Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01-HL87290, R01-HL87290-S1 und R01-AI082610 von den National Institutes of Health, um LJMC unterstützt.

1. Kraniotomie Ein Kraniotomie in 8-zu-10-Wochen alten Mäusen muss im Voraus, wie oben beschrieben 1 durchgeführt werden, es sei denn, dass eine Titan-bar nicht in den Kopf des Tieres gelegt. Die chronische kranialen Fenster ist eine stabile Zubereitung ermöglicht Untersuchung der Pia Mikrozirkulation auch Monate nach der Implantation. In der Regel führen wir unsere Studien 2-3 Wochen nach der Schädelbasis Fenster Implantation. 2. Intravitalmikroskopie <ol><li> Zwei bis drei Wochen nach der Kraniotomie, Körpertemperatur überprüft wird und dann die Maus leicht mit Isofluran (4% für die Induktion, 1-2% für die Wartung). Leichte Betäubung wird verwendet, um Tier Stress und Unbehagen während der experimentellen Verfahren zu verhindern. </li><li> Die Tiere werden dann in Bauchlage auf einem stereotaktischen Rahmen und der Kopf sorgfältig gesichert mit Ohr Bars. Die Höhe wird mit Hilfe des rechten und linken Hebel. Kerntemperatur des Körpers aufrechterhalten wird mit einem Heizkissen. Da Mäuse mit zerebraler Malaria zu entwickeln Hypothermie, müssen die Temperatur-Einstellungen für jedes Tier angepasst werden. </li><li> Das Deckglas auf dem kranialen Fenster ist vorsichtig mit einem Wattestäbchen mit Mineralöl und ein Panorama-Bild der Schiffe unter dem Fenster ist mit Hilfe von einem Stereomikroskop und einer Digitalkamera (Nikon Coolpix 995, Japan) entnommen befeuchtet gereinigt. Das Bild gedruckt ist, identifiziert und datiert und wird als eine Karte für die Messung von Gefäßdurchmesser und der roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeiten eingesetzt werden. </li><li> Die Maus wird dann zu einer intravitalen Mikroskoptisch (customized Leica-McBain, San Diego, CA) übertragen. Ein Tropfen Wasser auf den kranialen Fenster unter Ausnutzung der auch durch die zahnärztliche Acryl gebildet wird platziert, wird der Fokus eingestellt. Die Messungen werden mit einem 20-fach (LUMPFL-WIR, numerische Apertur 0,6, Olympus) Wasserimmersionsobjektiv durchgeführt. Das gleiche Gefäße, so dass direkte Vergleiche zu ihren Ausgangswerten durchgeführt werden konnte und so für mehr robust Statistiken für kleine Stichprobe der Bevölkerung, gefolgt. Die Bilder werden mit einer digitalen schwachem Licht Hochgeschwindigkeitskamera (Hamamatsu C9300-221, Japan), oder zu wenig Licht analoge Kamera (COHU 4815, San Diego, CA) verbunden mit einem Videoband (JVC, Japan), Uhrzeit (Microimage Video Systems, Boyertown, PA) und einem Farbmonitor (PELCO, Clovis, CA). Das Band ist richtig, bevor die Aufnahme beginnt identifiziert, und die Zeitstempel ermöglicht die Identifizierung der Ereignisse durch die Dokumentation der Zeitrahmen, in dem diese Ereignisse wurden umkodiert. </li><li> Eine erste Überprüfung der Schiffe wird, um die Qualität der Vorbereitung zu bewerten und, wenn das Blut ist in allen Gefäßen fließt. Dann ist die Auswahl der Gefäße gemessen werden gemacht und es sollte Venolen und Arteriolen mit unterschiedlichen Durchmessern (in unserer Maus Pia Vorbereitungen, Reichweite die meisten Schiffe zwischen 20 und 80 um) gehören und decken verschiedene Standorte innerhalb des durch das Fenster ausgesetzt. Arteriolen und Venolen können einfach, indem Sie die Richtung des Blutflusses in die Verästelungen des Schiffes (ob es oder vertreibt sammelt Blut) unterschieden werden. In unseren Studien werden die Messungen in 12 Schiffen. Die genaue Lage der