Die Veröffentlichung dieses Artikels wurde durch einen Zuschuss aus dem Office of Research an der University of Tennessee unterstützt. Die Autoren danken der vorherigen Generation von Studenten und Forschern, die daran gearbeitet, diese Verfahren zu verfeinern können. Forschung wurde durch Zuschüsse der National Science Foundation (NSF-0851113, NSF-0825405 und NSF-0550485) unterstützt.

1. Ultrafiltration von Meerwasser zu &quot;Virus-free&quot; Water (Wilhelm &amp; Poorvin 2001) generieren <ol><li> Etwa 20L Meerwasser / Seewasser ist aseptisch wie möglich gesammelt werden. </li><li> Wasser ist seriell über 142-mm Polycarbonat 0,8 um Filter, die bei -20 ° C für Community-Analyse aufbewahrt werden kann vorgefiltert. Größere Porengröße Filter können vor diesem Schritt für sehr produktiv eingesetzt werden. </li><li> Um ultrafiltriertes Wasser aus einem Amicon M12-System (Millipore) ein 30 kDa-Cutoff-Spirale Patrone verwendet, um alle Viren auszuschließen ist, auch kleine RNA-Viren. </li><li> Die Proben werden aufbereitet und konzentriert bei ~ 25% Geschwindigkeit, mit ~ 15-16 kPa der Gegendruck. </li><li> Die restlichen Stichprobe von ca. 500 ml Wasser wird eine konzentrierte Virus Gemeinde (die auch für andere Experimente gespeichert werden), während die restlichen 19,5 l von Virus-freies Wasser wird für die virale Produktion Assays verwendet werden enthalten. </li><li> Nach jedem Tag verwenden, muss der Amicon M12-System gereinigt werden, um Schäden an der Membran der Filterkartusche zu verhindern. </li><li> Wenn Sie mit Meerwasser arbeiten, spülen Sie die Membran mit mindestens 6L von Milli-Q Wasser, gefolgt von einem Waschen mit 0,1 N NaOH-Lösung für 30-45 Minuten. </li><li> Wieder spülen Sie die Kartusche mit mindestens 6L von Milli-Q Wasser. </li><li> Wenn Sie fertig sind mit dem M12-System, sollte die Spirale Patrone in einem 0.05MH 3 PO 4-Lösung bei 4 ° C gelagert werden </li></ol> 2. Virus Reduction Method für Viral Production (Wilhelm et al. 2002) <ol><li> Bis zu 500 mL des Meerwassers / Seewasser Probe mit Host-und Viren gewonnen und in einem sterifilter Gerät mit einem 0,2-um nominal Porengröße niedrigen Protein-bindenden Filter (zB Durapore) auf ihn gesetzt. </li><li> Die Probe wird vorsichtig auf &lt;200 mmHg Druck Vakuum während kontinuierlich Resuspendieren der Probe mit einer sterilen Transferpipette um bakterielle Zellen, die aus der Konzentration auf den Filter zu hemmen. </li><li> Langsam drei Bände Ultrafiltrat sind die Bakteriensuspension hinzugefügt, um deutlich zu reduzieren die Anzahl der freien Viren in der Probe. </li><li> Die bakterielle Fraktion wird auf 500 ml mit Virus-freies Wasser verdünnt und gliedert sich in drei Wiederholungen von je 150 ml und sind in klar 250ml Polycarbonat-Flaschen gelegt. </li></ol> 3. Tangential Flow Filtration (TFF)-Methode für Viral Production (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005) TFF stellt einen alternativen Ansatz zur viralen Abbau-Methode. <ol><li> Etwa 500 ml natürlichen Probe gesammelt, wie oben beschrieben. </li><li> Diese Probe wird konzentriert mit einem 0,2-um nominal Porengröße Tangentialflussfiltration System. </li><li> Wenn die bakterielle Fraktion auf ca. 10-15 ml reduziert ist, wird ultrafiltriert, Virus-freies Wasser aufgenommen und verteilt wie oben. </li><li> Die Parallelproben Flaschen sind bei in-situ-Bedingungen mit Klimakammern inkubiert. <ol><li> Lichtverhältnisse sind Oberflächenbeschaffenheit mit blau getöntem Acryl-oder Plexiglas mit Screening-net, um die Lichtintensität zu verringern verändert. </li><li> Ambient Oberflächentemperaturen sind oft durch eine fließende Meerwasser Deck Inkubator erhalten. </li></ol></li><li> Beispiele für bakterielle und virale Schätzungen sind zur Zeit 0 mit einer Endkonzentration von 2,0-2,5% sterile Glutaraldehyd in Kryoröhrchen hinzu genommen. Diese Proben werden sofort mit flüssigem Stickstoff eingefroren Blitz und tiefgefroren gelagert bis zur Verarbeitung. <ol><li> Wenn flüssigem Stickstoff ist nicht verfügbar, kann Objektträger vorbereitet und sofort verarbeitet (siehe weiter unten) </li></ol></li><li> Teilproben sind alle 2,5 Stunden für mindestens 10 Stunden gesammelt durch die oben beschriebene Methode. <ol><li> In dieser Zeit kann Wasser für die quantitative PCR-Analyse gesammelt werden. Bis zu 5 ml der Probe kann zu einem Kryoröhrchen ohne Fixiermittel mit sofortiger Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff hinzugefügt werden. </li></ol></li></ol> 4. Viral Produktion Microscopy (Noble &amp; Fuhrman 1998, Wen et al. 2004) <ol><li> Eingefrorene Proben zu 0,02-um für die Mikroskopie gefiltert werden sollten, auf Eis aufgetaut werden. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von SYBR Green durch Verdünnen der Stammlösung 1:10 mit sterilem Wasser. Als nächstes wird aus der Stammlösung, bereiten eine funktionierende Lösung durch Zugabe von 1 ml der Stammlösung auf 39 ml sterilem Wasser. Eine 50% Glycerin, gepufferte 50% Phosphat Salzlösungen (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) und frische 2,5% Stammlösung von p-Phenylendiamin sollte auch vor Beginn vorbereitet werden. Halten Sie die 50% glycerol/50% PBS-Lösung bei 4 ° C und die p-phenylenediamine Lager bei -20 ° C im Dunkeln bis zum Start. Rechts vor dem Filtern hinzufügen p-Phenylendiamin, die 50% glycerol/50% PBS auf eine Endkonzentration von 0,1% als Antifade Lösung eingesetzt werden. </li><li> Legen Sie eine 25 mm 0,02-um Anodisc Filter auf einem 0,45-um MicronStep, Zellulose Zusatzfilter. Add 850 ul der festen Probe auf der Oberseite des Anodisc und Vakuum bei 20 pKa, bis sie vollständig getrocknet. Legen Sie 100 ul SYBR Green funktionierende Lösung zu einer sterilen Petrischale und mit dem Vakuum noch auf, entfernen Sie vorsichtig die Anodisc aus dem Filter Turm und auf dem SYBR Green. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Filter von der SYBR Green-Lösung und Docht der Rückseite des Filters mit einem Kimwipe um alle restlichen Farbstoff zu entfernen. Falls gewünscht, geben Sie den Filter auf den Turm und passieren bis zu 800 ul von 0,02-um gefiltertes Wasser oder sterile Medien durch den Filter zu spülen überschüssige Fleck. </li><li> Fügen Sie einen kleinen Tropfen Antifade Lösung auf einen Objektträger und legen Sie ein Deckglas auf. Entfernen Sie das Deckglas und fügen Sie die getrockneten Filter auf den Objektträger mit dem nassen Antifade Lösung. Auch eine kleine Menge von Antifade Lösung für das Deckglas und langsam setzen Sie ihn auf dem Filter, so dass Sie keine loszuwerden Blasen bilden können. </li><li> Unmittelbar Einfrieren der Objektträger bei -20 ° C bis zum Gebrauch (diese innerhalb von wenigen Monaten verwendet werden sollten, um zu verhindern Ausbleichen und senkte Virus zählt) </li><li> Viren sind aufgezählt mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (in unserem Fall eine Leica DMRXA Mikroskop) mit einem breiten blauen Filter-Set (λ Ex = 450 bis 490 nm, λ Em = 510 nm mit einem Entstörfilter bei λ = 510 nm). Jeder Filter wird mindestens 20 Gesichtsfelder gezählt, so dass Sie insgesamt Viren aus jedem Feld Grid zu quantifizieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Viren über die Filtermembran zu gewährleisten. </li><li> Gemittelte Raten von Virus Wiederauftreten von den drei unabhängigen repliziert werden dann berechnet und eine Standardabweichung von der Produktionsrate bestimmt. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Rohdaten des Forschers gesammelt erfordert nur minimale mathematische Verarbeitung, um eine Rückkehr Raten von Virus Fülle zu erzeugen. Der primäre Datensatz aus dieser Studie ist die Wiederholung Raten von Virus Fülle in der Teilproben aus den Inkubationen. Diese Ergebnisse bilden unabhängige Regressionen von Virus Fülle vs Zeit für jede der Proben. Für jede Probe die einzelnen Inkubationen als eine Behandlung zu handeln, so durch Ausfüllen drei Wiederholungskäfige-Inkubationen der Forscher können Preise sowie eine Schätzung der Variation (z. B. Standardabweichung) (siehe Abbildung 1). Berechnen Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Reduktion der Virus-Hülle und Fülle unveränderlich zu einer Reduktion in den Wirtszellen in der Probe, die das Virus tragen Last werden, führt. Zum Ausgleich dieses Verlustes Aufzählung der bakteriellen Hülle und Fülle sowohl von der Quelle (ungefilterte Meerwasser oder Seewasser) und T = 0 Inkubation Probe notwendig sind. Diese Informationen können zur Berücksichtigung der Anteil der Zellen verloren verwendet werden: Unter der Annahme, dass der Prozess der Verringerung Virus Fülle nicht selektiv für oder gegen alle Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft, dieser Faktor kann dann verwendet werden, um die in-situ-Erzeugung von Viren zu schätzen . <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Produktion von Virus-ähnlichen Partikeln über einen 10 Stunden Inkubation bei in-situ-Bedingungen mit Epifluoreszenzmikroskopie. Die Proben wurden während einer Phytoplankton gesammelt blühen vor der Küste von Neuseeland im September 2008. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Workflow-Prozess zur Bestimmung Virus-Produktion. Der Prozess beginnt mit der Ultrafiltration von Wasser auf Probe Virus-freies Wasser zu erzeugen. Dies ist fertig mit einer Ultrafiltrationsanlage. In parallel Wasserproben aus dem gleichen Ort und die freie Viren durch einen Filter geleitet gesammelt, während der mikrobiellen Gemeinschaft (mit einer Mischung von infizierten und nicht infizierten Zellen) wird beibehalten. Diese Gemeinschaft wird dann in das Virus freies Wasser resuspendiert und unter in situ Bedingungen. Die Wiederholung von Viren wird dann für die nächsten 10 Stunden überwacht werden, um Raten von Virus-Produktion zu bestimmen.

