Arbeit unterstützt durch Zuschüsse der NIH / NIDCD und der Schmitt-Stiftung zur RP.

Dieses Protokoll wurde entwickelt und basiert auf Standard-radioaktive und nicht-radioaktiven in-situ-Hybridisierung Methoden, die zuvor von uns und anderen entwickelt wurde, um ein oder zwei Transkript Arten in Hirngewebe 1-7 erkennen verfeinert. Die unten beschriebenen Protokoll hat eine Gesamtlänge von 2 oder 3 Tage, je nach der Anzahl der prozeduralen Unterbrechungen durch den Endbenutzer gewählt. Alle Schritte nachfolgend beschrieben werden, um bei Raumtemperatur durchgeführt werden, mit Ausnahme der Ribosonde Hybridisierung und post-Hybridisierung wäscht. Die Lösungen und Puffer für alle Schritte in diesem Verfahren Beteiligten erforderlich finden Sie am Ende dieses Protokoll gefunden werden. 1. Tissue Vorbereitung und Schnitte <ol><li> Enthaupten und extrahieren Thema Gehirn schnell ab, und legen Sie sie in eine Kunststoff-Formenbau von ausreichender Größe. </li><li> Cover Gehirn mit Tissue-Tek Einbettmedium und schnell statt der Kunststoff-Form in einem dry-ice/alcohol Bad für schnelles Einfrieren. Gefrorenes Gewebe kann bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Mit einem Kryostaten, sammeln 2 oder 3 Hirnschnitten pro Folie auf Rechnung Superfrost Plus Objektträger. Die Dicke der Abschnitte sollten 10-12 um betragen. Dias können bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Sephadex G50 Säulen für Probe Purification &quot;Sephadex-Säulen aus kommerziellen Quellen erworben werden kann, jedoch bieten wir Ihnen nachfolgend eine kostengünstige Alternative für die Erzeugung von Spalten, die für die Sonde Reinigung benötigt werden. <ol><li> Hydrate ausreichende Menge an Sephadex G50-Pulver mit RNase-freiem, DEPC-behandeltem Wasser (z. B. 2 g Pulver in 100 ml DEPC-behandeltem Wasser), Mix-Lösung kurz und bei Raumtemperatur lagern, um Niederschlag über Sephadex G50. </li><li> Überstand entfernen (obere Schicht des Wassers) nach Sephadex G50 Niederschlag. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang über 3 bis 5 mal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, wieder aussetzen Sephadex G50-Lösung in TE-Puffer (1:1), und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Legen Sie autoklaviert Glaswolle in eine sterile 1 ml-Spritze und komprimiert sie mit dem Stößel zu einer kompakten Schicht an der Unterseite machen, und dann legen Sie die Spritze in eine 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Gut mischen die Lösung von Sephadex G50 in TE. Füllen Sie die Spritze / Spalte mit dieser Lösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spalte für 30 sec bei 1000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Spalte ist fast vollständig mit Sephadex G50 Perlen gefüllt. </li><li> Apply 200 pl Säule Waschpuffer auf die Säule und zentrifugieren Sie für 2 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Durchfluss verwerfen. </li><li> Apply 200 pl Säule Blocking-Puffer in die Säule und spinnen sie für 2 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 4-5 mal in die Spalte Gleichgewicht zu bringen. Spalten können bei 4 ° C gelagert werden, bis zu verwenden, wenn mit Parafilm abgedichtet. </li></ol> 3. Beschriftung und Reinigung von Ribosonden Im Folgenden ausführlich die Erzeugung und Reinigung eines einzelnen Ribosonde. Für dFISH, wird die Vorbereitung der einzelnen Sonde beinhalten die gleiche Methode, außer dass einer der Sonden mit Digoxigenin (DIG)-markierten UTP, während die anderen werden mit Biotin-markierten UTP markiert. <ol><li> Bereiten