einzelnen Stelle zu messen ist, kommentierten in das Bild des Pia-Gefäße. </li><li> Für jeden Punkt, ist der Gefäßdurchmesser gemessen unter Verwendung eines Bildes Scher-Gerät (Bild Shear, Vista Electronics, San Diego, CA) 2. Sobald die Stelle ausgewählt wurde, wird das Bild des Schiffes in senkrechte Position ausgerichtet und das Bild wird geschert, bis der Gegensatz Extreme ausgerichtet sind und das Lesen wird dokumentiert. Dieser Wert kann in Mikrometer durch vorherige Kalibrierung für jede spezifische Vergrößerung mit einem Absehen Calibration Tischmikrometer (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ) übersetzt werden. </li><li> Jeder Spot wird während mindestens 30 Sekunden für Erythrozyten-Tracking aufgezeichnet. Für Tracking ist eine Blutprobe erhoben und Erythrozyten sind fluoreszierend mit markierten die Carbocyanin Farbstoff Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) und infundiert über die Schwanzvene einer in vivo-Konzentration von ~ 0,4-0,5% 3 zu erhalten. Bei Tieren mit Plasmodium berghei ANKA (PbA) Expression des grün fluoreszierenden Proteins (PBA-GFP, eine Spende der Malaria Forschung und Referenzreagens Resource Center MR4, Manassas, VA; von CJ Janse und AP Waters hinterlegt) infiziert, keine Infusion von markiertem Zelle notwendig ist. Die Videobilder werden bei 150 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Dieser Zinssatz soll auf 1-6 Bilder von einer Zelle auf einem Video-Frame für die Bestimmung der Geschwindigkeiten zu erhalten, um 8 mm / s. Die Videobilder werden mit einem Personal Computer mit Adobe Premier 4.0 Software digitalisiert und xy-Koordinatensystem für jede Zelle Bildes unter Verwendung SigmaScan Pro 4.0-Software (SPSS Chicago, IL) 4. Zell-Positionen sind manuell und nicht durch Bildanalyse ermittelt, da das Auge eines geschulten Beobachters gezeigt wurde, um eine gute Einschätzung der Lage der Mitte einer Zelle, die gebenh in der Regel entspricht der Position der maximalen Fluoreszenz für die meisten Zellen Orientierungen beobachtet. Mehrere Bestimmungen der Position und Geschwindigkeit sind für jede Zelle hergestellt und gemittelt, um meine RBC Geschwindigkeit zu erhalten. </li><li> Wenn RBC Geschwindigkeitsmessungen offline durchgeführt werden, wird die gesamte Beobachtungszeit für jede Maus nicht überschreiten 10-15 Minuten Minimierung der cardiodepressive Auswirkungen der Narkose. </li><li> Sobald Gefäßdurchmesser und RBC Geschwindigkeitsmessungen verfügbar sind, die Berechnung des Blutflusses in jedes Schiff kann mit der Formel vorgenommen werden: Q = V x π (D / 2) 2, wobei Q = Blutfluss, V = RBC Geschwindigkeit und D = Gefäßdurchmesser. </li><li> Diese Verfahren können im Laufe der Zeit wiederholt werden. Zum Beispiel, in dem Mausmodell der cerebralen Malaria führen wir tägliche Messungen, beginnend am Tag 4 der Infektion. Die erhaltenen Werte jeden Tag für jede Maus sind in Bezug auf Tag 0 (vor der Infektion), die als 100% normiert. </li><li> Neben Gefäßdurchmesser und Blutfluss Messungen können weitere Auswertungen vorgenommen, zum Beispiel eine verbesserte Beurteilung der Perfusion und der Analyse der Leukozyten-und / oder Thrombozyten-Rollen und die Einhaltung in Pia-Schiffe sein. Diese Messungen werden mit Hilfe der Fluoreszenz-markierten Marker durchgeführt. Im Fall von Malaria, können wir auch erkennen, Umluft-oder anhaftenden Parasiten durch den Einsatz der PBA-Stamm, GFP zum Ausdruck bringt. </li><li> Für Perfusion Beurteilung verwenden wir eine Lösung von FITC-markiertem Albumin (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), und Leukozytenadhärenz zu Pia Schiffe verwenden wir Antikörper gegen die pan-Leukozyten-Marker CD45 mit Texas Red (TxR) gekennzeichnet quantifizieren ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Dazu 25 &amp;mgr; l des Albumin-FITC (2mg/mL) und 20 &amp;mgr; l der anti-CD45-PE Antikörper (200μg/mL) werden gemischt und injiziert in den vorgewärmten Schwanzvene. Die Maus kann dann sofort abgebildet werden, wenn Leckmessungen dauert Albumin-FITC erlaubt wird, für 15 Minuten zirkulieren. Grüne Fluoreszenz (518nm) durch Albumin-FITC und GFP (PBA-GFP PRBC) emittiert wird gefangen genommen und mit ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), und anti-CD45-TxR Fluoreszenz (615nm) ist beendet und gefangen mit einem Vivid Standard: XF42. </li><li> Die Fluoreszenz-markierten Albumin ermöglicht eine verbesserte Visualisierung der Gefäßnetz, einschließlich eindringende Schiffe, und es ist besonders nützlich in Krankheiten wie zerebrale Malaria für nicht-durchblutete oder unter durchbluteten Gefäßen zu überprüfen. Es kann auch verwendet werden, um vaskuläre Leckage 5 messen werden. </li><li> Die Fluoreszenz-markierten anti-CD45 Antikörper machen es leicht zu identifizieren und zu quantifizieren, Leukozyten-Rolling und die Adhäsion an Pia Schiffe. Zur Vermeidung von Verzerrungen bei der Quantifizierung, quantifizieren wir rollen und Haftung in den gleichen Stellen vordefinierte, um den Blutfluss zu messen. Die Quantifizierung der Adhäsion von Leukozyten wird durch Zählen der Anzahl der Leukozyten in einem 100 um-Schiff Länge. Rollende wird durch Zählen der Anzahl der Leukozyten reisen mit einer Geschwindigkeit deutlich langsamer als Blutflussgeschwindigkeit in der gleichen Länge 100 um, während 30 Sekunden quantifiziert. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. (Schritt 2,6) Bilder von der Maus Pia Gefäßnetz zugänglich durch die kraniale Fenster. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. (Schritte von 3,1 bis 3,5) Schematische Darstellung des Aufbaus für die Intravitalmikroskopie der Maus Pia Mikrozirkulation. 1: Intravitalmikroskopie Mikroskop; 2: 20X Wasserimmersionsobjektiv; 3: Lichtquelle; 4a: digitale Low-Light-High-Speed-Kamera, 4b: Analog-Kamera, 5: Maus in der stereotaktischen Rahmen, 6: Computer-Monitor, 7: Analog Shearer Monitor zeigt, wie das Bild Scherung (Pfeil) getan wird, um Gefäßdurchmesser zu messen. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. (Step 3,6-3,8) Microvascular roten Blutkörperchen Geschwindigkeitsmessungen durch Zell-Tracking von High-Speed-Fluoreszenz-Videoaufnahmen. Bilder von A bis F sind Folge Bilder von einem Pia Schiff, zeigt ein einziges bewegliches RBC über den mikroskopischen Bereich begrenzt durch die Kamera. Manuelle Bestimmung von Frame für Frame-Positionen von 15 oder mehr Zellen über das Feld, mit seinen vorkalibrierten Distanz, ermöglicht die Berechnung der mittleren RBC Geschwindigkeit in jedes Schiff mit Hilfe einer Excel-Tabelle. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. (Schritt 3,9) Daten eines repräsentativen Experiments zeigt die Veränderungen in Pia Blutfluss im Laufe der Zeit in Plasmodium berghei ANKA (PbA) infizierten Mäusen (n = 5) und in infizierten Mäusen der Kontrollgruppe (n = 5). Während in den Kontroll-Mäusen Pia Blutfluss im Zeitverlauf relativ stabil, zeigen PBA-infizierten Mäusen eine deutliche Abnahme des Blutflusseszum Zeitpunkt der zerebralen Malaria Entwicklung (Tag 6). Daten sind der Mittelwert ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. (Schritt 4,3) Eine große Zahl von Leukozyten adhärent Pia Schiffe mit einer Maus mit Plasmodium berghei ANKA infiziert, wie durch Färbung mit anti-CD45-Texas Red fluoreszierenden Antikörpern offenbart.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

