assay funktioniert. Ein Fluoreszenz - Mikroplattenlese Kinetik der DNA - Freisetzung Verwendung in humanen Neutrophilen in gefolgt sind 96-Well Mikrotiterplatten. Abbildung 3 erklärt jeden Schritt der Datenanalyse. Zuerst berechnen maximale DNA - Signal in Neutrophilen mit Saponin (3A) behandelt. Zunahme der Fluoreszenz wird als die Differenz zwischen dem höchsten Fluoreszenzwert und dem Hintergrundfluoreszenzniveau immer berechnet ( <strong&gt; 3A). Dies wird für jede Vertiefung berechnet. Das Beispiel zeigt repräsentative Daten von humanen Neutrophilen links nicht-stimulierten oder mit PMA oder P. aktiviert aeruginosa (PAO1) (3B). P. aeruginosa löst NET Bildung in humanen PMNs. 5,8,10 Es wurde mit mehreren P. gezeigt aeruginosa - Stämme einschließlich PAO1 , die Bakterien allein (ohne Neutrophile) nicht über die verwendeten DNA-Detektion Farbstoff binden. 8 PAO1 P. aeruginosa wurde von ATCC, gezüchtet in Luria-Bertani - Medium über Nacht erhalten wurde , geerntet in der späten exponentiellen Phase, in Assay - Medium gewaschen und verwendet Neutrophilen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 zu stimulieren: 1 (3B, C, 4B, C). Durchschnittswerte der Anstieg der Fluoreszenz von Wiederholungsvertiefungen berechnet werden , normiert auf die maximale Fluoreszenz (Saponin) und werden als &quot;DNA - Freisetzung (% der max)&quot; (3C) ausgedrückt. 3D zeigt repräsentative fluoreszenz Bilder von unbehandeltem oder PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten. Figur 4A zeigt das Schema zur Erläuterung der Prinzipien der MPO-DNA und DNA HNE-ELISA - Assays. 4B zeigt repräsentative Immunofluoreszenz Bilder von nicht stimulierten, PMA- und PAO1-aktivierte menschliche Neutrophile. Die extrazelluläre DNA zeigt typische NET Morphologie und Co-lokalisiert mit MPO und citrullinated Histon H4, ein Marker für NET - Bildung. 6 4C zeigt MPO-DNA und HNE-DNA Freisetzung in humanen Neutrophilen unter den gleichen, vorstehenden Bedingungen (wie in Abbildung 3B, 3C und 4B). IThe &quot;NET&quot; ELISA Methoden bisher charakterisiert wurden. 5 kurz, 2 U / ml DNase - Behandlung (Äquivalent von 1 &amp; mgr; g / ml Konzentration der DNase verwendet) für 15 min bei RT ergab den höchsten MPO-DNA und HNE-DNA Signale . 5 Laufproben ergab (100 ng / Spur) auf einem Agarose - Gel , das DNA - Längein den unteren Bereich kb Ausbeuten optimal ELISA - Signal. 5 DNA overdigestion (DNase Dosis von mehr als 20 U / ml) oder entweder die Erfassung oder der Nachweis - Antikörper Weglassen der ELISA - Signale abgeschafft. 5 Darüber hinaus werden hier die Tests und die &quot;NET- Standard&quot; sind weiter charakterisiert (5A). Die NET-Standard enthält durchschnittlich 19,5 ug / ml extrazelluläre DNA (gemessen durch einen Standard mit bekannten DNA-Konzentrationen verwendet wird), 399 ng / ml MPO und 103,4 ng / ml HNE (Handels ELISAkits) (n = 8). Bezogen auf die gesamten Molekulargewichte von MPO (84 kDa) und HNE (29,5 kDa) und der Tatsache , dass 1 &amp; mgr; g DNA 9.91 x 10 14 Nucleotide enthält, enthält der NET-Standard 109 HNE - Moleküle und 147 MPO - Moleküle pro 1.000 Nukleotiden (kb DNA ). Zweifache Reihenverdünnungsexperimente des NET-Standard ergab, daß die dynamischen Bereiche sowohl der MPO-DNA und DNA HNE-ELISA-Assays sind zwischen 19,0 bis 609,0 ng /ml DNA - Konzentrationen (5B). Verdünnungen von weniger als 32-fache des NET - Standard in der Sättigung führte während Verdünnungen von mehr als 1.024-fach vom Hintergrund nicht anders waren (5B). Die Behandlung des NET - Standard mit Proteasehemmern nicht geändert hat seine durch die MPO-DNA und HNE-DNA - Assays erhaltenen Ergebnisse darauf hinweist , dass Proteasen nicht stören diesen Assays (5C). Somit erzielten Ergebnisse in der gleichen NET-Standardprobe durch die MPO-DNA oder DNA-HNE - ELISA - Assays stark miteinander (5D) korrelieren. Um zu zeigen, dass gefrorene PMN Stände können auch in diesen Assays verwendet werden, ohne die Effizienz zu verlieren, einige Proben der NET-Standard wurden unbehandelt gelassen oder andere ausgesetzt waren ein oder zwei Frost / Tau-Zyklen bei -20 ° C oder -80 ° C (1 Std Intervall). Keiner der Frost / Tau - Behandlungen betroffen , die MPO-DNA oder HNE-DNA Ergebnisse (5E). Zusammenfassend ist dieNET-Standard stellt einen zuverlässigen Bezugspunkt in dieser NET-Quantifizierung von Assays, die die quantitativen Vergleich des Nettoergebnisses zwischen unabhängigen Experimenten zu ermöglichen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig1.jpg" /> Abb . 