Sie eine konzentrierte (&gt; 150 ng / ul) und gereinigtes linearisierten cDNA-Lösung von Interesse, um entweder (Kontrolle) oder antisense Ribosonden generieren. </li><li> In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen 0,5-1 pg gereinigte cDNA-Template, 2 ul 5X Sondenmarkierung Puffer, 1 ul 10x DIG (oder Biotin)-Labeling Mix, 0,5 ul RNasin und 1 ul der entsprechenden RNA-Polymerase und bringt die endgültige Volumen der Lösung auf 10 ul mit RNase-freiem (DEPC-behandelt) Wasser. </li><li> Inkubieren Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Add 1 ul tRNA (Lager 20 ug / ul) und 39 ul der Spalte Blocking-Puffer in der Lösung. </li><li> Bereiten Sie die Sephadex G50-Säule für die Sonde Reinigung. Zu diesem Zweck werden 50 ul Blocking-Puffer in die Säule und drehen Sie es für 10 sec bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 2-3 mal auf die Säule (also die vollen 50 ul auf die Säule sind nach Zyklus der Zentrifugation gewonnen) ausgleichen. </li><li> Übernehmen Sie die Sonde Lösung der Sephadex G50-Säule, Position ein neues Mikrozentrifugenröhrchen am unteren Rand der Säule, und drehen Sie es für 3 min bei 1000 rpm, um das gereinigte 50 ul Ribosonde Lösung zu erhalten. </li><li> Beurteilen Sie die Qualität und Ausbeute der markierten Ribosonde entweder mit einem Standard-Formaldehyd-Agarose-RNA-Gel oder ein Spektralphotometer. </li></ol> 4. Post-Fixierung, Acetylierung und Hybridisierung <ol><li> Entfernen Sie Ausschnitte aus dem -80 ° C Gefrierschrank und ermöglichen eine Raumtemperatur ins Gleichgewicht. Anschließend inkubieren Abschnitte in einem kalten, frisch zubereitete 3% Paraformaldehyd-Lösung für 5 min. </li><li> Kurz spülen Abschnitte in phosphate Kochsalzlösung (PBS) zweimal. </li><li> Entwässern Schnitte durch ein Standard-Alkohol-Reihe (70, 95 und 100%; je 2 min), und lassen Sie sie an der Luft trocknen. </li><li> Inkubieren Abschnitte in einer Acetylierung Lösung für 10 min. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal in 2X SSPE. </li><li> Entwässern Abschnitte noch einmal durch die Standard-Alkohol-Reihe oben beschrieben, und es ihnen an der Luft trocknen. </li><li> Bereiten Sie ein angemessenes Volumen der Hybridisierungslösung und fügen Sie beide Ribosonden die Lösung (Sonde Konzentration: 1 ng / ul für jede Sonde). Das Gesamtvolumen der Hybridisierungslösung wird auf der Grundlage der Anzahl der Abschnitte, um hybridisiert (16 ul Hybridisierungslösung pro Abschnitt) bestimmt. </li><li> Bewerben ausreichendes Volumen der Hybridisierungslösung, um Gewebe und Deckglas gleitet sicher, dass keine Luftblasen Overlay das Gewebe. </li><li> Die Objektträger in einem Metall Diahalter. Tauchen Halter in ein Mineral Ölbad bei 65 ° C über Nacht eingestellt. Stellen Sie sicher, dass Deckgläser sind nach oben gerichtet (dh der lateralen Seite des Diahalter sollten in Kontakt mit dem Boden des Mineralöl-Container werden). </li></ol> 5. Post-Hybridisierung Wäscht <ol><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie vorsichtig den Diahalter aus der Mineralöl-Bad und kurz ausspülen in Chloroform, um überschüssiges Öl von den Folien zu entfernen. </li><li> Die Objektträger in einem 2X SSPE-Lösung für 5-10 min. Deckgläser sollten von Dias, während in Lösung zu lösen. </li><li> Die Objektträger in eine neue 2X SSPE-Lösung, und halten Sie sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Transfer-Abschnitte in einer Lösung mit 2X SSPE plus 50% Formamid. Die Temperatur dieser Lösung sollte mit der Temperatur in der Nacht Hybridisierung Verfahren verwendet. Halten Sie Folien in dieser Lösung für 1,5 Stunden. </li><li> Transfer-Abschnitte, um eine 0,1 × SSPE-Lösung auf die gleiche Temperatur der Hybridisierung vorgewärmt. Inkubieren Abschnitte in dieser Lösung für 30 min. Wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 30 min. </li></ol> 6. Erkennung und Visualisierung von Ribosonden <ol><li> Transfer-Folien TNT-Puffer, dem 0,3% Wasserstoffperoxid wurde hinzugefügt, für 10 min. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal (10 Min.). </li><li> Mit einem DAKO Pen zeichnen ein gut in die Umgebung mit den Hirnschnitten. Wichtig ist, ist Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass Teile nicht trocken werden. </li><li> Apply 150 ul TNB-Puffer zu jedem Dia, und inkubieren Abschnitte in dieser Lösung für 30 min in einer feuchten Kammer. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges TNB Lösung durch Kippen Dias. </li><li> Apply 150 ul TNB Lösung mit Peroxidase-konjugierten anti-DIG-Antikörper, und speichern Sie gleitet in einer feuchten Kammer für 2 Stunden. Antikörper-Konzentration sollte individuell für jedes Transkript von Interesse vor der Durchführung dFISH bestimmt werden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Apply 150 ul Alexa 594-konjugierten Tyramid funktionierende Lösung zu jeder Folie, und speichern sie in einer feuchten Kammer für 1 Stunde. Diese Lösung muss nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet werden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> 30 min - inkubieren Abschnitte in TNT-Puffer, dem 0,3% Wasserstoffperoxid für 10 aufgenommen worden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Apply 150 ul TNB-Puffer pro Objektträger, und bewahren Sie sie in einer feuchten Kammer für 30 min. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges TNB Lösung durch Kippen Dias. </li><li> Add 150 ul TNB Lösung mit Peroxidase-konjugierten anti-Biotin-Antikörper, und speichern Sie gleitet in einer feuchten Kammer für 2 Stunden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Apply 150 pl einer Alexa 488-konjugierten Tyramid funktionierende Lösung, um die Folien und inkubieren Abschnitte für 1 Stunde. Diese Lösung sollte nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet werden. </li><li> Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten. </li><li> Add 150 ul Hoechst-Lösung (1:1000 in TNT-Puffer) zu den Abschnitten und halten sie in der feuchten Kammer für 2 min. </li><li> Waschen Sie die Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 5 min. </li><li> Deckglas Abschnitte mit einem Fluoreszenz-kompatible Mounting Medium (zB Vectashield oder verlängern Antifade). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Wir zeigen hier Vertreter dFISH Ergebnisse in der Zebrafinken Gehirn erhalten. Gezeigt werden Aufnahmen aus dem caudomedial nidopallium (NCM), der Singvogel Analogon des auditorischen Kortex von Säugetieren erhalten. Gehirn-Schnitte wurden mit einem biotinylierten Ribosonde gegen Parvalbumin (A), ein Marker für eine Subpopulation der hemmenden Neuronen gerichtet hybridisiert und einer DIG-markierten RiboSonde gegen die Aktivitäts-abhängigen Gen Zenk (B), ein zuverlässiger Marker für Song-driven Neuronen gerichtet. C) Überlagerung von (A) und (B) zeigt eine Bevölkerung von hemmenden Neuronen, die durch Hörerlebnis aktiviert werden. Pfeile und Pfeilspitzen zeigen Zellen ausschließlich mit jeder der beiden Ribosonden beschriftet und Sternchen zeigen repräsentative Neuronen co-exprimierenden beide Transkripte von Interesse. Balken = 25 um.