Die Intravitalmikroskopie hier beschriebene Methode bietet eine einzigartige und leistungsstarke Werkzeug für die detaillierte Beobachtung der Pia Mikrozirkulation in der Maus. Es ermöglicht Aussonderung einzelner Arteriolen und Venolen und Messung von Veränderungen einer Reihe von Parametern wie Gefäßdurchmesser, RBC Geschwindigkeiten, die Durchblutung, die Einhaltung und Rollen der Leukozyten, Thrombozyten und andere Blut-Elemente, vaskuläre Leckage-, Gewebe-pH und pO2 und möglicherweise viele andere Anwendungen. Die in vivo vaskuläre Reaktion kann unverzüglich nach Interventionen wie Drug Administration evaluiert werden, oder bei pathologischen Prozessen. Darüber hinaus kann die Mikrozirkulation Verhalten dynamisch folgen im Laufe der Zeit. Wir haben diese Technologie verwendet, um die pialen Mikrozirkulation Veränderungen während der cerebralen Malaria durch P. verursacht Studie berghei ANKA in der Maus, und haben gezeigt, dass die neurologische Syndrom in dieses Modell mit einem Mikrozirkulation Dysfunktion durch reduzierte Hirndurchblutung, Vasokonstriktion, beeinträchtigt Perfusion und schließlich Kreislaufkollaps 6 gekennzeichnet assoziiert ist.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

Dieses experimentelle Modell wurde entwickelt, um die Maus Pia Mikrozirkulation während der akuten und chronischen, physiologischen und pathophysiologischen hämodynamischen, Entzündungs-und Stoffwechselerkrankungen zu beurteilen, mit in vivo Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein geschlossener Schädel-Fenster wird über den linken parieto-okzipitalen Kortex der Maus platziert. Lokale Mikrozirkulation wird in Echtzeit durch das Fenster mit epi-und Fluoreszenz-Beleuchtung und Messungen von Schiffen Durchmessern und roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeiten durchgeführt werden aufgezeichnet. RBC Geschwindigkeit gemessen mit real-time Kreuzkorrelation und / oder Fluoreszenz-markierten Erythrozyten. Leukozyten und Thrombozyten Einhaltung pialen Gefäße und Beurteilung der Perfusion und vaskuläre Leckage mit Hilfe der Fluoreszenz-markierten Marker wie Albumin-FITC und anti-CD45-Antikörper TxR gemacht. Mikrozirkulation kann wiederholt werden, über mehrere Tage auf Video aufgezeichnet. Wir haben zum ersten Mal die Fenster schließen Gehirn Intravitalmikroskopie der Pia Mikrozirkulation auf dynamische Veränderungen im Laufe des Plasmodium berghei ANKA-Infektion in Mäusen zu folgen und zeigen, dass die Expression von CM mit mikrozirkulatorischen Störungen durch Vasokonstriktion charakterisiert verbunden ist, starke Abnahme im Blut-Studie flow und schließlich Kreislaufkollaps.

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.3K Aufrufe.  University of California, San Diego. Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Serie: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Extinction Training Während der Rückverfestigung Fenster Verhindert Recovery-of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Closed-loop Neuro-Roboter-Experimente zur Computational Eigenschaften Neuronale Netze Testen

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

Piezo-hohe Genauigkeit chirurgische Osteal Entfernung (PHASOR): Eine Technik für verbesserte kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...