1: Isolierung von Human - Neutrophilen Neutrophile Granulozyten wurden aus dem peripheren Blut von Freiwilligen isoliert nach dem beschriebenen Protokoll. Es wurde Blut enthält Antikoagulans verwendet Neutrophilen durch Dextransedimentation und Gradientenzentrifugation zu isolieren. Blut ohne Antikoagulans wurde verwendet, Serum herzustellen. Viabilität der Neutrophilen Zubereitungen wird durch Trypanblau-Ausschluss-Assay beurteilt. Neutrophile Reinheit von Cytospin bewertet wird oder Durchflusszytometrie (CD16, CD66abcd doppelt positiven Zellen). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Prinzipien der extrazellulären DNA - Freisetzungstest (A) Fluoreszenz wird nur in Neutrophilen , deren Plasma und Kernmembranen erhalten haben , beeinträchtigt wurde und die Membran-undurchlässige DNA-bindenden Farbstoff können , um ihre DNA binden. (B) Der Test auf schwarze 96-Loch durchgeführt wird , eine Mikrotiterplatte fluorimeter Mikrotiterplatten verwenden. (C) Das Fluorimeter zeichnet Echtzeit - Fluoreszenz - Kurven in jeder Vertiefung. Eine repräsentative Ergebnisse gezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Analyse der DNA- Profil- Daten (. <strong&gt; A) Saponin wird verwendet , um den maximalen Wert zu schaffen , da sie völlig Neutrophilen und setzt ihre DNA lysiert. Die Kinetik der Saponin-induzierter Fluoreszenz gezeigt. (B) Kinetik der Freisetzung neutrophiler DNA induziert durch PMA (100 nM) und Bakterien (Pseudomonas aeruginosa PAO1, 10 MOI). (C) Normalized zusammengefassten Daten DNA Freisetzung in einem Experimenten unter Verwendung quadriplicates. (D) Repräsentative Fluoreszenzbilder von unbehandelten und humanen Neutrophilen (Sytox orange, 4 - stündiger Inkubation)-PMA stimuliert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig4.jpg" /> Abbildung 4: MPO-DNA und HNE-DNA - ELISA - Assays. Prinzip und Repräsentative Ergebnisse (A) Schema erklärening, wie die MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays Arbeit. (B) Repräsentative Ergebnisse der Immun Bilder vorbereitet auf die menschliche zu 100 nM PMA ausgesetzt Neutrophilen oder P. aeruginosa PAO1 Stamm (10 MOI) für 4 Stunden. Die extrazelluläre DNA (DAPI, blau) co-lokalisiert in NETs mit MPO (grün) und citrullinated Histon H4 (rot). Ein repräsentatives Ergebnis, n = 3 (C) NET - Freisetzung wurde in menschlichen Neutrophilen ausgesetzt gemessen auf die gleichen Reize wie oben durch die MPO-DNA und HNE-DNA - ELISA - Assays. Mittelwert ± SEM, n = 3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig5.jpg" /> Abbildung 5: Charakterisierung der &quot;NET-Standard&quot; (A) Reihenverdünnungen. (1: 2) des NET - Standard hergestelltund bei MPO-DNA-ELISA unterzogen. Gemessen OD-Werte werden gegen% der NET-Standard-Content aufgetragen. Rot &quot;X&quot; zeigt eine gemessene OD-Wert einer unbekannten Probe. Grauer Pfeil zeigt an, wie die &quot;NET Konzentration&quot; (blau &quot;X&quot;) der unbekannten Probe bestimmt werden soll, die zentrale Bereich der angepassten Standardkurve. (B) DNA - Konzentrationen in Reihe verdünnt NET-Standardproben wurden bestimmt und aufgetragen gegen den gemessenen OD - Werte der MPO-DNA oder HNE-DNA - ELISA - Assays. Graue Bereiche kennzeichnen die dynamischen Bereiche der Assays. (C) Protease - Inhibitor - Behandlung (Protease - Inhibitor - Cocktail, 1%) hat keinen Einfluss auf das Ergebnis der MPO-DNA oder HNE-DNA - Assays (NET-Standard). Mittelwert ± SEM, n = 2 (D) Korrelation von MPO-DNA und HNE-DNA Ergebnisse (OD 450 nm) von seriell verdünnt &quot;NET-Standard&quot; Proben in ihrer dynamischen Bereiche (siehe 5B). (E) Einfrieren und Auftauzyklen (-20 ° C oder -80 ° C; one oder zwei) haben keinen Einfluss auf die Ergebnisse der MPO-DNA und HNE-DNA - Assays (NET-Standard, Mittelwert ± SEM, n = 2). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

13.0K Aufrufe.  University of Georgia. High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Serie: High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...