<ol>
	<li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean.">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li><li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria:+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter.">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems.">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li><li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+of+Fe+and+its+bioavailability+to+marine+plankton.">Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton.</a> Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 .</li><li>Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constraints+on+virus+production+in+the+Sargasso+Sea+and+North+Atlantic.">Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic.</a> Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+prokaryotic+viruses.">Ecology of prokaryotic viruses.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).</li><li>Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency,+size+and+distribution+of+bacteriophages+in+different+marine+morphotypes.">Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes.</a> Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).</li><li>Weinbauer, M. G., Winter, C., H&amp;ouml, f. l. e., G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities.">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li><li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy.">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li><li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dilution+technique+for+the+direct+measurement+of+viral+production:+a+comparison+in+stratified+and+tidally+mixed+coastal+waters.">A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters.</a> Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).</li><li>Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+and+marine+virioplankton:+a+brief+overview+of+commonalities+and+differences.">Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences.</a> Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).</li><li>Wilhelm, S. W., Poorvin, L., Paul, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantification of algal viruses in marine samples. , 53-66 (2001).</li><li>Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+and+nutrient+cycles+in+the+sea.">Viruses and nutrient cycles in the sea.</a> Bioscience. 49, 781-788 (1999).</li><li>Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sunlight+in+the+removal+and+repair+of+viruses+in+the+sea.">The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea.</a> Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).</li><li>Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+diafiltration:+an+improved+technique+for+estimation+of+virioplankton+production.">Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).</li></ol>