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	<li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+methods+and+applications.">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li><li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li><li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digoxigenin:anti-digoxigenin+(DIG)+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system.">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li><li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes:+facts+and+artifacts.">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li><li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization.">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li><li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds.">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li><li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+participate+in+the+brain's+response+to+birdsong+auditory+stimulation.">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li><li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds.">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li><li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression.">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol.">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li></ol>

Wir haben dieses Protokoll verwendet, um zu untersuchen, wie Gehirn der Wirbeltiere neurochemisch und funktional organisiert ist, und um festzustellen, wie verhaltensgestörte relevanten sensorischen Reizen Auswirkungen der genomischen Maschinerie der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn 8-10. Wir haben erfolgreich diese Methode in Hirngewebe von Mäusen, Ratten und Singvögel, aber erwarten, dass dieses Protokoll wird einfach an Hirnschnitten aus einem Array von Wirbeltierarten und, vielleicht, nicht-neuralen Geweben erhalten. Key steuert erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse und optimale Signalübertragung wurden ausgiebig von unserer Gruppe an anderer Stelle 11, 12 detailliert.

Lösungen <ol><li> Column Waschpuffer: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 ug / ul tRNA, 0,1% SDS in 50 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Column Blockierungspuffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 50 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> TNT-Puffer: 60 ml von 1 M Tris-HCl, 18 ml 5 M NaCl und 1,8 ml Triton X-100 in 600 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> TNB Puffer: 100 mM Tris-HCl, 8,3 ug / ul BSA, 0,15 M NaCl und 3% Triton X-100 in DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 plus 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Acetylierung Lösung: 2,7 ml Triethanolamin plus 0,5 ml Acetanhydrid in 200 ml DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Hybridisierungslösung: 50% Formamid, 2X SSPE, 2 ug / ul tRNA, 1 ug / ul BSA und 1 ug / ul poly A in DEPC-behandeltem Wasser. Es braucht 16 l pro Abschnitt. </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des Doppel-Fluoreszenz-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (dFISH)-Methode für Nachweis von zwei mRNAs von Interesse in Frischplasma Hirnschnitten optimiert. Unsere Gruppe hat erfolgreich dieser Ansatz verwendet, um Gen-Co-Regulierung zu studieren. Genauer gesagt, haben wir diese dFISH Methode verwendet, um die anatomische Organisation, neurochemischen Eigenschaften und die Auswirkungen der sinnlichen Erfahrung in zentralen sensorischen Schaltungen zu erkunden, um einzelne Zelle Auflösung. Dieses Protokoll wurde im Hirngewebe von Mäusen, Ratten und Singvögel validiert wird aber erwartet, dass sie leicht an andere Wirbeltierarten, sowie zu einer Reihe von nicht-neuronalen Gewebe. In diesem Film stellen wir eine detaillierte Demonstration der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens.

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dieses Protokoll umfasst eine nicht-radioaktive<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren, dass die gleichzeitige Identifizierung von zwei Transkript Spezies ermöglicht, bei einer einzigen Zelle Auflösung, in dünne Schnitte von Gehirn der Wirbeltiere.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

double-fluorescence-in-situ-hybridization-in-fresh-brain-sections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

16.0K Aufrufe.  University of Rochester. Dieses Protokoll umfasst eine nicht-radioaktive In-situ Hybridisierungsverfahren, dass die gleichzeitige Identifizierung von zwei Transkript Spezies ermöglicht, bei einer einzigen Zelle Auflösung, in dünne Schnitte von Gehirn der Wirbeltiere.

Serie: Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Konstruktion und Montage eines Ultra-light Motorisierte Microdrive für chronische Neural Recordings in Kleintiere

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% of the total stroke-related mortality with an important morbidity in terms of neurological outcome. A delayed cerebral vasospasm (CVS) may occur most often in association with a delayed cerebral ischemia. Different animal models of SAH are now being used including endovascular perforation and direct injection of blood into the cisterna magna or even the prechiasmatic cistern, each exhibiting distinct advantages and disadvantages. In this article, a standardized mouse model of SAH by double direct injection of determined volumes of autologous whole blood into the cisterna magna is presented. Briefly, mice were weighed and then anesthetized by isoflurane inhalation. Then, the animal was placed in a reclining position on a heated blanket maintaining a rectal temperature of 37 &#176;C and positioned in a stereotactic frame with a cervical bend of about 30&#176;. Once in place, the tip of an elongated glass micropipette filled with the homologous arterial blood taken from carotid artery of another mouse of the same age and gender (C57Bl/6J) was positioned at a right angle in contact with the atlanto-occipital membrane by means of a micromanipulator. Then 60 &#181;L of blood was injected in the cisterna magna followed by a 30&#176; downward tilt of the animal for 2 minutes. The second infusion of 30 &#181;L of blood into the cisterna magna was performed 24 h after the first one. The individual follow-up of each animal is carried out daily (careful evaluation of weight and well-being). This procedure allows a predictable and highly reproducible distribution of blood, likely accompanied by intracranial pressure elevation that can be mimicked by an equivalent injection of an artificial cerebral spinal fluid (CSF), and represents an acute to mild-model of SAH inducing low mortality.

We described in this protocol a standardized subarachnoid hemorrhage (SAH) mouse model by a double injection of autologous whole-blood into the cisterna magna. The high degree of standardization of the double-injection procedure represents a middle-to-acute model of SAH with relative safety regarding mortality.

Doppelte Direkteinspritzung von Blut in die Cisterna Magna als Modell der subarachnoiden Blutung

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...