Eine kritische Komponente in das Verständnis, wie Viren marinen mikrobiellen Gemeinschaften Einfluss auf die Rate, mit der Viruspartikel produziert bestimmen. Da die Häufigkeiten sind (mehr oder weniger) statischen in den meisten Systemen (Wilhelm &amp; Suttle 1999, Weinbauer 2004), und die Viren werden entfernt oder erbrachten nicht-infektiösen schnell in aquatischen Systemen (Wilhelm et al. 1998), dann Produktionsraten werden muss relativen schnellen zu ersetzen verloren Partikel. Die Schätzung der Sterblichkeit Viren verursachen, um die mikrobielle Gemeinschaft erfordert ein Wissen darüber, wie viele Viren sind jedes Mal ein Virus Lyse einer Zelle (&quot;burst size&quot;) produziert. Virus Burst Größen in natürlichen Proben kann stark variieren. Burst Größen können direkt durch Transmissionselektronenmikroskopie (zB Weinbauer &amp; Peduzzi 1994) ermittelt werden, aber das ist oft über die Fähigkeiten eines bestimmten Labor oder nicht immer praktisch. In Situationen, in denen sie nicht empirisch ermittelt werden können, kann der Literatur Werte von 24 Viren pro lytische Veranstaltung für marine Systeme und 34 für Süßwasser-Systemen verwendet werden (Parada et al. 2006). Wenn die Rate der Virus-Produktion durch diese Zahl geteilt wird, ist das Ergebnis der Fülle der Zellen pro Volumen, die durch Viren auf einer täglichen Basis zerstört. Die Mikroben lysiert Wert kann dann durch die ständigen Bestand von bakteriellen Überfluss führt das Virus induzierte Mortalität für das System in Frage unterteilt werden: die bestehenden Schätzungen reichen von wenigen Prozent auf fast der gesamten Bevölkerung und sind oft abhängig von anderen Faktoren in das System in Frage (Wilhelm &amp; Matteson 2008). Um zu bestimmen, der Anteil der Gesamtmortalität diese Zahl wird oft von zwei (Arbeitstitel von der Annahme aus, dass 50% der Zellen weiter zu vervielfältigen und zu 50% der Zellen gehen verloren, Weinbauer 2004) multipliziert. Da die Nährstoff-und Spurenelement Bioverfügbarkeit (zB N, P, Fe) kann die Rate der primären Produktivität zu begrenzen, und als solche Kohlenstoffflusses durch aquatischen Systemen, und das Verständnis der Rolle von Viren-driven mikrobielle Sterblichkeit in diesem Prozess hat sich von Interesse für marine Geochemiker. Mehrere Schätzungen gibt es heute darauf hindeuten, Viren Freisetzung eine signifikante Konzentrationen von Nährstoffen zurück in die Wassersäule auf einer täglichen Basis (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) und dass diese Elemente sind schnell durch die mikrobielle Gemeinschaft assimiliert (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Die Rate der Nährstoff-Fluss in die Umwelt kann durch Multiplikation der Anzahl der Zellen durch die Menge an Nährstoffen pro Zelle (bezeichnet &quot;Quoten&quot;) zerstört bestimmt werden. Diese Informationen können eine wichtige Komponente, um unser Verständnis, wie mikrobielle Nahrungsnetze Funktion in aquatischen Systemen. Laufende Entwicklungen: Die gegenwärtigen Bemühungen durch eine Reihe von Arbeitsgruppen beinhalten die Anpassung der oben genannten Strategie auf spezifische Viren innerhalb der Gemeinde aufzählen und als solche zu bestimmen, wie bestimmte Organismen durch Virus-Aktivität beeinflusst werden. Dazu nutzen die Forscher quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), um die Fülle von spezifischen Viren Gruppen oder Familien in parallel Schätzung an die Schätzungen der Gesamtkosten der Virus-Community. Die Ergebnisse werden dann direkt angewendet Schätzungen des Virus Sterblichkeit, Nährstoffhaushalt, etc für bestimmte Plankton Gruppen. Diese leistungsstarke neue Ansatz erlaubt es den Forschern in den kommenden Jahren viel tiefer graben in die Prozesse mit der Ökologie von Viren assoziiert, und zum ersten Mal, um die Wechselwirkungen von spezifischen Virus-Wirt-Gemeinden außerhalb der Grenzen des Labor-Systeme zu quantifizieren.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2.5% p-phenylenediamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>130575000</td>
<td>Stock for Antifade</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon Proflux M12 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>N/A</td>
<td>Any ultrafiltration device may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>SYBR Green I nucleic acid gel stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helicon S10 30kDa Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>CDUF010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pelicon XL filters 0.22 &mu;m</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>PXGVPPC50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE 0.2 &mu;m PCTE membrane filters (47mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-732-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>XX42LSS11</td>
<td>Other TFF systems may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>0.45 &mu;m Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>E04WP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE Whatman 0.02 &mu;m Anodisc filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>68-09-6002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leica DMRXA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>20L polycarbonate carboys</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP229-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP329-500, S640-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G151-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-71</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-74</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td> 85% H3PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A242-212</td>
<td>Spiral Membrane storage</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH pellets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S318-3</td>
<td>M12 cleaning</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated Cylinders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore 0.8-&mu;m pore-size membrane filter (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ATTP14250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>YY30 090 00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

estimating virus production rates in aquatic systems

Viren sind allgegenwärtig Komponenten von Meeres-und Süßwasser-Systemen und sind dafür bekannt, entscheidende Akteure für mikrobielle Sterblichkeit. Entwicklung von quantitativen Schätzungen dieses Prozesses ist entscheidend, wie wir dann entwickeln kann bessere Modelle von mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Funktion sowie unser Verständnis davon, wie Viren Arbeit für Wasserorganismen biogeochemischen Kreisläufe verändern. Das Virus Reduzierung Technik ermöglicht es den Forschern, die Geschwindigkeit, mit der Viruspartikel aus der endemischen mikrobiellen Gemeinschaft freigegeben werden, zu schätzen. Kurz gesagt, ist die Fülle von freien (extrazellulären) Viren in einer Probe reduziert, während der mikrobiellen Gemeinschaft in der Nähe von Umgebungs-Konzentration aufrechterhalten wird. Die mikrobielle Gemeinschaft wird dann in der Abwesenheit von freien Viren und die Geschwindigkeit, mit der Viren wiederholen in der Probe (durch die Lyse von bereits infizierten Mitgliedern der Gemeinschaft) kann durch Epifluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden oder, im Falle von bestimmten Viren, quantitative inkubiert PCR. Diese Preise können dann verwendet werden, um die Rate der mikrobiellen Sterblichkeit aufgrund von Virus-vermittelten Zell-Lyse zu schätzen.

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Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Die Fluktuationsrate von Viren in Meer-und Süßwasser-Systeme können durch eine Reduktion und Wiederholung Technik geschätzt werden. Die Daten können die Forscher Raten von Virus-vermittelte mikrobielle Sterblichkeit in aquatischen Systemen zu schließen.

Die Schätzung Virus Produktionsraten in aquatischen Systemen

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

estimating-virus-production-rates-in-aquatic-systems

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.6K Aufrufe.  University of Tennessee. Die Fluktuationsrate von Viren in Meer-und Süßwasser-Systeme können durch eine Reduktion und Wiederholung Technik geschätzt werden. Die Daten können die Forscher Raten von Virus-vermittelte mikrobielle Sterblichkeit in aquatischen Systemen zu schließen.

Serie: Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Messung spezieller mycobakterieller Mistranslation-Raten mit Funktionsfunktionen

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...